专利名称：盆底补片复合生物材料的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及材料领域，特别涉及盆底补片复合生物材料的制备方法，还涉及由该方法制得的产品。
背景技术：
女性盆腔脏器脱垂是一种常见病，国内发病率约为40%并且逐年增加，已成为严重影响中老年妇女健康和生活质量的主要妇科问题。临床目前广泛使用的聚丙烯合成材料作为妇科盆底补片，该补片虽然疗效确切，但具有顺应性差、组织侵蚀性强、感染率高等缺点，并易导致性交痛等相关并发症。经研究表明猪脱细胞膀胱基质材料具有较好的生物相 容性和一定的抗菌性，是一种理想的妇科盆底补片。但是猪脱细胞膀胱基质材料在体内降解较快，不能满足盆底补片的力学要求。利用夹心法制作的脱细胞膀胱基质/聚丙烯/脱细胞膀胱基质复合生物材料，将聚丙烯材料夹在两层脱细胞膀胱基质材料中间，可以降低由聚丙烯材料引起的炎症反应，同时还可以增加脱细胞膀胱基质材料的力学特性。脱细胞膀胱基质/聚丙烯/脱细胞膀胱基质复合生物材料与单纯聚丙烯材料相比，炎症反应虽有所降低，但复合材料体积相对较大，脱细胞膀胱基质与聚丙烯材料结合不紧密，不利于操作和临床使用。目前，利用交联剂制备有机/无机复合生物材料虽在一定程度上能综合二者之长，但交联剂难以完全清除，残余物在一定程度上会影响复合生物材料的生物学性能并引起一系列的临床副作用。因此，急需一种盆底补片复合生物材料的制备方法，该方法不使用化学交联剂，制得的复合生物材料具有聚丙烯材料相似的力学特性，同时能降低聚丙烯材料引起的炎症反应，还具有体积小，利于使用的优点。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供盆底补片复合生物材料的制备方法，其制备方法简单，不使用化学交联剂。为实现上述发明目的，技术方案为
盆底补片复合生物材料的制备方法，将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在压强至少为IOOMPa条件下处理至少5分钟，得盆底补片复合生物材料；
所述脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中，经灭酶、离心、超滤、透析所得。
本发明中的脱细胞基质是指异体组织经细胞灭活处理后，制备成无活体细胞存在的细胞外基质成分和结构，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡糖糖、结构蛋白等。因其无抗原性，以及良好的生物相容性，成为组织工程支架材料的选择之一。本发明中使用的脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中制得，醋酸溶液可以为任意浓度，为了便于下一步操作，最优为溶解在质量分数为O. 5%的醋酸溶液中。本发明中脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料可以按任意比例混合，以脱细胞基质凝胶浸没聚丙烯材料为宜，优选为将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料按质量比为1-10:1混合，在压强至少为100-200MPa条件下处理5_15分钟。优选的，所述脱细胞基质的制备方法具体为，将脱细胞基质按Ig脱细胞基质加IOOmL质量分数为O. 5%醋酸溶液；在温度为4°C条件下用NaOH将pH调至7-7. 4灭活酶，然后在温度为4°C、转速为SOOOrpm条件下，离心15分钟，收集沉淀；再将收集的沉淀以10 12 mg/ mL溶解在质量分数为O. 5%的醋酸中,用孔径为O .45 μ m的滤膜过滤,然后在4°C条件下用浓度为O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小时，得脱细胞基质凝胶。
本发明中脱细胞基质可以按照现有技术中公开的制备方法制备，也可以按照本发明公开的方法制备，优选为，所述脱细胞基质的制备方法，具体步骤如下取动物组织，清洗干净；剪成块，用水冲洗后进行消毒，然后进行脱脂，再浸入醋酸溶液中溶胀，最后进行匀浆，得匀浆液；将所得匀浆液用胃蛋白酶酶解；然后用氯化钠盐析，经离心后收集沉淀，得脱细胞基质。更优选的，所述消毒是用质量分数为O. 1%的新洁尔灭，消毒至少15分钟；
所述脱脂为将动物组织浸入脱脂液中，在温度为4°C，搅拌至少16小时；所述脱脂液是乙醇异丙醇水体积比为7 4 89的混合物；
所述溶胀是加入相当于动物组织1-10倍的醋酸溶液，在温度为4°C条件下，浸泡24小
时；
所述酶解是加入相当于匀浆液体积10倍的醋酸溶液和相当于匀浆液重量1%的胃蛋白酶，在温度为4°C条件下，处理48小时；
所述盐析中氯化钠的终浓度为2mol/L，盐析时间为2小时。更优选的，所述醋酸溶液是质量分数为O. 5%的醋酸水溶液。优选的，所述动物组织为猪去粘膜层膀胱或猪去皮下组织皮肤。本发明目的之二在于提供由上述制备方法制得的盆底补片复合生物材料，其炎症反应小，组织相容性好。为实现上述技术目的，技术方案为
所述方法制备的盆底补片复合生物材料。本发明有益效果在于本发明公开了盆底补片复合生物材料的制备方法，其制备方法简单，采用物理方法，利用高压使脱细胞基质凝胶和聚丙烯材料牢固的交联在一起，不需要使用化学交联剂，因此无化学试剂残留，同时交联后能够结合脱细胞基质凝胶和聚丙烯的性质，使制得的盆底补片复合生物材即具有聚丙烯材料的力学性质，又与组织的相容性好，使用后无炎症反应；可以用于治疗盆腔脏器脱垂，治疗效果好，无副作用。
具体实施例方式以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例I
盆底补片复合生物材料的制备方法，具体包括以下步骤
A.制备脱细胞基质凝胶
取猪的新鲜膀胱，用自来水清洗干净，然后去表面粘膜层，得猪去粘膜层膀胱；
将所得猪去粘膜层膀胱用剪刀剪成小块，用纯水冲洗3遍，然后用消毒液浸泡15分钟进行消毒，其中消毒液为质量分数为O. 1%新洁尔灭；
将消毒的膀胱组织浸入脱脂液中，置于温度为4°c条件下，磁力搅拌16小时进行脱脂，得脱脂膀胱组织；其中脱脂液为乙醇异丙醇水按7 4 89混合(体积比)；
将所得脱脂膀胱组织用超纯水反复清洗5次，用相当于猪去粘膜层膀胱重量I倍的质量分数为O. 5%醋酸溶液溶胀脱脂膀胱组织，在温度为4°C条件下，浸泡24小时，得溶胀膀胱组织；
将所得溶胀膀胱组织用匀浆机匀浆，得匀浆液；
将所得匀浆液加入相当于猪去粘膜层膀胱重量10倍的质量分数为O. 5%的醋酸溶液和相当于猪去粘膜层膀胱重量1%的胃蛋白酶，在温度为4°C条件下，酶解48小时，得酶解液；将所得酶解液过滤，收集滤液，向滤液中加入氯化钠至氯化钠终浓度为2mol/L，盐析2小时；将盐析液，在温度为4°C、转速为8000rpm条件下，离心15分钟，收集沉淀，得脱细胞
基质;
最后将所得脱细胞基质按Ig脱细胞基质加IOOmL质量分数为O. 5%醋酸溶液；在温度为4°C条件下用NaOH将pH调至7. 4灭活酶，然后在温度为4°C、转速为SOOOrpm条件下，离心15分钟，收集沉淀；再将收集的沉淀以10 mg/ mL再溶解在O. 5%的醋酸中，用孔径为O.45 μ m的滤膜过滤，然后在4°C条件下用浓度为O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小时，最后得脱细胞基质凝胶。B.制备复合生物材料
取聚丙烯材料和步骤A所得脱细胞基质凝胶按重量比为1:1加入铝箔袋内，排除空气进行密封；在压强为100 MPa条件下处理15分钟；处理的铝膜袋在超净台内，用无菌生理盐水洗脱3次，去除未交联的材料，干燥，得盆底补片复合生物材料；其中100 MPa压强由HPP. L3-600/0. 6超高压设备提供(天津市华泰森淼生物工程技术有限公司)。
盆底补片复合生物材料体内植入评价
选取雌性大鼠20只，平均分成两组，分别将聚丙烯材料和制得的盆底补片复合生物材料分别植入大鼠阴道粘膜下层。植入后1、2、3、4周，观察小鼠阴道局部反应，并分别取材料和周围组织进行免疫组化染色，染色指标分别为，染色指标分别为免疫因子CD4、免疫因子⑶8、趋化因子受体CCR4和CXC趋化因子受体3CXCR3，结果如表I所示。表I.免疫组化染色结果
权利要求
1.盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在压强至少为IOOMPa条件下处理至少5分钟，得盆底补片复合生物材料； 所述脱细胞基质凝胶是将脱细胞基质溶于醋酸溶液中，经灭酶、离心、超滤、透析所得。
2.根据权利要求I所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料按重量比为1-10:1混合，在压强为100-200MPa条件下处理5-15分钟。
3.根据权利要求I或2所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于所述脱细胞基质凝胶的制备方法，具体为，将脱细胞基质按Ig脱细胞基质加IOOmL质量分数为O.5%醋酸溶液；在温度为4°C条件下将pH调至7-7. 4灭活酶，然后离心，收集沉淀；再将收集的沉淀以10 12 mg/ mL溶解在质量分数为O. 5%的醋酸中，用孔径为O . 45 μ m的滤膜过滤，然后在4°C条件下用浓度为O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小时，得脱细胞基质凝胶。
4.根据权利要求3所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于所述脱细胞基质的制备方法，具体步骤如下 取动物组织，剪成块，用水冲洗后进行消毒，然后进行脱脂，再浸入醋酸溶液中溶胀，最后进行匀浆，得匀浆液；将所得匀浆液用胃蛋白酶酶解；然后用氯化钠盐析，经离心后收集沉淀，得脱细胞基质。
5.根据权利要求4所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于所述消毒是用质量分数为O. 1%的新洁尔灭，消毒至少15分钟； 所述脱脂为将动物组织浸入脱脂液中，在温度为4°C，搅拌至少16小时；所述脱脂液是乙醇异丙醇水体积比为7 4 89的混合物； 所述溶胀是加入相当于动物组织1-10倍重量的醋酸溶液，在温度为4°C条件下，浸泡24小时； 所述酶解是加入相当于匀浆液体积10倍的醋酸溶液和相当于匀浆液重量1%的胃蛋白酶，在温度为4°C条件下，处理48小时； 所述盐析中氯化钠的终浓度为2mol/L，盐析时间为2小时。
6.根据权利要求5所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于所述醋酸溶液是质量分数为O. 5%的醋酸溶液。
7.根据权利要求4-6任一项所述盆底补片复合生物材料的制备方法，其特征在于所述动物组织为猪去粘膜层膀胱或猪去皮下组织皮肤。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的盆底补片复合生物材料。
全文摘要
本发明公开了盆底补片复合生物材料的制备方法，具体为，将脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料在压强至少为100MPa条件下处理至少5分钟；其制备方法简单，使脱细胞基质凝胶与聚丙烯材料结合牢固，交联过程中未使用化学交联剂，无化学物质残留；还公开由该方法制得的盆底补片复合生物材料及其应用，经动物实验验证，具有组织相容性好，无炎症反应的优点，能够用于治疗盆腔脏器脱垂。
文档编号A61L27/16GK102631708SQ201210153430
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者刘禄斌, 张晓春, 葛良鹏, 黄萍 申请人:重庆市妇幼保健院, 重庆市畜牧科学院