专利名称：一种具有粘接性能的人工骨材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人工骨材料及其制备方法。
背景技术：
高能量损伤导致的粉碎骨折越来越多见，这在一定程度上给临床医生的治疗带了困难。特别是近关节的粉碎骨折，较小的碎骨片很难固定，如果去除过多势必导致骨缺损， 影响骨折的愈合；如果按解剖位置放回又难以维持骨片的稳定性，影响关节面的对合，造成后期创伤性骨关节炎的发生。虽然目前对于粉碎骨折块的治疗可以通过螺钉、钢针、钢丝、 丝线等进行固定，或仅保持骨折的力线位置让其自行愈合，但如果粉碎骨折块之间间隙较大或对和不良，将会明显影响骨折的愈合时间及骨折的再塑型时间。采用医用粘合剂对骨碎块进行粘合复位是目前较有前途的一种治疗方法。然而， 目前普遍使用的医用粘合剂或多或少都存在一些缺陷。如粘度和聚合速度难以控制，韧性差及耐水性差，凝固后柔软性差。在骨组织粘接中，如骨折缝较大，胶体涂抹过多，由于降解缓慢会起到板障作用，影响骨折的愈合。分解时会产生有毒的甲醛；纤维蛋白类胶粘剂的粘接强度较低，又是血液制剂，不容易被病人所接受；传统的骨科粘合剂-聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，粘合强度较高，但在粘合过程中会产生有毒的单体，且在骨间容易形成较厚的阻隔影响骨折愈合。即使是近年来发展的磷酸钙、磷酸镁骨水泥，在改善骨愈合性能上有了很大提高，尤其是在骨缺损填充性能上表现优异，但其粘合强度仍不理想。因此，研制具有生物活性、可控生物降解的人工骨材料，既具有骨缺损填充性能， 又具有较好粘接性能，成为医用生物型骨粘合剂研究开发的主要目标。随着骨组织工程学的发展，针对临床不同需求进行不同类型组织工程骨的构建已成为当今研究的趋势。羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是天然骨的主要无机成分，在骨质中大约占60wt%，其基本单元是针状磷灰石晶体。HA具有良好的生物活性和生物相容性，大量研究表明HA具有较强的骨传导和骨诱导性，能与骨组织较好的结合，是一种性能非常优良的骨修复材料。20世纪50年代以来，科学家对人工合成的HA进行了深入的研究， 合成出了纯度很高的HA单晶。但是易碎、强度差、韧性差的缺点制约了 HA的临床应用。纳米羟基磷灰石(n-HA)复合材料是指纳米尺寸的HA与其他材料复合而成的新型材料。由于在结构上与天然骨更为接近，n-HA复合材料比相应的微米复合材料具有更好的生物学性能；同时优化材料的组成、结构和工艺将可能得到力学性能与天然骨更为匹配的骨修复材料。目前研究的n-HA复合材料可分为两类非降解的和可降解的。在与n-HA复合的材料中可降解聚合物壳聚糖目前成为国内外研究的热点。壳聚糖(Chit0San，CQ是一种从海洋生物虾蟹外壳中提取的天然多糖类物质，在体内可被吸收和利用，无免疫原性，与组织和细胞有很好的相容性。它的分子结构和软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似，对软骨细胞有较好的吸附作用，促进细胞在材料上的增殖与分化；促进成骨细胞增值并持续表达I型胶原纤维。目前大量的研究证实纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合人工骨是一种性能非常优良的骨修复材料。而海藻酸钠(sodium alginate, SAL)是从天然海藻中提取的一种分子胶体，由于生物相容性好，且有较好的粘合性，已在组织工程中得到了广泛的应用。上述研究表明，羟基磷灰石、壳聚糖、海藻酸钠具有良好的生物活性，适合作为生物活性材料。但如何将它们制备成既具有骨缺损填充性能，又具有较好粘接性能的人工骨材料，尚缺乏这方面的报道。

发明内容
本发明一方面提供了一种具有粘接性能的人工骨材料，该人工骨材料由其固相组分和液相组分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制备而成，所述的固相组分包含羟基磷灰石、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠，其中，羟基磷灰石 羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相组分为柠檬酸衍生物的二甲基亚砜溶液，所述柠檬酸衍生物的浓度范围为 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的柠檬酸衍生物为柠檬酸与N-羟基琥珀亚胺发生反应获得的酯化产物。在本发明的一个具体实施方式
中，所述的固相组分中，羟基磷灰石羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)优选70 25 5 60 30 10。更优选的，65 28 7。在本发明的一个具体实施方式
中，该人工骨材料的固相组分和液相组分比例优选1. 6 1 2. 5 l(g/ml)。更优选的 2 1。在本发明的一个具体实施方式
中，所述柠檬酸衍生物的浓度范围优选3mmoL/L 6mmoL/L。更优选的，4mmoL/L。本发明另一方面提供了上述人工骨材料的制备方法，其包括步骤固相组分的制备1)分别配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的水溶液，配制的这四种水溶液中Ca(NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)= 60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)将羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合搅拌均勻后，再加入Ca (NO3) 2溶液混合搅拌均勻；3)在温度为35°C 55°C的条件下，搅拌步骤(2)获得的混合溶液的同时加入 (NH4)2HPO4溶液，搅拌速度为15 30转/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度为0. 4-0. 6mol/ min(以每分钟添加的(NH4)2HPO4的摩尔数计)，pH值控制在8. 8 10. 3，搅拌12小时以上；4)陈化、过滤，取固相；液相组分的制备 1)将柠檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1- (3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亚胺的存在下，加入N-羟基琥珀亚胺进行酯化反应获得所述的柠檬酸衍生物；2)再制备浓度范围为ImmoL/L lOmmoL/L柠檬酸衍生物的二甲基亚砜溶液；将上述制得的固相组分与液相组分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即获得所述的骨粘合剂。在本发明的一个具体实施方式
中，所述固相组分制备的步骤4)中，将过滤取得的固相洗涤后，置于醇溶剂中超声分散，再搅拌至少12小时后，再次过滤后取固相。
本发明的人工骨材料，既是具有骨缺损填充性能的骨材料，又是具有较好粘接性能的骨粘合剂，同时也具有生物活性，可控生物降解性。具体的医用效果方面，本发明的人工骨材料既能将粉碎的骨折块粘接达到解剖复位，又能在骨折块间隙及骨缺损处起到有效地填充作用，既保持正常骨的形态、保持了骨片的稳定，又不影响骨折的愈合。
具体实施例方式实施例1固相组分制备1)按照羟基磷灰石的化学摩尔计量比Ca/P = 1. 67分别配制12ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和IOml的0. 05g/ml的(NH4)2ΗΡ04溶液备用；制备2%羧甲基壳聚糖的水溶液 IOml ；制备2%海藻酸钠的水溶液5ml ；2)然后将海藻酸钠溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合连续搅拌证使其完全混合均勻；再将Ca(NO3)2溶液加入到混合液中混勻；3)在40°C下剧烈搅拌(搅拌速度为20转/min)混合液同时将(NH4)2HPO4溶液逐渐滴入，滴加速度^il/min，该过程pH值维持在9 10左右，搅拌M小时后；4)所得浆料于室温下陈化一天，将沉淀过滤、洗涤沉淀；为防止团聚可以再将沉淀物在乙醇中超声分散，并搅拌12小时，再次过滤后于80°C真空烘干，并研磨成粉，玻璃瓶密封。液相组分制备将3g柠檬酸加入到15ml 二甲基甲酰胺(DMF)中，在1_(3_ 二甲基氨丙基)-3-碳化二亚胺(EDC)(浓度0. 015% )存在下和N-羟基琥珀亚胺(HOSu)(浓度 0. 4% )反应制得柠檬酸衍生物(CAD)。再将柠檬酸衍生物加入到二甲基亚砜(DMSO)溶液， 使CAD浓度为4mmoL/L，玻璃瓶密封备用。人工骨材料的浆体制备按照固相组分液相组分=1.0 0.5(g ml)，用药匙搅拌1 2min，形成均勻的浆状物即获得实施例1的人工骨材料浆体。实施例2固相组分制备1)按照羟基磷灰石的化学摩尔计量比Ca/P = 1. 67分别配制6ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和6ml的0. 05g/ml的(NH4)2HPO4溶液备用；制备2%羧甲基壳聚糖的水溶液 35ml ；制备2%海藻酸钠的水溶液20ml ；步骤2)-4)同实施例1。液相组分的制备同实施例1。人工骨材料的浆体制备按照固相组分液相组分=1.2 0.5(g ml)，用药匙搅拌1 2min，形成均勻的浆状物即获得实施例1的人工骨材料浆体。 人工骨材料性能技术指标测定如下1)ρΗ 值测定分别取实施例1、2获得人工骨材料的固相组分1. 0g，加入5ml去离子水，再加入 0. 5ml 液相组分，pH 电子测试仪测量 lmin、5min、10min、20min、30min、lh、2h、10h、24h 的 pH值。
结果固化过程中pH值为6. 9 7. 7，符合国际通用标准。2)固化时间参照ISO 3107中关于磷酸锌水泥的测试方法，在37°C、100%湿度环境中进行测试实施例1、2获得人工骨材料的浆体。测试5个样本，取平均值。结果固化时间为12 18min，能满足临床操作要求。3)抗压强度测定将实施例1、2获得的人工骨材料的浆体制成8mmX 12mm的圆柱体，在37°C、100% 湿度环境中进行固化，24h后取出样本，生物力学实验机上测试样本抗压缩强度。测试5个样本，取平均值。结果抗压强度为4. 5士2. 1MP，与人松质骨的强度相当。4)抗拉强度测定取新鲜猪股骨头部松质骨标本48对，制备Icm2骨折断面，随机分成6组，每组8 对。脉冲枪冲洗骨折断面骨屑，将实施例1、2获得的人工骨材料的浆体调和成糊状，粘接骨断面后用骨折固定钳固定，分别于室温25°C和37°C、100%湿度下(模拟体内环境)固化30min、a!、24h后，于加载速度为lOmm/min条件下，生物力学实验机上测量股骨头抗拉强度。结果猪股骨头粘接体于室温25 °C和371、100(%湿度下固化301^11，其抗拉强度分别 77. 21 士 7. 3N/cm2 和 79. 47 士 8. 6N/cm2 ；固化 2h 分别为 96. 38 士 10. 15N/cm2 和 103. 22士 12. 06N/cm2 ；固化 24h 后分别为 112. 46士 14. 43N/cm2 和 117. 16士 18. 54N/cm2。固化相同时间后不同室温条件下抗拉强度差异无统计学意义(P > 0. 05)。不同室温条件下固化30min和池其平均抗拉强度分别达固化24h最大抗拉强度的72%和94%。5)抗稀散性观察实施例1、2获得的人工骨材料的浆体迅速灌入2. 5ml医用注射器，于混合后60s 注入蒸馏水中，静置Mh，观察抗稀散情况。结果获得的人工骨材料固化物仍保持完整，无溃散现象。6)扫描电镜(SEM)观察取实施例1、2获得的人工骨材料的固化产物，真空干燥后浸入液氮中冷冻，低温下制造断裂面，再次干燥后表面喷金，电镜下直接观察孔形态、结构、孔径和孔的贯通性。结果固化产物呈多孔结构，孔径为100 300um，大多数孔径为100 150um。各个孔径之间还有小孔贯通，材料孔内无HA晶体聚集，孔壁上有大量细小的HA晶体，分布相对比较均勻，材料具有很高的孔隙率，有利于细胞的生长。综上所述，实施例1、2获得的人工骨材料，其基本性能完全达到了目前对于人工骨材料(医用粘合剂、骨水泥等)的医用要求标准。人工骨材料浆体的应用例1取健康成年新西兰大白兔72只，体重2 2. 5kg,雌雄不限，随机分为6组，每组 12只，每组随机选择6只作为实验组，另6只作为对照组。动物腹腔内注射2. 5%戊巴比妥钠Omg/kg)，麻醉满意后，常规消毒铺巾，经胫前入路，逐层切开皮肤、皮下组织和深筋膜， 显露胫骨中段，剥离骨膜后，常规方法锯断胫骨制作胫骨中段横断骨折模型，实验组拭干骨折断端血迹后用实施例1的人工骨材料浆体粘接骨折断端并将骨折块间的缝隙及缺损的部位填充抹平，加压并维持10 15min，以使浆体充分固化。对照组单纯用2. 5mm克氏针髓腔内固定。冲洗伤口后逐层缝合切口，术后正常饲养，每日肌肉注射青霉素40万U。术后 2、4、6、8、10、12周分批分组处死动物。术后大体观察骨折愈合情况良好。组织切片观察骨细胞正常长入骨折线，10周的组织骨折线已不清晰，证明骨细胞完全长入与正常骨组织切片一致，达到了与克氏针髓腔内固定同样的效果。人工骨材料浆体的应用例2成年健康新西兰大白兔M只，雌雄各半，体重310 3Mkg。于兔耳缘静脉注入 3%戊巴比妥钠静脉麻醉，侧卧位固定，后肢驱血后上止血带。无菌操作下，于两侧胫骨内髁处作皮肤切口，逐层切开，暴露胫骨内髁。在胫骨平台下约0. 5cm处与平台成45，制备双侧胫骨平台骨折模型。随机选取一侧为实验侧，冲净骨屑，人工骨材料浆体填入骨折断端，巾钳固定10 15min后，放松止血带，缝合。另一侧为对照侧，采用L形钢板内固定。术后不作外固定，允许动物自由活动。术后随机选择3d，3、6和9周进行观察，每个时间点6只。X 线片及大体观察，术后9周实验一侧骨折愈合；组织学观察9周人工骨材料浆体完全吸收， 骨折完全愈合。本发明的人工骨材料具有一定的粘合性能，可以将粉碎骨折块粘接是的骨折片拼接达到骨折部位的解剖形态，同时对骨折块间的缝隙及缺损的部位填充(“抹平”缝隙、缺陷)，达到无缝、无缺损状态，既保持正常骨的形态、保持了骨片的稳定，又不影响骨折的愈合，加快新骨的形成和改建，缩短骨折的愈合时间及骨折的再塑型时间。
权利要求
1.一种人工骨材料，其特征在于该人工骨材料由其固相组分和液相组分按照 0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制备而成，所述的固相组分包含羟基磷灰石、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠，其中，羟基磷灰石羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相组分为柠檬酸衍生物的二甲基亚砜溶液，所述柠檬酸衍生物的浓度范围为 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的柠檬酸衍生物为柠檬酸与N-羟基琥珀亚胺发生反应获得的酯化产物。
2.如权利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相组分中，羟基磷灰石羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)=70 25 5 60 30 10。
3.如权利要求2所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相组分中，羟基磷灰石羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)=65 观7。
4.如权利要求1所述的人工骨材料，其特征在于该人工骨材料的固相组分和液相组分比例为 1.6 1 2. 5 l(g/ml)。
5.如权利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述柠檬酸衍生物的浓度范围为 3mmoL/L 6mmoL/L0
6.如权利要求1所述的人工骨材料的制备方法，其特征在于其包括步骤固相组分的制备1)分别配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的水溶液，配制的这四种水溶液中Ca (NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基壳聚糖海藻酸钠(质量比)=60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)将羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合搅拌均勻后，再加入Ca(NO3)2溶液混合搅拌均勻；3)在温度为35°C 55 °C的条件下，搅拌步骤(2)获得的混合溶液的同时加入 (NH4)2HPO4溶液，搅拌速度为15 30转/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度为0. 4-0. 6mol/ min，pH值控制在8. 8 10. 3，搅拌12小时以上；4)陈化、过滤，取固相；液相组分的制备1)将柠檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1-(3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亚胺的存在下，加入N-羟基琥珀亚胺进行酯化反应获得所述的柠檬酸衍生物；2)再制备浓度范围为ImmoL/L lOmmoL/L柠檬酸衍生物的二甲基亚砜溶液；将上述制得的固相组分与液相组分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即获得所述的骨粘合剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述固相组分制备的步骤4)中，将过滤取得的固相洗涤后，置于醇溶剂中超声分散，再搅拌至少12小时后，再次过滤后取固相。
全文摘要
本发明涉及一种人工骨材料及其制备方法，该人工骨材料由其固相组分和液相组分按照0.8∶1～4∶1(g/ml)的比例混合制备而成，所述的固相组分包含羟基磷灰石、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠，所述的液相组分为柠檬酸衍生物的二甲基亚砜溶液。本发明的人工骨材料，既是具有骨缺损填充性能的骨材料，又是具有较好粘接性能的骨粘合剂，既能将粉碎的骨折块粘接达到解剖复位，又能在骨折块间隙及骨缺损处起到有效地填充作用，既保持正常骨的形态、保持了骨片的稳定，又不影响骨折的愈合。
文档编号A61L27/12GK102363049SQ20111036005
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者肖海军, 薛锋 申请人:上海市奉贤区中心医院