专利名称：治疗核苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些新的2′-脱氧-4′-硫代-嘌呤核苷，它们的生理机能衍生物，它们的制备方法，含有它们的药物制剂和在治疗中，尤其在病毒感染的治疗或预防中的应用。
在DNA病毒中，疱疹族的病毒是人类最常见的病毒性疾病的起因。该族包括疱疹单式病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、细胞肥大病毒(CMV)、EB病毒(EBV)和人体疱疹病毒6(HHV6)。HSV1和HSV2是人类的一些最常见的感染因素。大部分这些病毒能够存在于宿主的神经细胞中;一旦被感染后，个体则处于感染的复发临床表现的危险之中，这会导致身体上和心理上的痛苦。
HSV感染经常是以皮肤、口和/或生殖器的广泛的和衰弱的损害为特征。初次感染会是临床症状不明显的，虽然它们趋向于变得比先前暴露于病毒的个体的感染更严重。HSV引起的眼部感染会导致角膜感染会导致角膜炎或白内障，因而危害宿主的视力。在新生儿和免疫损害的病人(包括AIDS病人)中的感染或感染渗透到中枢神经系统被证实会导致死。
病毒的传染是通过宿主和受体的直接身体接触进行的，因而，HSV感染的扩散被认为是一个非常重要的社会问题，尤其是在目前还无法获得有效的疫苗的情况下。
水痘带状疱珍病毒(VZV)是引起水痘和带状疱疹的疱疹病毒。水痘是在没有免疫的宿主中产生的主要疾病，对于幼童来说通常是一种轻度的疾病，其症状为泡状疹和发烧。带状疱疹是疾病的复发形式，其出现于先前感染过水痘带状疱疹病毒的成人。带状疱疹的临床表现为神经痛和分布单侧皮肤的泡状皮疹。炎症的扩散会引起麻痹或惊厥。如果脑膜被损坏会出现昏迷。在免疫缺乏患者中，VZV会传播引起严重的或甚至致死的疾病。VZV与为移植或治疗恶性肿瘤而接受免疫抑制药物的患者有重要的关系，并且是由于其损坏的免疫系统引起的获得性免疫缺乏综合症(AIDS)患者的严重的并发症。
与其他疱疹病毒一样，CMV感染导致了病毒和宿主的终身关系，在初次感染后，病毒会散发许多年。由于妊娠期间母亲的感染而引起的先天性感染会导致如下临床结果，如死亡或严重的疾病(小头、肝脾肿大、黄疸、精神发育迟缓)、导致失明的视网膜炎或在不太严重的情况下，发育迟缓和易受胸廓和耳朵感染。在免疫损害的患者中，如由于恶性肿瘤、由于移植过程而用免疫抑制药物进行治疗或感染了人体免疫缺乏病毒(HIV)，CMV感染会引起视网膜炎、肺炎、胃肠失调和神经疾病。由于CMV以潜体形式存在于50-80%的成人人体中，并且在免疫损害的患者中会再活化，因此AIDS患者的CMV感染是发病的主要原因。
EB病毒(EBV)引起传染性的单核细胞增多症和毛状粘膜白斑病，其也被认为是人体癌症，如鼻咽癌、免疫母细胞性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤的病原因素。
HHV6已被证实是肾和骨髓移植患者的肾排斥和间质性肺炎的病原因素。其也被证实抑制了骨髓移植患者的干细胞计数。
另一类世界范围内最重要的病毒病原体是肝炎病毒，尤其是B型肝炎病毒(HBV)。HBV与原发的肝细胞性癌有病原学上的关系，被认为导致了全世界80%的肝癌。在美国每年有超过一万人因为HBV疾病而住院，并且平均有250人死于暴发性的疾病。据估计美国有500，000-1000000传染性带菌者。通常超过25%的带菌者发展为慢性肝炎，并常常变为肝硬变。HBV感染的临床反应包括头痛、发烧、不适、恶心、呕吐、厌食和腹痛。病毒的复制通常经持续数周或数月的恢复过程通过免疫应答来控制，但感染可能是更严重的会导致上文所述的持续的慢性肝炎。
在RNA病毒中，近年来逆转录病毒被认为尤其重要。逆转录病毒构成RNA病毒的亚族，为了进行复制首先必须把基因组的RNA逆转录成DNA(“转录过程”通常描述为由DNA合成RNA)。一旦呈DNA形式，病毒基因组被掺入宿主细胞基因组，使其利用宿主细胞的转录/翻译机制进行复制。一旦掺入后，事实上难以区分病毒DNA和宿主DNA，在这种状态下，病毒可以与细胞寿命同样长的时间存在。
一种逆转录病毒，人体免疫缺乏病毒(HIV)已经可重复地从患有AIDS或常常具有AIDS前症状的病人体中分离获得。AIDS是免疫抑制或免疫破坏疾病，其使患者易感染致死的机会致病菌的感染。在特征上AIDS与T-细胞，尤其是带有OKT4表面标记的辅助诱导细胞群的渐进排除有关。HIV是细胞病变的，显示优先感染和破坏带有OKT4标记的T-细胞，因而目前人们普遍认为HIV是AIDS的病原体。
另一类被认识作为日益严重的国际健康问题的病原因素的RNA病毒是非A、非B型肝炎病毒。至少80%的慢性输血后非A、非B型肝炎已被证实是由于目前鉴定为C型肝炎的病毒，在临床对于血制品进行的B型肝炎筛选过程中发现事实上所有输血后肝炎可能都是由这种病毒引起的。而约一半的急性C型肝炎感染都是在几个月后自身消散，其余的变为慢性，即使不是全部但是许多这类慢性活性肝炎接着发生的是潜伏的硬变和肝细胞性癌。C型肝炎病毒基因组的结构最近已被阐明，病毒的特征为与黄色病毒类似种类的单链RNA。
柯萨奇病毒属于肠道病毒属，它们具有包含在二十面体核苷中的单链RNA基因组。柯萨奇病毒感染愈来愈被认为是成人和几童原发心肌炎的病因。
柯萨奇感染还与脑膜炎、胸膜痛、疱疹性咽峡炎、手足和口疾病、呼吸疾病、眼病、糖尿病和病毒后疲劳综合症有关。在上述的后几种病例中病毒RNA在肌肉和menocytes中被检测到。
欧洲专利说明书No.EP-A-421777和No.EP-A-409575披露了某些4’硫代-嘧啶核苷和它们作为抗病毒剂的应用。
如下式(Ⅰ)的化合物落入国际专利说明书No.W091/04033公开的化合物的宽范围内，但该说明书没有特别披露式(Ⅰ)化合物或它们在治疗病毒感染中的应用。
我们如今惊讶地和出乎意料地发现，如下式(Ⅰ)化合物和其生理机能衍生物和其任何的溶剂化物适宜于作为抗病毒剂。
因此，本发明提供了式(Ⅰ)化合物
其中R1表示-卤素、-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每个代表H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一个或多个取代基取代)，或R2R3和与它们相连的N原子连接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元杂环，所述杂环除上述N原子外还任意地含有一个或多个任意地选自O和N的杂原子;
-S(＝O)nR4，其中n为0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或当n为0时，R4代表H;-S(＝O)mOR4a，其中m为0、1或2，R4a代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代);
-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基 C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代);-C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基;
其前提是，当R1代表-NR2R3时，R2和R3不同时为H;
或它们的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
另一方面，本发明提供了如上式(Ⅰ)的化合物，其中R1表示-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每个代表H、C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一个或多个取代基取代);或R2R3和与它们相连的N原子连接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元杂环，所述杂环除上述N原子外还任意地含有一个或多个任意地选自O和N的杂原子;-S(＝O)nR4，其中n为0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或当n为0时，R4代表H;-S(＝O)mOR4，其中m为0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被一个或多个选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取基取代);
-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C4-6环烷基、C3-6环烷基 C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被一个或多个选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取基取代);
其前提是，当R1代表-NR2R3时，R2和R3不同时为H;
或它们的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
本发明还进一步提供了式(Ⅰ)的化合物，其中R1代表卤素;-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每个代表H、C3-6环烷基、C1-6烷基或C2-6烯基，或R2、R3和与它们相连的N原子一起形成4-、5-或6-元杂环，所述杂环任意地含有除上述N原子外的一个或多个任意地选自O和N的杂原子;-S(＝O)nR4，其中n为0和R4表示H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基;
其前提是，当R1为-NR2R3时，R2和R3不同时为H;
或其的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
本发明的优选化合物包括如下化合物，其中R1代表卤素;-OR5，其中R5代表C1-4烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2是H或C1-3烷基和R3为C3-6环烷基、C1-6烷基、C2-6烯基;或R2、R3和与它们相连的N原子一起形成4-、5-或6-元杂环，所述杂环任意地含有除上述N原子以外的一个或多个任意地选自O和N的杂原子;-S(＝O)nR4，其中n为0和R4表示H或C1-6烷基;或其的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。在这些化合物中，优选的是如下化合物，其中R1代表-NR2R3，其中R2为H，R3为C3-6环烷基。
尤其优选的式(Ⅰ)化合物包括如下化合物，其中R1代表-OR5，其中R5代表甲基、乙基、丙基、环丙基、环丙基甲基;-NR2R3，其中R2是H或甲基，R3为环丙基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、哌啶基、吡咯烷基、硫基或甲硫基;
或其盐、酯或其他的生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
具体的优选式(Ⅰ)化合物包括2-氨基-6-环丙基甲氧基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(环丙基甲基氨基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-异丙基氨基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤;
2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤;
或其盐、酯或其他生理机能衍生物的它们的任何的溶剂化物。
尤其优选的式(Ⅰ)化合物包括2-氨基-6-(环丙基氨基)-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤和其盐、酯或其他的生理机能衍生物的其任何的溶剂化物。这些化合物尤其用于抵抗动物(该术语包括人、土拔鼠和鸭)感染HBV和CMV。
本文所用的术语“烷基”作为基团或基团的一部分指的是直链或支链烷基。术语卤素指的是氯、溴、氟或碘，优选的是氯。
式(Ⅰ)化合物和它们的生理机能衍生物和任何的溶剂化物在下文中统称为本发明的化合物。
本文所用的术语“生理机能衍生物”指的是式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的盐、酯或这类酯的盐或在给药于受体时能够提供(直接或间接)这类化合物或其抗病毒活性代谢产物或残余物的任何其他化合物。例如，在5′位置由潜在地可水解的基团，如酰基或烷基代替OH的H同样属于本发明的范围内。
作为生理机能衍生物包括在本发明范围内的式(Ⅰ)化合物的优选的酯包括羧酸酯，其中酯基的羧酸部分的非羰基部分选自直链或支链烷基(例如，甲基、正丙基、叔丁基或正丁基)、环烷基、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、芳烷基(例如苄基)、芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)、芳基(例如，苯基，任意地被例如卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代);磺酸酯，如烷基或芳烷基磺酰基(例如甲磺酰基);氨基酸酯(例如，L-异戊氨酰基或L-异亮氨酰基)和一、二或三磷酸酯。在这些酯中，除非另有说明，否则任何存在的烷基部分一般含有1-18个碳原子，尤其是1-6个碳原子，更尤其为1-4个碳原子。在酯中存在的任何环烷基部分一般含有3-6个碳原子。在该酯中存在的任何芳基部分包含任意取代的苯基。以上任何化合物的任何附注同样包括了其生理机能衍生物的附注。
对于治疗应用，式(Ⅰ)化合物的酯应是生理上可接受的，然而，生理上不可接受的酯也可发现用作中间体。所有的酯，包括非生理上可接受的酯也在本发明的范围内。
式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的盐和其生理上可接受的衍生物的实例包括由合适的碱得到的盐，例如碱金属(例如Na或K)、碱土金属(例如Mg或Ca)、铵和NX4+(其中X是C1-4烷基)的盐。H原子或氨基的生理上可接受的盐包括如下酸的盐，酸包括有机羧酸，如乙酸、乳酸、富马酸、酒石酸、马来酸、羟乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸;有机磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对-甲苯磺酸和无机酸，如盐酸。硫酸、磷酸和氨基磺酸。含有羟基的化合物的生理上可接受的盐由所述化合物的阴离子与合适的阳离子例如Na+NH4和NX4+(其中X是C1-4烷基)组合而成。
对于治疗应用，式(Ⅰ)化合物的盐应是生理上可接受的，即，其应是由生理上可接受的酸或碱得到的盐。然而，非生理上可接受的酸或碱的盐也可在生理上可接受的化合物的制备或提纯过程中用作，例如中间体。所有的盐，无论是否从生理上可接受的酸或碱获得，均在本发明的范围内。
本发明还提供用了于治疗，尤其是用作抗病毒剂，例如，用于治疗或预防肝炎病毒感染，如HBV感染或疱疹病毒感染，如上文所提到的那些，尤其是CMV、HSV1、HSV2或VZV感染的本发明的化合物。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗或预防逆转录病毒感染，尤其是HIV感染的本发明的化合物。
根据本发明可被治疗或预防的逆转录病毒感染的实例包括人体逆转录病毒感染，例如，人体免疫缺乏病毒(HIV)，例如，HIV-1或HIV-2，和人体T细胞亲淋巴性病毒(HTLV)，例如HTLV-Ⅰ或HTLV-Ⅱ感染。本发明的化合物尤其适用于治疗AIDS和与其有关的临床症状，如与AIDS相关的综合症(ARC)、进行性发生的淋巴结病(RGL)、卡波齐内瘤、血小板减少性紫癜;AIDS相关的神经病学症状，如多发性硬化或热带下肢轻瘫以及抗HIV抗体阳性和HIV阳性症状，包括无症状患者的症状。
可根据本发明治疗的其它临床症状的例子包括由上文所述的HIV、HSV1和2、VZV、CMV、EBV、HHV6、HBV、柯萨奇病毒和C型肝炎病毒感染引起的那些症状。
本发明还提供了用于治疗或预防柯萨奇病毒或C型肝炎病毒感染的本发明的化合物。
根据另一方面，本发明提供(a)治疗或预防所感染的动物，例如哺乳动物(包括人)的病毒感染的症状或效果的方法，其包括用治疗有效量的本发明的化合物治疗上述动物。根据本发明的特殊实施方案，病毒感染是肝炎感染，尤其是HBV感染或疱疹病毒感染，如CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV或HHV6。
(b)治疗或预防被感染的动物，例如哺乳动物(包括人)的HIV感染的症状或效果的方法，其包括用治疗有效量的本发明的化合物治疗上述动物。
(c)治疗或预防被感染的动物，例如哺乳动物(包括人)的柯萨奇病毒或C型肝炎病毒感染的症状或效果的方法，其包括用治疗有效量的本发明的化合物治疗上述动物。
(d)预防动物，例如哺乳动物(包括人)的病毒感染，尤其是HBV、CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV、HHV6、C型肝炎病毒或柯萨奇病毒感染的方法，其包括用治疗有效量的本发明的化合物治疗上述动物。
(e)本发明的化合物在药物生产中的应用，所述药物是用于治疗或预防病毒感染，尤其是HBV感染，疱疹病毒感染，包括CMV、HSV1、HSV2、VZV、EBV和HHV6，逆转录病毒感染，如HIV0感染、C型肝炎病毒感染或柯萨奇病毒感染。
本发明的化合物可单独使用或与其它用于治疗上述感染或症状的治疗剂结合使用。本发明的结合治疗包括给药至少一种式(Ⅰ)化合物或其生理机能衍生物和至少一种其他生理上可接受的药剂。活性成份或生理上可接受的药剂可一起或单独地给药，当单独给药时，可同时进行或以任何顺序进行。为获得所需的结合治疗效果应选择活性成份和生理上可接受的药剂的量和给药的相对时间。优选的是，结合治疗包括给药式(Ⅰ)化合物或其生理机能衍生物和一种下文提到的药剂。
这类其他的治疗剂的实例包括对治疗HIV感染或有关症状有效的药剂，如3’-叠氮-3’-二脱氧胸苷(zidovudine)、其他2’，3’-二脱氧核苷，如2’，3’-二脱氧胞苷、2’，3’-二脱氧腺苷和2’，3’-二脱氧肌苷、carbovir、无环核苷(例如无环乌苷)、2’，3’-二脱氢胸苷，蛋白酶抑制剂，如N-叔丁基-脱氢-2-[-2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-[[N-(2-喹啉羰基)-L-天冬酰胺酰基]丁基]-(4aS，8aS)异喹啉-3(S)-甲酰胺(Ro 31-8959);oxathiolane核苷类似物，如(-)-顺-1-(2-羟甲基)-1，3-oxathiolan-5-基)-胞嘧啶(3TC)或顺-1-(2-(羟甲基)--1，3-oxathiolan-5-基)-5-氟胞嘧啶(FTC)、3’-脱氧-3’-氟胸苷、2’，3’-二脱氧-5-乙炔基-3’-氟尿苷、5-氯-2’，3’-二脱氧-3’-氟尿苷、(-)-顺-4-[2-氨基-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇、三唑核苷、9-[4-羟基-2-(羟甲基)丁-1-基]-鸟嘌呤(H2G);tat抑制剂，例如7-氯-5-(2-吡咯基)-3H-1，4-苯并二氮杂草-2(H)-酮(Ro5-3335)，或7-氯-1，3-二氢-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯并二氮杂草-2-胺(Ro24-7429);干扰素，如α-干扰素;肾分泌物抑制剂，如羟基磺胺;核苷转移抑制剂，如，潘生丁、己酮可可碱、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Procysteine、α-trichosanthin、膦甲酸以及免疫dulator、如白细胞介素Ⅱ、粒性白细胞巨噬细胞菌落刺激因子，促红细胞生成素、可溶的CD4和其基因工程衍生物。其他对于治疗HBV感染有效的治疗药剂的实例包括carbovir、oxathiolane核苷类似物，例如(一)-顺-1-(2-羟甲基)-1，3-oxathiolan-5-基)胞嘧啶(3TC)或顺-1-(2-(羟甲基)-1，3-oxathiolan-5-基-5-氟-胞嘧啶(FTC)、2’，3’-二脱氧-5-乙炔基-3’-氟尿苷、5-氟-2’，3’-二脱氧-3’-氟尿苷、1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙炔基尿嘧啶、无环鸟苷、和干扰素，如α-干扰素。其他用于治疗疱疹病毒感染的有效的治疗剂的实例包括无环鸟苷、9-[4-羟基-2-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤(H2G)、9-[4-羟基-3-(羟甲基)丁-1-基]鸟嘌呤(penciclovir)、famciclovir、penciclovir的二乙酸酯、BVaraU、1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙炔基尿嘧啶、2-[(2-氨基-1，6-二氢-6-氧-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基L-缬氨酸酯、膦甲酸和膦乙酸、ganciclovir、(S)-1-(3-羟基-2-膦酰基甲氧基丙基)胞嘧啶(HPMPC)、Oxetanocin G.2’-脱氧-5-碘尿苷、E-5-2-溴乙烯基-2’-脱氧尿苷(BVDU)和9-(3-羟基丙氧基)鸟嘌呤。
更优选的结合治疗包括给药一种上述药剂和上述式(Ⅰ)优选亚组的化合物。最优选的结合治疗包括结合使用一种上述的药剂和一种本文特殊命名的化合物。
本发明还提供了本发明化合物(本文也称之为活性成份)的药物制剂，其可通过适合于所治疗的临床症状的任何合适途径给药以治疗包括人在内的哺乳动物(受体)，合适的途径包括口腔(包括颊和舌下)、直肠、鼻、局部(包括颊、舌下和皮肤)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌肉、静脉和皮内)。显然，优选的途径将随着受体的症状、体重、年令和性别、感染的性质和所选的活性成份而变化。
用于治疗上述应用和适应症(包括HBV、HIV、HSV1、HSV2、CMV、VZV、EBV、HHV6、C型肝炎病毒或柯萨奇病毒感染)的所需的本发明化合物的用量将取决于许多因素，其包括所治疗的症状的严重程度和受体的情况，最终将由负责医生自行处理。
然而，对于每种应用和适应症，合适的有效剂量通常为0.05至100mg每公斤受体体重每天，优选的为0.1-50mg每公斤受体体重每天，最优选的为0.5-20mg每公斤受体体重每天。最佳剂量为约2-5mg每公斤体重每天。对于治疗HBV感染，合适的有效剂量优选地为0.05-20mg每公斤体重每天。对于CMV感染，剂量优选地为0.5-20mg每公斤体重每天。除非另有说明，所有活性成份的重量是以式(Ⅰ)的母体化合物计算。在式(Ⅰ)化合物的生理机能衍生物或其任何的溶剂化物的情况下，数字应按比例增加。所需剂量优选地以一天内以适合的间隔如二、三、四、五、六或更多个亚剂量给药。这些亚剂量可以单位剂量形式给药，例如，每个单位剂量形式含有1至1500mg、优选地为5至1000mg，最优选地为10至700mg活性成份。此外，如果受体的症状需要的话，所述剂量可以连续输液形式给药。
尽管活性成份能单独给药，但优选地以药物制剂给药。本发明的制剂包含至少一种如上定义的活性成份与一种或多种药物可接受的载体和任意地一种或多种其他治疗剂。每种载体在制剂的其他成份相容和对患者无害方面必须是“可接受的”。
本发明的制剂包括适合于任何上述可方便地以单位剂量形式给药途径施用的那些制剂，这些制剂可由制药学技术的任何已知方法制备。这类方法包括使活性成份与构成一种或多种辅助成份的载体相混合的步骤。通常制剂可通过使活性成份与液体载体或细粉碎的固体载体或两者均匀地和紧密地混合，然后，如果需要，成形产物而制备。
适用于口服的本发明的制剂可以可分离的单位如各含有预定量的活性成份的，胶囊、扁囊剂或片剂的形式给药;分离的单位也可以是粉剂或颗粒剂;含水或非水液体中的溶液或悬浮剂;水包油乳剂或油包水乳剂。活性成份可作为大丸剂、糖果剂或糊剂给药或包含在微脂粒中给药。
片剂可通过任意地与一种或多种辅助成份一起进行压制或模制而制备。压制的片剂可通过在合适的机器中压制自由流动形式的活性成份，如与任意的粘合剂(如，吡咯烷酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)或表面活性剂或分散剂的混合的粉末或颗粒而制备。模制的片剂可通过在合适的机器中模压湿的粉状化合物与惰性液体稀释剂的混合物而制备。片剂可任意地涂复或划痕，片剂可通过使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线或使其在加入水中时可溶解或起泡来配制以使其达到缓慢或控制的释放活性成分。片剂可任意地以带有肠溶衣的形式给药以使其在肠而不是在胃中逐份释放。
适用于口服的制剂还包含用来中和胃酸的缓冲剂。该缓冲剂可选自各种有机或无机试剂，如与它们的共轭盐混合的弱酸或碱。
胶囊可通过在合适的填充机器中填充疏松或压紧的粉末和任意的一种或多种添加剂而制备。合适的添加剂的实例包括与用于片剂相同的粘结剂，如吡咯烷酮、明胶、润滑剂、惰性稀释剂和崩解剂。胶囊也可配制成含有小丸或可分离的亚单元以提供活性组分的缓慢或控制的释放。这可通过将药物与挤出助剂(例如微晶纤维素)与稀释剂(如乳糖)的湿混合物挤压和团成球状而得到，随后得到的球体用半透膜(例如乙基纤维素、Eudragit WE30D)涂复以获得持续的缓释性能。
食用泡沫或打成泡沫制剂理想地包含50-70%食用油，尤其是植物油，其包括玉米油、花生油、葵花籽油、橄榄油和豆油;2-10%一种或多种表面活性剂，尤其是卵磷脂、多元醇、多元醇聚合物酯，包括甘油基脂肪酸酯、多甘油基脂肪酸酯(例如十甘油四油酸酯)或脱水山梨醇脂肪酸酯(例如脱水山梨醇单硬脂酸酯);1-4%的推进剂，其适用于咽下，特别是压缩气体推进剂，尤其是氮气、一氧化二氮或二氧化碳，或气态烃，尤其是丙烷、丁烷或异丁烷;0.5-30%一种或多种颗粒尺寸为10-50微米(直径)的粘度调节剂，尤其是粉状的糖或胶态二氧化硅;和可有可无的0.5-1%的一种或多种适当的非毒性的色素、调味剂或增甜剂。在这类制剂中活性成份优选地以10-46%的浓度存在，有利地为30%。上述的食用泡沫或打成泡沫制剂可用常规方法制备，例如，混合食用油、表面活性剂和任何其他可溶的成分，加入粘度调节剂，研磨混合物形成均匀的分散液和悬浮液，将活性成份与研磨的混合物混合直到完成分散，最后，在上述混合物计量装入适合的分散容器后，在混合物中加入计量的推进剂。
用于本发明局部给药的药物制剂可配制成软膏、乳剂、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。此外，制剂可包括包敷料，如用活性成份和任意地一种或多种赋形剂或稀释剂浸渍的绷带或绊创膏。
适用于经皮给药的组合物可以适合于较长时间保持与受体的表皮紧密接触的可分离的贴剂形式给药。这类贴剂合适地含有1)在任意地缓冲的含水溶液;2)溶解在粘合剂或3)分散在聚合物中的活性化合物。活性化合物的合适浓度为约1%至35%，优选为约3%至15%。作为一种特殊的可能性，活性化合物可通过Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中描述的离子电渗疗法由上述贴剂提供。
对于眼睛或其他外部组织，例如口和皮肤的感染，制剂优选地以局部的软膏或乳剂施用，其活性成份的含量为，例如，0.075-20% w/w，优选地为0.2-15% w/w，最优选地为0.5-10% w/w。在配制于软膏时，活性成份与石蜡和水溶性软膏基质一起使用。此外，活性成份可与水包油乳剂基质或油包水基质一起配制在乳剂中。
如果需要的话，乳剂基质的水相可包括，例如40-45% w/w的多羟基醇，即含有两个或更多个羟基的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露糖醇、山梨醇、丙三醇和聚乙二醇和它们的混合物。局部制剂可包含改善活性成份通过皮肤或其他感染部位的吸收或渗透的化合物。这类皮肤渗透改善剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。
本发明乳剂制剂的油相可仅仅含有乳化剂(或者称为乳化剂)，但根据需要可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或两者的混合物。优选的是，亲水乳化剂与作为稳定剂的亲油乳化剂一起存在，同样优选的是，同时含有油和脂肪。乳化剂与或不与稳定剂一起构成所谓的乳化石蜡，石蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的形成乳剂制剂的油相的乳化软膏基质。
适用于本发明制剂的乳化剂和乳化液稳定剂包括Tween 60、Span80、cetostearyl醇、十四醇、甘油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。
制剂的适当的油或脂肪的选择基于获得所需的化妆品性能，因为活性成份在大多数用于药物乳化液制剂的油中的溶解度很低。乳剂应优选地是非油赋、非污斑和可洗的产物，并且有合适的稠度以避免从管或其他容器中漏出。可使用直链或支链的一或二元烷基酯，如二异己二酸酯、异十六基十八酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇酯、异丙基十四酸酯、癸基油酸酯、异丙基棕榈酸酯、丁基硬脂酸酯、2-乙基己基棕榈酸酯或称为Crodamol CAP的支链酯的混合物，最后三种是优选的酯。根据所需的性质，它们可单独使用或结合使用。此外，高熔点类脂，如白色软石蜡和/或液态石蜡或其他矿物油也可使用。
适用于眼睛局部给药的制剂包括眼滴剂，其中活性成份溶解或悬浮于合适的载体中，尤其是含水溶剂。在这种制剂中活性成份的存在浓度为0.5-20%，有利的是0.5-10%，尤其是约1.5% w/w。
适用于口部局部给药的制剂包括锭剂，其含有在调味物质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性成份;锭剂，其含有在惰性物质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成份;和漱口液，其包含在合适的液体载体中的活性成份。
用于直肠给药的制剂可以含有合适的基质的栓剂施用，所述基质包括可可脂或高级脂肪醇(例如硬石蜡、European Pharmacopoeia)或甘油三酯和饱和脂肪酸(例如，Witepsol)。
适用于鼻给药的其中载体是固体的制剂包括颗粒尺寸例如20-500微米的粗粉米，其以如下方式给药，其中将鼻吸药置于紧靠鼻孔通过鼻道从粉末容器中迅速吸入而获得鼻吸药。其中载体是液体的合适的制剂可作为鼻喷雾剂或鼻滴剂(含有活性成份的水或油溶液)给药。
通过吸入给药的合适的制剂包括细颗粒粉或合剂，其可由各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器或吸入器产生。
对于经口的肺给药，粉末或液滴的颗粒尺寸通常为0.5-10μm，优选为1-5μm，以确保进入枝气管分枝。对于鼻给药，10-500μm的颗粒尺寸是优选的以确保在鼻腔中的停留。
计量剂量吸入器是加压的气溶胶分散器，其通常含有在液化推动剂中的活性成份的悬浮液或溶液制剂。在使用过程中，这些装置通过适合于提供计量体积，通常为10-150μl;的阀排出制剂以产生含有活性成份的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括丙烷和丁烷、通常称之为“CFS”的某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或它们的混合物。制剂可附加地含有共溶剂，例如乙醇、表面活性剂，如油酸或脱水山梨醇三油酸酯、抗氧化剂和/或合适的调味剂。
喷雾器是商业上可得到的装置，其将活性成份的溶液或悬浮液转变成气溶胶治疗合剂，这是通过由窄文丘里孔加速加压的气体，如空气或氧气或通过超声搅拌而完成。用于喷雾器的合适的制剂由在液体载体中的活性成份组成，其含量是少于制剂的40% w/w，优选少于20% w/w。载体通常为水或稀释的含水醇溶液，优选地通过添加例如NaCl使之与体液等渗。任意的添加剂包括防腐剂(如果制剂不是无菌制备的)，例如，甲基羟基苯甲酸酯、抗氧化剂、香味剂、挥发性油、缓冲剂和表面活性剂。
用于吸入给药的合适的制剂包括细粉碎的粉末，其可通过吸入器提供或以鼻吸药的方式进入鼻腔。在吸入器中，粉末包含在由明胶或塑料制成的胶囊或药筒，其可就地戳破或打开，粉末或者presnete入径吸气吸入装置的空气或由手动操作的泵提供。在吸入器中使用的粉末包含的或者是单独的活性成份或者是活性成份、合适的粉末稀释剂(如乳糖)和任意的表面活性剂的粉末混合物。活性成份通过包含制剂的0.1-100% w/w。
用于吸入的加压气溶胶制剂优选地被这样处理，以使每个计量剂量含有0.05-5mg的本发明化合物。同样，用于吸入的粉末制剂被如此处理以使每个单元剂量含有0.5-50mg。用于喷雾的溶液或悬浮液制剂被如此处理以提供1-1500mg的剂量。本发明的化合物或制剂可由这些装置每天给药一次或若干次，每次根据各种情况提供一或若干剂量，例如三或四剂量。
途用于阴道给药的制剂可作为阴道栓剂、棉塞、乳剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂存在，这些制剂含有除活性成份之外的现有技术中已知的合适的载体。
适用于肠胃外给药的制剂包括含水和非水无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂和溶质，其使制剂与受体的血液等渗;和可含有悬浮剂和增稠剂的含水或非水无菌悬浮液。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，如密封的安瓶和小瓶。可以冻干状态贮存，其在使用前仅仅需要添加用于注射的无菌液体载体，例如水。临时作成的注射溶液和悬浮液可由前文所述的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
优选的单位剂量制剂是含有活性成份的上文提到的日剂量或亚剂量或其合适的部分。
人们可以理解，除上述特定提到的成份外，本发明的制剂可包含考虑上述制剂类型的现有技术中常规的其他试剂，例如用于口服的制剂可含有香味剂。
式(Ⅰ)的化合物可通过普通有机化学，尤其是核苷合成的现有技术中已知的各种方法制备。起始物质是已知的或易于从商业来源获得，或本身由已知和常规技术制备。
本发明进一步包括式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的盐、酯或生理机能衍生物和其溶剂化物的制备方法，其包括(A)使式(Ⅱ)的嘌呤碱
其中R1为如上文所定义或其功能等价物，与如下式(Ⅲ)的化合物反应
其中R6和R7是相同的或不同的，每个代表H或羟基保护基团，A是磷酸基团或其盐或除(Ⅱ)以外的嘧啶或嘌呤部分或离去基团，以形成式(Ⅰ)化合物;或(B)使如下式(Ⅳ)的化合物与一种或多种试剂和/或在使R8转化为所需的R1基团的条件下反应
其中R6和R7如上文中所定义，R8代表式(Ⅰ)中定义的R1的前体;
和随后或同时进行一步或多步如下任意的转化过程(ⅰ)除去任何残余的保护基团;
(ⅱ)在形成式(Ⅰ)化合物时，将其转化为式(Ⅰ)化合物的盐、酯或其他生理机能衍生物;或(ⅲ)在形成式(Ⅰ)化合物的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何溶剂化物时，将衍生物转化为式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的不同衍生物;
(ⅳ)如果需要，分离出式(Ⅰ)化合物或其被保护的衍生物或式(Ⅰ)化合物的生理可接受的衍生物的α和β异头物。
在上述的本发明的方法中，式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的起始化合物以及上述的试剂和条件选自核苷合成化学的现有技术中已知的那些。这些转化过程的实例在下文中指导性地描述，人们应理解，根据所需的式(Ⅰ)化合物，它们可以常规的方式作出改进。尤其是在另外产生易变基团的不需要的反应的转化过程中，这些基团可以常规的方式保护，随后在转化过程完成后除去保护基团。
按照用于进行方法(A)的条件，式(Ⅱ)的嘌呤碱和式(Ⅲ)化合物可任意地用常规保护基团保护，例如，酰基，尤其是烷酰基(例如乙酰基)、取代的烷酰基，如烷氧基烷酰基、芳酰基(如苯甲酰基)、醚基，包括三烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基)或其他基团，如芳烷基(例如苄基)或磷酸酯基。
这些基团可通过酸或碱水解、氢解或酶催化而除去。酰基通常通过碱水解除去，而甲硅烷基通过酸水解或氟化物离子处理除去。芳烷基，例如苄基，有利地是通过催化氢解除去。
进行方法(A)通常采用两种方法，即酶催化和化学方法。
方法(A)可酶催化进行，通过，例如，使合适的式(Ⅱ)嘌呤碱(其中R1如前文所定义或其功能等价物，例如盐或保护的衍生物(参见上文))与式(Ⅲ)化合物反应，在式(Ⅲ)中，R6和R7是相同或不同的，每个代表H或羟基保护基团(参见上文)，A是嘧啶或嘌呤部分(除(Ⅲ)以外)、磷酸酯基团或其盐。
在其中A是嘧啶或嘌呤部分(除(Ⅱ)以外)的情况下，反应可在(ⅰ)磷酸化酶，如嘌呤核苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶和无机磷酸或其盐;或(ⅱ)转移酶，例如，反-N-脱氧核糖酶存在下进行。为了得到本发明的化合物，在应用该方法时，式(Ⅲ)的化合物应为其β-形式。
反-N-脱氧核糖酶可用标准生物化学技术由表达乳杆菌酶的大肠杆菌菌株SS70-8/15分离得到，该菌由American Type CultureCollection(ATCC)Rockville，MD 20852-1776(登记号No.ATCC69016，1992年6月17日)得到。
在其中A代表磷酸基团或其盐的情况下，反应可在单磷酸化酶，如嘌呤核苷磷酸化酶存在下进行。为了得到本发明的化合物，在应用该方法时，式(Ⅲ)化合物应为其α-形式。
保护基团也可用于酶催化方法，但事实上，我们发现这是不必要的，在某些情况下事实上对总产率不利。
方法(A)可在催化剂存在下，例如氯化锡(Ⅳ)或路易士酸(例如二溴化汞或三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯)，在合适的溶剂中，例如甲苯、乙腈、1，2-二氯乙烷或氯仿在低温、室温或高温下，如-78℃至回流温度，优选地为0°至25℃，通过例如使如上定义的式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物反应而化学实现，在式(Ⅲ)中，R6和R7是相同的或不同的，每个代表H或羟基保护基团，A代表合适的离去基团，如卤原子，例如氯或酰氧基，如乙酰氧基。
与酶催化方法相反，我们发现，化学方法(a)中式(Ⅱ)和(Ⅲ)的化合物可有利地被保护(参见上文)和(b)所形成的式(Ⅰ)化合物是α-和β-异头物的混合物。本发明的β-异头物可通过技术人员熟知的或在化学文献中易于找到的方法，例如，通过硅胶柱色谱法或HPLC，异头分离得到。
其中R1如上文所定义或是任何功能等价物的式(Ⅱ)化合物可以由商业上得到，例如，由Aldrich Chemical Company得到，或由技术人员已知的或从化学文献易于找到的常规方法制备，例如，通过Robins等人的J.Amer.Chem.Soc.1957，79，490-494和Montgomery和Temple的J.Amer.Chem.Soc.1961，83，630-635中描过的方法或类似方法。
例如，合适的嘌呤碱可由其中6位取代基为合适的离去基团，例如氯的相应的嘌呤通过所述基团的亲核位移制备。因此，其中6位取代基是甲氧基或环丙基甲氧基的嘌呤可通过在碱，如氢化钠存在下分别用甲醇或环丁醇处理相应的6-氯嘌呤制备，而其中6位取位基是环丙基氨基、哌啶基或吡咯烷基的嘌呤可通过在合适的溶剂中用合适的胺，即环丙胺、哌啶或吡咯烷分别处理相应的6-氯嘌呤而制备。
2-氨基-6-氯嘌呤前体可由商业上获得(Aldrich ChemicalCo.)或由技术人员已知的或从化学文献中易于找到的方法制备。
其中A是嘧啶或嘌呤部分的式(Ⅲ)化合物可由技术人员熟知的或从化学文献中易于找到的方法制备。例如，2’-脱氧-4’-硫代尿苷可由Secrist J.A.Ⅲ等人的J.Med.Chem.34，2361-2366(1991)中描述的方法制备，而2’-脱氧-4’-硫代腺嘌呤可由WO 91/04033中描述的方法制备。
其中R6和R7如上文所定义而A表示离去基团，例如氯和乙酰氧基的式(Ⅲ)化合物可由常规方法制备，通常采用欧洲专利说明书NO.EP-A-409575中描述的方法，其内容列为本文参考文献。
其中A代表磷酸基团的式(Ⅲ)化合物可由类似于化学文献中得到的方法化学制备或由其中A是嘌呤部分的式(Ⅲ)化合物通过用磷酸化酶，例如胸苷磷酸化酶处理制备。
对于方法(B)，在其中前体基团R8代表保护基团的情况下，可采用上文描述的用于方法(A)的常规保护基团。
本发明的酯可通过现有技术中的已知方法制备。例如，通过用合适的酯化剂，例如，用合适的酰基卤，例如酰基氯或酸酐处理式(Ⅰ)的母体化合物。
式(Ⅰ)化合物的一、二或三磷酸酯可由式(Ⅰ)的母体化合物通过常规的化学方法或酶催化方法，例如，使用核苷激酶或磷酸转移酶，在核苷酸三磷酸酯(例如ATP)存在下经一、二和三磷酸衍生物逐渐磷酰化制备。
式(Ⅰ)化合物通过以常规方式与合适的烷基化剂反应可被转化成式(Ⅰ)的相应的生理上可接受的醚。
式(Ⅰ)化合物(包括其酯)可以常规的方式，例如，通过用合适的碱处理转化成生理上可接受的盐。式(Ⅰ)化合物的酯或盐可通过，例如水解，转化成母体化合物。
如下实施例仅用来举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围，实施例中所用的术语“活性成份”指的是式(Ⅰ)化合物或其生理上的机能衍生物或其任何的溶剂化物。
A.由大肠杆菌制备反-N-脱氧核糖酶(E.C.2.4.2.6)
大肠杆菌菌株SS70-8/15在富集介质，如含有150g/ml氨苄青霉素的Luria液体培养基中生长过夜(15-20小时)。在4℃经离心从生长介质中收集细菌，细胞片状沉淀物用冷的100mM磷酸钠缓冲液(PH 6.0)洗涤。通过将洗过的细胞片状沉淀物重新悬浮于0.6-0.8体积的冷的100mM磷酸钠缓冲液随后将细胞悬浮液通过12-14Kpsi的French吐丝器制备细胞萃取物。在70Ti转子和50Krpm离心分离90分钟除去全细胞和细胞碎片。由离心得到的上清液是高速上清液(HSS)。通过加入冷的100mM磷酸钠缓冲液调节HSS的A260至180。稀释的HSS调节至0.2% PEI(聚乙烯亚胺)，在4℃。培养15-30分钟，随后离心分离。得到的上清液经PEI沉淀后调节至(NH4)2SO4的30%饱和度，在4℃培养60-90分钟，然后离心分离成片状沉淀物和蛋白质。用30%(NH4)2SO4沉淀的蛋白质缓慢溶解于100mM磷酸钠缓冲液(PH6.0)，然后对2-6升同样的缓冲液进行透析。
透析后，离心除去所形成的沉淀物，含有酶的上清液在60℃的水浴中加热5-10分钟，随后在冰/水浆液中培养20分钟。离心除去加热处理过程中形成的沉淀物，上清液含有用于核苷合成的反-N-脱氧核糖酶。
每种酶制备过程的反-N-脱氧核糖酶活性用脱氧肌苷和胞嘧啶作基质在Cardinaud，R.1978.来自Lactobacillus helveticus的核苷脱氧核糖基转移酶，Methods Enzymol.51∶446-455中描述的黄嘌呤氧化酶偶联试验体系中确定。
大肠杆菌菌株SS70-8/15在1992年6月17日寄存在AmericanType Culture Collection(ATCC)Rockville，MD 20852-1776，登记号No.ATCC 69016。
B.2’-脱氧-4’-硫代-嘌呤核苷的酶催化制备方法改性的嘌呤碱如US 5068320、Koszalka，G.W.等人的“用作水痘带状疱疹病毒的选择性抑制剂的腺嘌呤阿拉伯糖的6-N-取代衍生物”，Antimicrobial Agents and Chemotherapg，35，1991，1437-1443和Burns，C.L.等人的“用作人体免疫缺乏病毒的细胞病变效应抑制剂的新的6-烷氧基嘌呤2’，3’-二脱氧核苷”，J.Med.Chem.1993，36(3)，378-384中描述的那样通过2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich)中的氯的取代来制备。
适当取代的嘌呤加入900ml pH6.0的柠檬酸缓冲液中得到1mM嘌呤碱溶液。缓冲液通过将9.46g(45mmol)柠檬酸加入900ml蒸馏去离子水并用NaOH调节至最终pH6.0而制备。将2’脱氧-4’-硫代尿苷的α/β混合物(1∶1)(Secrist，J.A.Ⅲ，等人的J.Med.Chem.，34，2361-2366(1991)，列为本文参考文献)加入得到5mMβ化合物的浓度。通过在声处理下将混合物加热至50℃得到溶液。加入反-N-脱氧核糖酶(2051单位/ml)至5单位酶/反应物ml的最终浓度。将反应混合物保持在50℃。在四天内每天加入等量的嘌呤碱，五天后通过超声过滤除去酶，冻干除去水。得到的白色粉末残余物用甲醇(500ml)制成浆并过滤。固体用甲醇彻底漂洗(3×100ml，直到在滤液中不存在UV活性)。收集的滤液用Dowex AG-1(OH形式)树脂(200ML)制成浆并过滤。用甲醇洗净树脂直到在滤液中不存在UV活性，用旋转蒸发器除去溶剂。将粘稠的残余物溶解于100ml甲醇中，加入硅胶(～20ml)。产物用快速色谱法，5×30cm柱，95∶5CH2Cl2∶CH3OH作洗脱液提纯，提纯的产物冻干脱水得到白色粉末的核苷。
实施例12-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和甲醇制备的2-氨基-6-甲氧基嘌呤被加入如上所述(实施例B)的pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
1HNMR(DMSO-d6)δ2.34-2.37(m，1)，2.52-2.58(m，1)，3.36-3.39(m，1)，3.54-3.58(m，1)，3.68-3.74(m，1)，3.96(s，3)，4.45-4.48(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.30(d，1，J＝3.8)，6.13(t，1，J＝6.9)，6.50(s，2)，8.20(s，1).UV(pH＝7)λmax281(ε＝11.0);λmax252(ε＝9.7);λmin263(ε＝6.5);λmin232(ε＝10.3).(pH＝13)λmax281(ε＝10.4);λmax252(ε＝9.0);λmin263(ε＝6.0);λmin233(ε＝6.0).MS(El)m/z298(M+H).
实施例22-氨基-6-(环丙基氨基)-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤由环丙胺对2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)的氯基团的亲核置换制备的2-氨基-6-环丙基氨基嘌呤被加至如上所述的(实施例B)pH6.0柠檬酸缓冲液中。
熔点98-126℃[α]D20-73.8(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.54-0.68(m，4)，2.27-2.35(m，1)，2.50-2.60(m，1)，3.01(br，s，1)，3.31(m，1)，3.51-3.59(m，1)，3.67-3.73(m，1)，4.46(t，1，J＝3.3)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.8)，5.90(s，2)，6.10(dd，1，J＝6.5，7.9)，7.36(d，1，J＝2.3)，8.01(s，1).UV(pH＝7)λmax285(ε＝15.2);λmin246(ε＝6.4);sh265(ε＝10.3).(pH＝13)λmax297(ε＝14.2);λmin274(ε＝7.2);sh258(ε＝11.1).MS(El)m/z323(M+H).
CHNOS-0.5HO计算值C，47.12;H，25.36;S，9.68。实验13 18 6 22值C，46.87;H，5.81;N，25.18;S，9.72.
实施例32-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤由Sigma Chemical Co.得到的2-氨基-6-甲硫基-9H-嘌呤被加至如上所述的(实施例B)pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
197-199℃.[α]20D-94.4(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.27-2.35(m，1)，2.50-2.60(m，1)，2.6(s，3)，(m，1)，3.54(m，1)，3.74(m，1)，4.47(m，1)，5.13(t，1，J＝6.0)，5.31(d，1，J＝2.0)，6.13(dd，1)，6.58(s，2)，8.26(s，1).UV(pH＝7)λmax285(ε＝15.1);λmin246(ε＝6.4);sh265(ε＝10.3).(pH＝13)λmax297(ε＝14.2);λmin274(ε＝7.2);sh258(ε＝11.1).MS(EI)m/z314(M+H).
C11H15N5O2S2.0.5H2O计算值C，40.98;H，5.00;N，21.72实验值C，40.93;H，4.72;N，21.69.
实施例42-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(环丙基甲基氨基)-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和环丙基甲胺制备的2-氨基-6-(环丙基甲基氨基)-9H-嘌呤被加至如上所述的(实施例B)的pH6.0柠檬酸缓冲液中。
熔点72-76℃.[α]20D-78.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.64-0.69(m，2)，0.78-0.84(m，2)，2.27-2.35(m，1)，2.49-2.58(m，1)，3.2(m，1)，3.32(s，3)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.74(m，1)，4.46(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.13(dd，1，J＝7.9，7.9)，8.04(s，1).MS(EI)m/z337(M+H).
C14H20N6O2S.1H2O计算值C，47.74;H，6.32;N，23.53;S，8.98.
实验值C，47.82;H，6.17;N，23.47;S，9.04.
实施例52-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和乙基甲胺制备的2-氨基-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤被加至如上所述的(实施例B)的pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
熔点78-82℃.[α]20D-84.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.18(t，3，J＝7.0)，2.31-2.35(m，1)，2.49-2.53(m，1)，3.26(br，s，3)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.71(m，1)，3.94(br s，2)，4.46(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.86(br s，2)，6.11(dd，1，J＝6.3，7.9)，8.03(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.5H2O.计算值0.1C2H6OC，46.90;H，6.44;N，24.86.
实验值C，46.98;H，6.38;N，25.09.
实施例62-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-异丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和异丙胺制备的2-氨基-6-异丙基氨基-9H-嘌呤被加至如上所述的(实施例B)的pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
熔点81-85℃.[α]20D-71.8(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.16(d，6，J＝6.5)，2.26-2.34(m，1)，2.25-2.58(m，1)，3.3(m，2)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.73(m，1)，4.45(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.84(br s，2)，6.10(dd，1，J＝8.0，8.1)，6.95(br s，1H)，8.00(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.5H2O.计算值0.5C2H6OC，47.18;H，6.79;N，23.58;S，9.00.
实验值C，46.85;H，6.60;N，23.69;S，9.08.
实施例72-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-环丙基甲氧基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和甲醇制备的2-氨基-6-环丙基甲氧基-9H-嘌呤被加至如上所述的(实施例B)的pH6.0柠檬酸缓冲液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.30(m，2)，0.58(m，2)，1.30(m，1)，2.32-2.38(m，1)，2.54-2.61(m，1)，3.3(m，1)，3.53-3.60(m，1)，3.68-3.74(m，1)，4.21(d，2，J＝7.3)，4.47(m，1)，5.13(t，1，J＝5.5)，5.30(d，1，J＝3.7)，6.14(m，1)，6.45(s，2)，8.20(s，1).MS(EI)m/z338(M+H).
实施例82-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和哌啶制备的2-氨基-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤被加至pH6.0的上述(实施例B)的柠檬酸缓冲液中。
α]20D-75.0(c＝0.50，DMF).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.52(br m，4)，1.63(m，2)，2.27-2.35(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.51-3.59(m，1)，3.66-3.74(m，1)，4.09(br m，4)，4.45(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.11(dd，2，J＝4.4，6.1)，8.03(s，1).MS(EI)m/z351(M+H).
C15H22N6O2S.0.1H2O计算值0.4CH2Cl2C，49.72;H，6.23;N，22.59;S，8.62.
实验值C，50.03;H，6.40;N，22.20;S，8.97.
实施例92-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和丙胺制备的2-氨基-6-正丙基氨基-9H-嘌呤被加到上述(实施例B)的pH6.0柠檬酸缓冲液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.87(t，3，J＝7.2)，1.55(h，2，J＝32.4)，2.31-2.34(m，1)，2.49-2.53(m，1)，3.26(br s，3)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.66-3.70(m，1)，4.46(m，1)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.85(br s，2)，6.10(dd，1，J＝8.1，8.0)，8.00(s，1).MS(EI)m/z325(M+H).
C13H20N6O2S.0.8H2O计算值C，46.08;H，6.43;N，24.80.
实验值C，46.17;H，6.19;N，24.62.
实施例102-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和吡咯烷制备的2-氨基-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤被加至上述(实施例B)的pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.90(br s，4)，2.28-2.35(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.48-3.59(m，1)，3.67-3.71(m，1)，3.90(br s，1)，4.46(m，1)，5.14(t，1，J＝5.5)，5.27(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，6.10(dd，1，J＝7.8，7.9)，8.01(s，1).MS(EI)m/z337(M+H).
C14H20N6O2S.1.0H2O计算值C，47.44;H，6.26;N，23.71.
实验值C，47.51;H，6.22;N，23.67.
实施例112-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤由2-氨基-6-氯嘌呤(Aldrich Chemical Co.，milwaukee，WI 53233)和烯丙胺制备的2-氨基-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤被加至上述(实施例B)的pH6.0的柠檬酸缓冲液中。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.28-2.33(m，1)，2.49-2.57(m，1)，3.3(m，1)，3.53-3.59(m，1)，3.67-3.72(m，1)，4.06(br s，1)，4.46(m，1)，5.01-5.12(m，2)，5.15(t，1，J＝5.5)，5.26(d，1，J＝3.7)，5.89(br s，2)，5.93(m，1)，6.10(dd，1，J＝8.0，8.0)，7.39(br s，1)，8.02(s，1).
实施例12片剂制剂如下制剂A、B和C通过将成份与吡咯烷酮溶液湿造粒，然后加入硬脂酸镁并压制而制备。
制剂A
mg/片 mg/片(a)活性成份 250 250(b)乳糖B.P. 210 26(c)吡咯烷酮B.P. 15 9(d)淀粉乙醇酸钠 20 12(e)硬脂酸镁 5 3500 300制剂Bmg/片 mg/片(a)活性成份 250 250(b)乳糖 150 -(c)微晶纤维素 60 26(d)吡咯烷酮B.P. 15 9(e)淀粉乙醇酸钠 20 12(f)硬脂酸镁 5 3500 300制剂Cmg/片活性成份 100乳糖 200淀粉 50吡咯烷酮 5硬脂酸镁 4359
如下制剂D和E通过直接压制混合的成份而制备。制剂E中的乳糖是直接压制型(Dairy Crest-“Zeparox”)制剂Dmg/片活性成份 250预胶凝化的淀粉NF15 150400制剂Emg/片活性成份 250乳糖 150微晶纤维素 100500制剂F(控制释放的制剂)制剂通过将成份(如下与吡咯烷酮的溶液湿造粒，然后加入硬脂酸镁并压制而制备。
mg/片(a)活性成份 500(b)羟丙基甲基纤维素 100(Methocel K4M Premlum)(c)乳糖B.P. 53(d)吡咯烷酮B.P. 28(e)硬脂酸镁 7700
药物释放在6-8小时内发生，在12小时后完成。
实施例13胶囊制剂制剂A胶囊制剂通过混合上文实施例2中的制剂D的成份并将混合物充入两部分的硬明胶胶囊中而制备。制剂B(在下)以类似方式制备。
制剂Bmg/胶囊(a)活性成份 250(b)乳糖B.P. 143(c)淀粉乙醇酸钠 25(d)硬脂酸镁 2420制剂Cmg/胶囊(a)活性成份 250(b)聚乙二醇4000B.P. 350600制剂Dmg/胶囊活性成份 250卵磷脂 100花生油 100450
制剂D的胶囊通过将活性成份分散在卵磷脂和花生油中并将混合物充入软质弹性明胶胶囊中而制备。
制剂E(控制释放的胶囊)如下控制释放的胶囊制剂是通过用挤出机将成份(a)、(b)和(c)挤出，随后使挤出物成球状并干燥，然后将干燥的小丸涂上释放控制薄膜并将其充填入两部分的硬质明胶胶囊而制备。
mg/胶囊(a)活性成份 250(b)微晶纤维素 125(c)乳糖B.P. 125(d)乙基纤维素 43543实施例14注射制剂制剂A活性成份 0.200gHCl溶液，0.1M或NaOH溶液，0.1M平衡至pH 4.0-7.0无菌水平衡至 10ml将活性成份在35-40℃溶解于大部分的水中，根据需要用HCl或NaOH调节pH至4.0-7.0之间。随后加水达到批量的体积，通过无菌微孔过滤器装入无菌10ml棕色玻璃小瓶(类型1)，并采用无菌闭合和过密封来密封。
制剂B活性成份 0.125无菌无热原的pH7的磷酸缓冲液平衡至 25ml实施例15肌肉注射活性成份 0.20g苄醇 0.10g糖糠醛(Glycofurol)75 1.45g注射用水平衡至 3.00ml将活性成份溶解于糖糠醛中，随后加入苄醇并溶解，加水至3ml。混合物经无菌微孔过滤器过滤，密封在无菌3ml棕色玻璃小瓶(类型1)中。
实施例16糖浆活性成份 0.25g山梨醇溶液 1.50g丙三醇 2.00g苯甲酸钠 0.005g调味剂Peach17.42.3169 0.0125ml纯水平衡至 5.00ml将活性成份溶解于丙三醇和大部分纯水的混合物中，在溶液中加入苯甲酸钠水溶液，然后加入山梨醇溶液，最后加入调味剂。用纯水加至所需体积并充分混合。
制剂B活性成份 0.125g无菌无热原，pH7的磷酸盐缓冲液平衡至 25ml实施例17栓剂mg/栓剂活性成份(63μm)＊250硬脂肪B.P.(Witepsol H15-Dynamit Nobel) 17702020＊活性成份作为粉末使用，其中至少90%的颗粒为63μm(直径)或更小。
将五分之一的Witepsol H15在蒸汽夹套容器内在45℃(最高温度)熔化，活性成份通过200μ筛筛分，在用装有切割头的Silverson搅拌下将活性成份加入到熔化的基质中，直到获得均匀的分散液。保持混合物45℃，在悬浮液中加入其余的Witepsol H15，搅拌以确保均匀混合。使全部悬浮液通过250μm不锈钢筛，在搅拌条件下使之冷却至40℃，在38-40℃的温度下，将2.0g混合物充入合适的2ml塑料模具内，使栓剂冷却至室温。
实施例18阴道栓剂mg/阴道栓剂活性成份(631m) 250脱水葡萄糖 380马铃薯淀粉 363硬脂酸镁 71000将上述成份直接混合，将得到的混合物直接压制制备阴道栓剂。
实施例19抗病毒活性(a)HBV试验(方法1)式(Ⅰ)化合物的抗HBV活性由用于评价效率的高容量试验测定。
将来自在96孔板中的生长HBV生产细胞(HepG2.2.15，P5A细胞线)的上清液用于涂有HBV表面抗原(HBsAg)的特定单克隆抗体的微滴板孔。存在于上清液中的病毒颗粒与抗体结合并保持不动，期间其他碎片通过洗涤除去。这些病毒颗粒随后变性成释放HBV DNA束，其随后由聚合酶链反应放大并且由比色杂交捕获试验检测。定量结果通过标准曲线与含有已知HBV DNA含量的细胞上清液的稀释液的拟合得到。通过比较未处理对照细胞上清液与含有式(Ⅰ)化合物的上清液的HBV DNA含量，得到抗HBV效率的测量结果。
HBV的免疫和捕获产生HBV的细胞，2500细胞/孔，在96孔培养皿上在RPMI/10%牛胎儿血清/2mM谷氨酰胺(RPMI/10/2∶)中接种。在第1、3、5和7天用在RPMI/10/2中的式(Ⅰ)化合物的稀释液补充培养基至最终体积150μl。在园底微滴板的每个孔中加入50μl鼠单隆抗HBsAG抗体(10μg/PBSml)。在4℃培养过夜后，吸出溶液，代之以100μl PBS中的0.1% BSA溶液。将样品在37℃培养2小时，采用Nunc Washer用PBS-0.01% Tween-20(PBS/T)洗涤三次，用Pro/Pette在所有孔中加入10μl在PBS中的0.035%Tween20。用Pro/Pette将含有细胞外病毒粒子DNA的细胞上清液(25μl)移入孔中，最终Tween浓度为0.01%。在2排孔中加入25μl在RPMI/10/2中的HBV标准培养基稀释液用作用于定量分析的内标曲线，将板密封在4℃培养过夜。样品用PBS/T洗涤5次，用PBS洗涤两次，吸出洗液。最后，用Pro/Pette在每个孔中加入25μl 0.09N NaOH/0.01% NP40，将样品孔密封，在37℃培养60分钟，随后用25μl 0.09N HCL/100mM tris(pH8.3)中和样品。
聚合酶链反应(PCR)用Perkin Elmer PCR药盒对5μl样品进行聚合酶链反应(Saiki，R.K.等人。Science，239(4839)487-91(1988))。PCR在“MicroAmp管”中补充到25μl的最终体积。引物选自HBV基因组中的保存区域，由若干顺序的定位测定。一件引物在5主型末端被生物素化，以便于PCR产物的杂交捕获检测。所有引物从Synthecell Corp.，Rockville，MD 20850购买。
PCR产物的杂交捕获检测
PCR产物用辣根过氧化酶标记的低核苷酸探针(Synthecell Corp.，Rockville，MD 20850)检测，PCR产物用Holodiniy，M.等人在Bio Techniques，12(1)37-39(1992)中的方法在涂有抗生蛋白链菌素的微滴板孔中直接杂交于变性PCR产物的生物素化束。改进包括使用25K PCR反应体积和NaOH变化过程来代替加热。在杂交过程中生物素部分与板束缚的抗生蛋白链菌素的同时结合用以“捕获”杂交。未束缚的标记的探针在束缚(杂交)辣根过氧化酶的比色测定之前被洗去。存在于原始样品中的HBV DNA的量通过与标准相比较而计算。随后将这些值与未处理细胞培养物相比较而确定抗HBV活性的程度。
IC50(半数抑制浓度)是导致HBV DNA降低50%的化合物的量。
(b)用于HIV对抗病毒化合物感受性评价的HeLa-CD4+细胞试验HIV对抑制剂的感受性如Larder，B.A.，Chesebro，B.& Richman，D.D.Antimicrob.Agents Chemother.1990 34，436-441描述的那样通过HT4-6C细胞单细胞层的感染测定。细胞首先在24孔多孔板上以每孔5×104细胞接种，在37℃的生长培养基(DMEM10)中培养过夜。单细胞层用在含有5%牛胎儿血清与抗生素(DMEM5)的0.2ml的DMEM中的100-200pfu的无细胞病毒感染，在37℃培养1小时以使病毒吸附。随后在每个孔中加入0.3m DMEM5(含或不含抑制剂)，培养物在37℃培养2-3天。用在PBS中的10%甲醛溶液固定单细胞层，用0.25%结晶紫色染色以观察病毒噬菌斑。多核巨细胞(噬菌斑)的单个焦点用染色方法显示。ID50值由噬菌斑减数的百分数对抑制剂浓度的曲线图获得。
(c)HSV试验疱疹单式病毒1(HSV1)和2(HSV2)在多孔浅盘的Vero细胞的单细胞层中试验。所用的病毒菌株对于HSV-1和HSV-2分别为SC16和186。化合物的活性由噬菌斑减数试验测定，其中细胞单细胞层用合适的HSV悬浮液感染，然后覆盖上胶凝形式的营养羧甲基纤维素以确保病毒不扩散至整个培养物中。在营养羧甲基纤维素覆盖层中加入已知体积克分子浓度的一定浓度范围的化合物。在每一浓度下的噬菌斑数目以对照组的百分数表示，画出剂量一反应曲线。
(d)CMV试验人体细胞肥大病毒(HCMV)在多孔浅盘中在MRC5细胞(人体胚肺)的单细胞层中试验，使用标准CMV菌株AD 169。化合物的活性在噬菌斑减数试验中测定，其中，单细胞层用HCMV悬浮液感染，然后覆盖上营养羧甲基纤维素(胶凝形式)以确保病毒不扩散至整个培养物中。在营养覆盖层中加入已知体积克分子浓度的一定浓度范围的化合物。在每一药物浓度下的噬菌斑数目用对照组的百分数表示，画出剂量一反应曲线。
(e)MCMV试验鼠细胞肥大病毒(MCMV)在多孔浅盘中培养的鼠成纤维细胞细胞线3T3克隆A31的单细胞层中试验，使用MCMV菌株Osborn。化合物活性在噬菌斑减数试验中测定，其中细胞单细胞层用MCMV悬浮液感染，然后覆盖上营养羧甲基纤维素以确保病毒不扩散至整个培养物中。在营养覆盖层中加入已知体积克分子浓度的一定浓度范围的化合物。在每一药物浓度下的噬菌斑数目以没有药物的对照组的百分数表示，画出剂量一反应曲线。
(f)VZV试验水痘带状疱疹病毒(VZV)的临床分离物在MRC-5细胞的单细胞层中试验，MRC-5细胞由人体胚肺组织中得到。使用噬菌斑减数试验，其中，用病毒原种的悬浮液感染多孔浅盘中的细胞单细胞层。在孔中加入在已知体积克分子浓度试验下的一定浓度范围的化合物。在每一浓度下的噬菌斑数目用对照组的百分数表示，构成剂量-反应曲线。从这些曲线可测定每种药物的50%抑制浓度。
(g)HBV试验(方法2)材料病毒/细胞所用的细胞线由肝胚细胞瘤细胞Hep G2得到，其用含有四个B型肝炎病毒基因组，亚型ayw的5’-3’串联复制的质粒传染以产生命名为2∶2∶15的细胞线(Sells等人，PNAS 84 1005-1009，1987)。这些细胞带有作为染色体集成顺序和游离基因的Hep B DNA。这些细胞实质上产生少量的病毒颗粒，较高的病毒生产克隆P5A由2.2.15细胞在试验应用中得到。
培养基细胞在含有0.5%青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛犊血清的RPM1 1640中生长。
方法试验在24孔板上进行，在板上用约2.5×104细胞/孔接种，并在37℃下在5%CO2中生长5天，单细胞层随后用RPM1 1640 0.5%青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺和2%含有所需浓度的试验化合物的FCS)培养5天。每48小时用含试验化合物的新鲜培养基更换培养基。将板培养10天，除去培养基，在0.5ml PBS中从孔中挖出细胞，细胞在5000rpm下造粒5分钟，排出上清液，将细胞在-20℃冷冻。将细胞解冻，重新悬浮于500μl溶菌缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris/HCl pH7.4，10mM EDTA和0.6% SDS)中并加入50μl蛋白酶K(20mg/ml)，样品在37℃培养2小时。在Autogen 540DNA萃取器中萃取DNA并溶解在最终体积为50μl的水中。DNA用限制性内切酶Hind Ⅲ在37℃消化16小时，在1%琼脂糖凝胶上分离DNA片段。分离的DNA通过毛细管吸滤转移至hybond N+尼龙薄膜(Amersham International)在预杂交之后，在50%甲酰胺存在下，在42℃，用B型肝炎B基因组的核区的32P标记的阳性菌株RNA转录本，亚型ayw杂杂交过夜。在彻底洗涤后，污斑暴露于X-射线薄膜，由Milli Pore 610成象仪分析复制中间体DNA的杂交强度。比较不含试验化合物的对照组样品和已知阳性化合物的结果。
(h)细胞毒性细胞毒性在细胞生长抑制试验中测试。在96孔微滴盘上生长的Vero细胞的亚融合培养物暴露于不同的药物稀释液，每天用四唑鎓(MTT)的吸收测定受体培养物每天的细胞生存性。在96小时抑制50%细胞生存性所需的浓度称之为CCID50。
权利要求
1.式(Ⅰ)的化合物
其中R1表示-卤素、-NR2R3，其中R2和R3可以是相同的或不同的，每个代表H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的一个或多个取代基取代)，或R2R3和与它们相连的N原子连接在一起形成3-、4-、5-、6-或7-元杂环，所述杂环除上述N原子外还任意地含有一个或多个任意地选自O和N的杂原子；-S(=O)nR4，其中n为0、1或2，R4代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基、C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)，或当n为0时，R4代表H；-S(=O)mOR4a，其中m为0、1或2，R4a代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、C1-4烷氧基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)；-OR5，其中R5代表C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基、苯基或苯基C1-3烷基(其中苯基部分可任意地被选自卤素、C1-6烷氧基、硝基、氰基、氨基和C1-6烷基的取代基取代)；-C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；其前提是，当R1代表-NR2R3时，R2和R3不同时为H；或它们的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
2.权利要求1的化合物，其中R1代表卤素;-OR5，其中R5代表C1-4烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-3烷基;-NR2R3，其中R2是H或C1-3烷基和R3为C3-6环烷基、C1-6烷基、C2-6烯基;或R2、R3和与它们相连的N原子一起形成4-、5-或6-元杂环，所述杂环任意地含有除上述N原子以外的一个或多个任意地选自O和N的杂原子;-S(＝O)nR4，其中n为0和R4表示H或C1-3烷基;或其盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
3.权利要求1或2的化合物，其中R1代表-NR2R3，其中R2是H，R3是C3-6环烷基，或其盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
4.权利要求1的化合物，其选自2-氨基-6-环丙基甲氧基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-甲硫基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(环丙基甲基氨基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-(乙基甲基氨基)-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-异丙基氨基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-哌啶子基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-正丙基氨基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-N-吡咯烷基-9H-嘌呤;2-氨基-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤;或其盐、酯或其他的生理机能衍生物或其任何的溶剂化物。
5.2-氨基-6-(环丙基氨基)-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤。
6.2-氨基-6-(环丙基氨基)-9-(2-脱氧-4-硫代-β-D-红-五呋喃糖基)-9H-嘌呤的生理机能衍生物。
7.权利要求1至5的任何之一所要求的化合物或其生理机能衍生物在治疗中的应用。
8.权利要求1至5的任何之一所要求的化合物或其生理机能衍生物在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的应用。
9.权利要求8的应用，其中病毒感染选自疱疹病毒、逆转录病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒和C型肝炎病毒感染。
10.权利要求9的应用，其中疱疹病毒感染是选自疱疹单纯性病毒1、疱疹单纯性病毒2、水痘带状疱疹病毒、肥大细胞病毒、EB病毒和人体疱疹病毒6感染。
11.权利要求10的应用，其中疱疹病毒感染是肥大细胞病毒。
12.权利要求9的应用，其中肝炎病毒感染是B型肝炎病毒感染。
13.药物制剂，其含有至少一种权利要求1至5的任何之一所要求的式(Ⅰ)化合物或其生理机能衍生物和至少一种药物可接受的载体。
14.权利要求13的制剂，其为单位剂量形式。
15.权利要求14的制剂，其为片剂或胶囊形式。
16.权利要求1至6的任何之一化合物的制备方法其包括(A)使式(Ⅱ)的嘌呤碱
其中R1如权利要求1中限定或其功能等同物，与如下式(Ⅲ)的化合物反应
其中R6和R7是相同的或不同的，每个代表H或羟基保护基团，A是磷酸基团或其盐或除(Ⅱ)以外的嘧啶或嘌呤部分或离去基团，以形成如权利要求1限定的式(Ⅰ)化合物;或(B)使如下式(Ⅳ)的化合物与一种或多种试剂和/或在使R8转化为所需的R1基团的条件下反应
其中R6和R7如上文中所定义，R8代表权利要求1中定义的R1的前体;和随后或同时进行一步或多步如下任意的转化过程(ⅰ)除去任何残余的保护基团;(ⅱ)在形成式(Ⅰ)化合物时，将其转化为式(Ⅰ)化合物的盐、酯或其他生理机能衍生物;或(ⅲ)在形成式(Ⅰ)化合物的盐、酯或其他生理机能衍生物或其任何溶剂化物时，将衍生物转化为式(Ⅰ)化合物或式(Ⅰ)化合物的不同衍生物;(ⅳ)如果需要，分离出式(Ⅰ)化合物或其被保护的衍生物或式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的衍生物的α和β异头物。
全文摘要
本发明涉及某些新的2′-脱氧-4′-硫代-嘌呤核苷、它们的生理机能衍生物、它们的制备方法、含有它们的药物制剂和在治疗中，尤其在病毒感染的治疗或预防中的应用。
文档编号A61K31/7076GK1087089SQ9310952
公开日1994年5月25日 申请日期1993年7月1日 优先权日1992年7月2日
发明者G·W·科萨尔卡, N·A·范德拉伦, C·A·弗里曼, S·A·肖特 申请人:惠尔康基金会集团公司