专利名称：具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核 苷酸及其应用。
背景技术：
上世纪八十年代日本学者发现卡介苗(BCG)中的DNA组分在人和动物体内具有抗 肿瘤活性，后来研究反义核酸治疗的科学家又发现人工合成的硫代寡聚脱氧核苷酸存在非 特异的免疫刺激活性。Krieg AM等在《Nature》1995，第374卷、第546-549页中揭示了这 些现象的本质，发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化5' -CpG-3' 二核苷 酸的六核苷酸序列，特征为5’ -PuPuCpGPyPy-3’ (Pu代表嘌呤A或G ;Py代表嘧啶C或T)， 如5’ -GACGTT-3’等。其中，核心核苷酸C和G为其活性所必需，两端各两个核苷酸也与其 活性紧密相关。上述六核苷酸特征序列称作CpG基元(CpG motif)，含有CpG基元的寡聚脱 氧核苷酸统称为CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)。含有上述特征的CpG-ODN对小鼠具有良 好的免疫刺激活性，动物实验结果显示了 CpG-ODN在疫苗佐剂、肿瘤预防和治疗、感染预防 和治疗以及过敏预防和治疗等领域具有良好的应用前景。但是进一步研究发现其免疫刺激 活性具有种属特异性，因此阐明活化人免疫细胞的CpG基元和CpG-ODN是将CpG-ODN应用 于人体临床的必要前提。Krieg AM等在《The Journal of Immunology 2000，第164卷、第 1617-1624页中报道了第一个能够活化人免疫细胞的CpG基元5’_GTCGTT_3’。由此衍生的 CpG-ODN(如CpG-ODN 2006)在体外对人免疫细胞具有良好的免疫刺激活性，而且目前多个 人体临床研究也证实了 CpG-ODN 2006在疫苗佐剂、肿瘤治疗以及感染治疗等领域的免疫 效果。根据Krieg AM等研究结果，上述CpG-ODN是人特异的，对小鼠没有活性，因此只能用 猴子等灵长类动物作为动物模型来评价这些序列在体内的免疫刺激活性，这增加了实验的 难度，例如成本增加、动物来源难于获得等。因此，发现一种非种属特异性的广谱CpG-ODN 是十分有必要的。对于有关CpG-ODN的研究在文献《中华微生物学和免疫学杂志》2001,21 (5)，第 471-475页、《动物医学进展》2004，25 (4)，第25-28页、《Gene Therapy)) 1996，第6卷，第 893-903 页中有所描述。另外，专利文献 CN 1271733A、CN 1526718A、US 2005/0267057A1 或TO 99/56755中也公开了一些CpG-ODN及其相关的应用，但是在上述文献中，均未公开有 关具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)的核苷酸，也未公开任 何有关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技术启示。

发明内容
本发明的目的在于提供一种非种属特异性的、具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。更具体地说，本发明提供了一种对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脱 氧核苷酸。本发明的目的还在于提供该具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫 苗佐剂以及在制备预防或治疗肿瘤、感染和过敏的药物中的应用。本发明人在现有技术的基础上进行研究，发现(1)活化人免疫细胞的CpG基元 为5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ) ； (2)活化小鼠免疫细胞 的CpG基元为5’ -NA/TCGTT-3’ (其中N代表A、G、C或Τ)。在此研究基础上，发现出含有 5，-NTCGTT-3，基元(包括 5，-ATCGTT-3，、5，-GTCGTT-3，、5，-CTCGTT-3，和 5，-TTCGTT-3，) 的CpG-ODN对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。发明人进一步研究表明，核苷酸序列中具 有两个或两个以上拷贝的5’ -NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)是本发明所述的硫代寡聚 脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的关键。鉴于此，本发明提供了一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸，其序列中 具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元，所述N不代表A或G，优选为T或C。所述 硫代寡聚脱氧核苷酸的长度为15 35个核苷酸，优选为20 30个核苷酸。所述CpG是 非甲基化的。当N为T时，所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5' -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’、5，-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5 ’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5，-TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、5，-TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5，-TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3，、5，-TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3，、
5，-TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’、5， -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’、5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3，、5， -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3，、5 ’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’、5， -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5， -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，、5' -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3‘或
5，-TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，。 当所述N为C时，所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为
4
5， -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，或5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3，。本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸的制备方法是本领域技术人员所熟知的，例如 可以采用固相亚磷酰胺三酯法化学合成，此法具有高效和快速偶联等优点，已广泛应用于 DNA化学合成领域中。目前对于寡聚脱氧核苷酸人工合成多委托专业的基因合成公司来处 理，例如国内可委托上海生工生物技术公司合成。固相亚磷酰胺三酯法由3’端开始，具体反应步骤如下1.脱保护基用三氯乙酸脱去连接在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸 的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；2.活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成 亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’端已被活化，但5’端仍受DMT保护)，此中间体与CPG上 已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；3.连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’ 羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基；4.氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷 酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸；5.封闭缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5’羟基在随后的循环 反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基。经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上。重复以上的脱 保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保 护基、纯化(常用的有PAGE法、HPLC法、C18法和OPC法等方法)、定量等合成后处理即可 得到符合本发明要求的硫代寡聚脱氧核苷酸。本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂中的应用。本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗感染的药物中的应用。本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗过敏的药物中的应用。所述硫代寡聚脱氧核苷酸在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好的免疫刺激活性， 可以从对小鼠中的免疫刺激活性结果来评价其在人体中的免疫刺激活性。作为疫苗佐剂， 其能够显著增强小鼠对基因工程乙肝疫苗的免疫应答，而且能够使免疫应答偏向TH1方向。 由于本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸能够诱生出很强的TH1类免疫应答，表明其也可用 于过敏和感染的预防和治疗。同时，本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内也具有 良好的抑制肿瘤生长的活性。


图1为示出具有5’-NTCGTPy_3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性的图。图2为示出具有5’-NA/TCGTT_3’(其中N代表A、G、C或Τ)基元的寡聚脱氧核苷 酸的小鼠免疫刺激活性的图。
图3a为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(Tl T6、C1和C2)以及对照序列1826的人 免疫刺激活性的图。图3b为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T7 T14)的人免疫刺激活性的图。图3c为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T15 T22)的人免疫刺激活性的图。图4a为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(Tl T6、Cl和C2)以及对照序列1826和 T7C的小鼠免疫刺激活性的图。图4b为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T7 T14)的小鼠免疫刺激活性的图。图4c为示出本发明寡聚脱氧核苷酸(T15 T22)的小鼠免疫刺激活性的图。图5为示出本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基因工程乙肝表面 抗原的免疫应答的图。图6为示出本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小鼠对基因工程乙 肝表面抗原的免疫应答的图。图7为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内诱生TH1类免疫应答的图。图8为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内抑制肿瘤生长的图。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本 发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要 不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1.具有5’ -NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或Τ)基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性为了阐明活化人免疫细胞的CpG基元，本发明人对CpG基元中除核心核苷酸CpG 以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。为此，发明人设计了一组CpG-ODN，如表1所示，每 条序列长度为12个核苷酸，均含有两个相同拷贝的CpG基元。用这些CpG-ODN刺激体外培 养的人外周血单个核细胞(PBMC)，通过测定培养上清中的IgM含量，即可评价它们对人免 疫细胞的活性。本实施例中所使用的CpG-ODN由本发明人设计，委托上海生工生物技术公司进行 人工合成，并进行全链硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，溶于生理盐水，-200C 冰箱中保存备用。表 权利要求
一种具有免疫刺激活性的全链硫代修饰的寡聚脱氧核苷酸，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’ NTCGTT 3’基元，且其长度为15～35个核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N为C。
2.如权利要求1所述的全链硫代修饰的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于所述全链硫代修 饰的寡聚脱氧核苷酸的长度为20 30个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的全链硫代修饰的寡聚脱氧核苷酸，其特征在于所述全链硫 代修饰的寡聚脱氧核苷酸的序列为5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 或5，-TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3'。
4.一种药物组合物，其特征在于由权利要求1 3任意一项所述的全链硫代修饰的寡 聚脱氧核苷酸和药学上可接受的载体制成。
5.权利要求1 3任意一项所述的全链硫代修饰的寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂中 的应用。
6.权利要求1 3任意一项所述的全链硫代修饰的寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗 肿瘤、感染、过敏的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元，且其长度为15～35个核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N不代表A或G。该硫代寡聚脱氧核苷酸在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好的免疫刺激活性，可以从对小鼠中的免疫刺激活性结果来评价其在人体中的免疫刺激活性。作为疫苗佐剂，其能够显著增强小鼠对基因工程乙肝疫苗的免疫应答，而且能够使免疫应答偏向TH1方向，表明可用于过敏和感染的预防和治疗。同时，本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内也具有良好的抑制肿瘤生长的活性。
文档编号A61K31/7125GK101979566SQ20101052700
公开日2011年2月23日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者许洪林 申请人:许洪林