专利名称：一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法，用作超声造影剂与 整合素α νβ 3受体结合超声显像来评估早期肝纤维化。
背景技术：
迄今，肝活检仍是评估肝纤维化的唯一 “金标准”。然而，肝活检是有创的， 可引起致命的并发症，因此不能被患者普遍接受，这造成了很大一部分慢性肝病患者在 诊断和治疗上的延误；同时，在无明显症状的患者中，很难重复进行肝活检，这就无法 准确地随访慢性肝病患者病情的变化；此外，样本取样误差和病理观察的不一致性都影 响了肝活检的准确性。因此，需要一种精确的无创伤性的方法来诊断和评估肝纤维化。 目前，肝纤维化无创伤性的评估方法有1纤维化血清标记物。器官特异性差，易受炎 症和机体代谢的干扰，标准化困难，组合指标更多反映炎症，对纤维化分期较困难；2 生化指标。需多项组合(如Fibrotest)。由于肝脏极强的储备功能，只在严重肝纤维化 时改变明显，并且生化指标影响因素多，解释困难，不同病因、不同时期的肝纤维化评 估的准确性不同；3常规影像。目前常规B超、CT、MRI难于反映肝纤维化早期改变， 评估多限于肝硬化及并发症；4发展中的影像技术。近年推出超声检测低频弹性波的瞬 时弹性记录仪(Fibroscan)和运用MRI弥散加权成像(DWI)、31磷波谱成像(31MRS)及 弹性成像变化等新技术，通过测量肝组织硬度和弹性来评估肝脏纤维化程度，优于其他 的无创的方法，具有一定的应用前景。然而，近来的研究发现也存在一定的局限性，如 腹壁脂肪的含量在很大程度上影响Fibroscan等对肝纤维化的检测准确性，并且这些方法 在对早期肝纤维化的诊断上也存在困难。综上所述，目前诊断和评估肝纤维化的方法都未能较好反映慢性肝损伤修复过 程中活化细胞表型和数量变化等分子病理改变，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面 存在不一致性，尚难达到临床对肝纤维化早期诊断和治疗效果实时动态评估的要求。不 能对肝纤维化做出正确评估一直以来是制约基础研究走向临床的“瓶颈”，也是不能开 发抗纤维化药物与临床试验的关键环节。

发明内容
本发明的目的是提供一种能提高超声显影的灵敏度的脂质体微泡及其制备方 法。为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有 链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲 和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体 相结合的靶向环肽。脂质体微泡中包裹氮气和全氟碳的混合物，起到超声显影作用。所述的肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体为至少一种在病理 状态下上调的受体，如整合素α νβ 3受体。
所述的靶向环肽为环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸)，即 C(RGDyK)，其可以特异性结合肝星状细胞，从而达到特异性肝纤维化诊断并提高诊断 灵敏度的目的。环肽中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是新生血管内皮细胞 多种整合素受体结合位点。其中，y代表右旋酪氨酸残基，K代表赖氨酸残基且不影响 与靶向受体结合。本发明还提供了上述靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法，其特征在于，具 体步骤为
第一步将摩尔比为1.1 1.3: 1的靶向环肽与生物素-聚乙二醇-N-羟基琥珀 酰亚胺酯共同溶解于pH=8的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-5小时，过滤，得到靶向环 肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制备型HPLC纯化，冷冻干燥得纯品；
第二步在冰上将第一步得到的靶向环肽-聚乙二醇-生物素纯品和带有链酶亲和 素的脂质体微泡分别溶解于生理盐水中，将上述两种生理盐水溶液混合，得到靶向环肽 修饰的脂质体微泡。所述的C(RGDyK)的制备方法如下利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以 0-(ΙΗ-苯并三唑-1-基)-Ν,Ν,Ν',Ν’-四甲基异脲六氟化磷和二异丙基乙胺为缩合剂，依 次在芴甲氧羰基-甘氨酸-二氯三苯甲基树脂上(Fmoc-Gly-2-CKTrt resin)接入侧链 保护的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、d_酪氨酸(y)和天冬氨酸(D)，经1%三氟乙 酸(TFA)切割后得到侧链保护的线状肽链D (otBu) -Y (tBu) -K (Boc) -R (Pbf) -G。再在 DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)进行环化而 得。本发明的原理如下
1.精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(arginine-glycine-asparagic acid, RGD)系列是整合素
结合配基的最常见识别位点。整合素α ν β 3能识别ECM中特异构象的RGD配体。人 工合成含RGD肽链高通量筛选发现，首尾环合的精氨酸-甘氨酸_天门冬氨酸-(右旋) 酪氨酸-赖氨酸(C(RGDyK))、精氨酸_甘氨酸_天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖 氨酸(RGDfK)等五肽分子也能和整合素α νβ 3受体特异结合，对五肽中赖氨酸侧链上 活性氨基进行小分子修饰并不会显著影响受体与配基结合活性。在我们的前期研究中，发现活化HSCs中整合素ανβ3表达明显上调， C(RGDyK)多肽在早期肝纤维化的诊断中可以做为一种潜在的示踪剂。这部分研究 结果已经发表 SCI 文章Biochemical characterization of the binding of cyclic RGDyK to hepatic stellate cells. Xiao-wei Huang, Ji-Yao Wang, et al. Biochemical Pharmacology. 2010, 80: 136-143. (IF=4.8,2008)
另外，我们也发现在硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)和胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)诱导的两种大鼠肝纤维化模型中，整合素α νβ 3和a_平滑肌肌动蛋白 (a-smooth muscle actin, α-SMA)表达在程度和部位上密切相关，它和肝纤维化的发展 趋势是一致的。并已经进行了 SPECT显像的初步体内研究。2.目前，国外已有不少通过以RGD环肽标记的对比剂对整合素α νβ 3受体表达 进行显像的分子影像学研究。主要工作集中在肿瘤新生血管、血管损伤重塑、破骨细胞 参与的骨重建等方面。虽然常规超声难以在早期诊断肝纤维化，但是超声微泡的应用极大地改善了声学图像，而且靶向超声微泡的应用可使超声影像拓展到分子影像领域，造 影定量分析软件可采集研究区域内的序列动态造影影像，分析其内各像素及造影剂气泡 回波的量的变化，从而可获得反映细胞功能变化的血流参数。国外曾应用此技术了解整 合素α νβ 3在实验性肿瘤血管新生时的表达及干预后改变。而在肝纤维化中，目前未见 相关的研究报道。本发明的优点是
1.分子成像技术的优点在于它能从空间和时间上对活体生物学过程进行量化，避免 抽样误差并弥补组织学分析不能提供功能信息的缺陷；另外，由于分子影像学手段可以 对同一动物的分子表达模式进行动态研究，所以可以大大减少对动物的需求并增加研究 结果的可信度。2.超声波成像技术在若干方面优于其他成像模式。例如，超声成像是瞬间和实 时的，而其他大多数成像程序的完成时间通常要以分钟计算。与核医学及CT技术不同， 超声成像无需使用电离辐射。尽管核磁共振成像技术(MRI)可提供与显微超声系统 (Vevo770)相似的空间分辨率，但对于呼吸或心跳引起的运动样本进行核磁共振成像是困 难和耗时的。最新的高频微超声波成像技术(VeVO770)可达到与核磁共振成像相接近的 空间分辨率，并能实现在同一平台上无创伤性地进行实时的解剖学，血流动力学及分子 数据采集和量化分析研究。微型超声波成像可运用在各种不同的物质上，而且对成像理 论与经验要求很低。3.超声成像造影剂应用了微气泡的散射特性。最常用的造影剂是被称为微气泡 (microbubbles)的气体压缩微粒。由于气/液临界界面的阻抗差较高，再加上固有的相
互作用，所以，超声造影剂易于造成比血液或者其他组织更大的超声波反向散射。包膜 气泡造影剂微粒对常规超声以及高频显微超声均适用。这些造影剂外壳很薄，壳内含有 少量生物相容气体。通过靶分子配体造影剂外壳的接合可容易的实现造影剂对分子靶标 的锁定。当前的技术允许多种潜在靶分子配体参与这种接合作用，包括单克隆的抗体， 多肽，糖蛋白，和核酸。微气泡作为一种超声造影剂，它的直径通常在0.5-5微米之间， 这正是一般条件下血管的空间。这使得对血管内部分子目标的检测成为可能，但是对细 胞内分子的成像还不能达到。微气泡可被超声波的高压脉冲击破。这种简单快速地将造 影剂气泡摧毁的过程使得将这些造影剂迅速地从血液里清除，以及对结合分子靶标的造 影剂与循环造影剂的辨别成为可能。与其他种类的影像设备相比，显微超声可实现在单 次成像过程中快速检测若干分子标志物的表达。4.本发明中，我们首先对c (RGDyK)进行PEG和Biotin修饰，然后把 Biotin-PEG-c (RGDyK)连接在带有strepavidin涂层外壳的脂质体微泡表面。这种延
伸的PEG链接不仅改善了超声微泡的药代动力学，延长了靶向微泡循环时间，同时也尽 可能减少了脂质体微泡对结合的c (RGDyK)的结合受体能力的空间位阻。


图1为靶向超声造影流程示意图2为纤维化大鼠肝脏靶向超声微泡增强造影代表性影像图； 图3为感兴趣区域(ROI)内的平均信号强度(MPA)与时间关系曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1 C(RGDyK)的合成
利用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法，以0-(ΙΗ-苯并三 唑-1-基)-Ν,Ν,Ν',Ν’-四甲基异脲六氟化磷(HBTU) / 二异丙基乙胺(DIEA)为缩合 剂，依次在芴甲氧羰基-甘氨酸_ 二氯三苯甲基树脂上(Fmoc-Gly-2-Cl-Trt resin)接入 侧链保护的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、d_酪氨酸(y)和天冬氨酸(D)，经1%三 氟乙酸(TFA)切割后得到侧链保护的线状肽链D (otBu)-Y (tBu)-K(B0C)-R(Pbf)-G。 再在DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)进行环 化而得。具体过程如下0.25g Fmoc-Gly-2-CKTrt resin (取代度lmmol/g)置于多肽合
成管中，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶胀后，20%哌啶DMF溶液脱去Fmoc保护基， 加入精氨酸反应液(2.2mmol 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸溶于4ml 0.5mol/L HBTU的DMF溶液与ImlDIEA中)，于室温振荡30分钟，反应结束后抽滤除 去反应液，并以DMF洗涤树脂。树脂再以20%哌啶DMF溶液脱去Fmoc保护基，以 同样的方法依次反应叔丁氧羰基-赖氨酸、叔丁基-酪氨酸和叔丁氧基-天冬氨酸，最 后一个氨基酸接入树脂并脱去Fmoc保护基后，树脂用二氯甲烷洗涤数次，然后加入2ml 1%TFA反应2分钟，抽滤收集滤液，重复处理10次，合并滤液。滤液旋转蒸发浓缩后， 加入蒸馏水析出沉淀，冷冻干燥得侧链保护的线状肽。所得的线性肽溶于DMF中，加入 1.1倍于多肽量的PyBop与DIEA于室温搅拌过夜，反应后加水析出沉淀，抽滤得沉淀。 所得沉淀用95%TFA反应脱侧链保护，加水稀释后，与制备型HPLC纯化(色谱柱C18 300A,洗脱方法5%乙腈含0.1%TFA水溶液至25%乙腈含0.1%TFA水溶液1小时梯度 洗脱)，冷冻干燥得c (RGDyK)。实施例2
(1) c (RGDyK) -PEG-Biotin 合成 将制得的0.012mol C(RGDyK)与O.Olmol生物素-聚乙二醇_N_羟基琥珀酰亚胺酯 (biotin-PEG-NHS)溶解于5ml磷酸盐缓冲液(pH=8)，于室温搅拌3小时，过滤，制 得C(RGDyK)-PEG-Biotin粗品，经制备HPLC纯化(色谱柱C18 300九洗脱方法 35%乙腈含0.1%TFA水溶液至55%乙腈含0.1%TFA水溶液1小时梯度洗脱)，冷冻干燥 得纯品。(2) Biotin-PEG-C(RGDyK)修饰的靶向超声微泡的制备
所用的带有链酶亲和素的脂质体微泡为加拿大Visualsonics公司生产的VS-11675 型号产品。首先用绿针头接上白盖注射器，注射500 μ 1生理盐水至造影剂瓶中，所述造 影剂瓶中装有上述带有链酶亲和素的脂质体微泡IO9个/ml，弃针管，留针头，平衡数秒 中后拔除针头。轻柔振荡10秒，室温静置5分钟。将20 μ g Biotin-PEG-c (RGDyK)用 生理盐水稀释至400 μ 1终体积，储存在Iml Ep管中。用带绿色针头的Iml注射器将多肽 转移至造影剂瓶中，终体积为900 μ 1。轻柔振荡15min，室温静置得到靶向微泡修饰的造影剂。将上述 Biotin-PEG-c (RGDyK)用同型对照多肽 c (RGAyK) -PEG-Biotin 替换，
同样方法制备同型对照造影剂。将灰色针头接上预充0.7ml生理盐水的绿盖注射器，用于注射后冲洗。用绿针 接上Iml注射器，抽吸大约100 150 μ 1同型对照造影剂，换灰色针头备用。同样的方 法抽吸100 150 μ 1靶向多肽造影剂，换灰色针头备用。上述操作均在冰上进行。应用例
使用实施例2得到的靶向微泡修饰的造影剂以及同型对照造影剂进行靶向超声微 泡造影如下
1、进入VisualSonics Vevo770 高分辨率小动物超声系统，设置参数:RMV 707B 30MHz, Power 50%, RF cycles 1, Frame rate 20, Sequence Destroy Position 30o/o。2、将大鼠麻醉，体温维持在37°C，仰卧固定，剔除腹部鼠毛，选择合适的体位 使肝脏影像在最大截面，行尾静脉插管。3、进行靶向超声微泡造影流程。4、将靶向微泡修饰的造影剂和同型对照造影剂通过大鼠尾静脉插管注入。注入 微泡的量为100-150 ul (5X IO7微泡&100 ul)，然后用20 ul的生理盐水冲洗。5、每一只大鼠都以随机的顺序接受一剂靶向微泡修饰的造影剂和一剂同型对照 造影剂，前后间隔20分钟。注射之后立即以10%的低能量确认微泡在肝脏中的存在，随 后停止采样4分钟。6、经过4分钟的积累期之后，图象采集以50%的能量重新开始。采集了大约 200帧图象之后，用中心频率为10 MHz的高能破坏脉冲破坏上升峰的微泡。在高能破坏 脉冲之后，图象采集立即以50%的能量重新开始，可以观察到循环中残留的微泡重新充 盈峰值。7、结果分析
黏附的微泡用破坏一减影影像程序获取。在应用破坏脉冲之前肝脏内的像素幅度来 源于组织、粘附微泡和循环中的非粘附微泡的声学反应。破坏脉冲消除了上升峰内的微 泡，在破坏脉冲之后的几秒钟内，像素幅度来源于组织和重新补充上升峰的循环中残留 的非粘附微泡。代表粘附微泡的像素的空间分布通过数字减影的方式获得，即从破坏脉 冲之前的图象中减去破坏脉冲之后的参考图象。参考图象由100帧“7秒)图象构成， 是在破坏脉冲应用之后立即采集的，并且预先以3X3的低通过滤去除噪音。参考图象一 张张地与类似的经过过滤的对比影像相比较，与参考图象相关性最好的图象被选出来， 这样做可以使减影之后的图象中残留的微泡信号最少。相关性最好的参考图象以数字减 影的方式从使用破坏脉冲之前和之后所采集的图象中去除，像素幅度的差异被编码成彩 色掩码覆盖在B超图象上。如图1所示，为靶向超声造影流程示意图。图2为纤维化大 鼠肝脏靶向超声微泡增强造影代表性影像图。图3为感兴趣区域(ROI)内的平均信号强 度(MPA)与时间关系曲线图。
权利要求
1.一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在 于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝 纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。
2.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的肝纤维化或 肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体为整合素。
3.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的整合素为整 合素ανβ30
4.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的靶向环肽为 带有精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸序列的环肽。
5.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的带有精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环肽为环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸)。
6.如权利要求5所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的环(精氨 酸_甘氨酸_天冬氨酸_酪氨酸_赖氨酸)的制备方法如下利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以0-(頂-苯并三唑-1-基)-风风"3’-四甲基 异脲六氟化磷和二异丙基乙胺为缩合剂，依次在芴甲氧羰基_甘氨酸_ 二氯三苯甲基树脂 上接入侧链保护的精氨酸、赖氨酸、d_酪氨酸和天冬氨酸，经三氟乙酸切割后得到侧链 保护的线状肽链；再在二异丙基乙胺的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-ι-基-氧基三吡咯 烷基磷进行环化而得。
7.权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法，其特征在于，具体步骤为第一步将摩尔比为1.1 1.3: 1的靶向环肽与生物素-聚乙二醇-N-羟基琥珀 酰亚胺酯共同溶解于pH=8的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-5小时，过滤，得到靶向环 肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制备型HPLC纯化，冷冻干燥得纯品；第二步在冰上将第一步得到的靶向环肽-聚乙二醇-生物素纯品和带有链酶亲和 素的脂质体微泡分别溶解于生理盐水中，将上述两种生理盐水溶液混合，得到靶向环肽 修饰的脂质体微泡。
全文摘要
本发明提供了一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法。所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。本发明还提供了上述靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法。将本发明的靶向环肽修饰的脂质体微泡应用于超声造影，具有较高的灵敏度。
文档编号A61K49/22GK102008736SQ20101058291
公开日2011年4月13日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者王吉耀, 谢操, 陆伟跃, 黄晓伟 申请人:复旦大学, 复旦大学附属中山医院