专利名称：酸浆苦素a提取工艺及医药用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及酸浆苦素A的提取工艺及其医药用途，具体涉及其在制备治疗肿瘤药物中的新用途。
背景技术：
恶性肿瘤(通称癌症)是当前危害人类生命健康的重要疾病之一。近20年来，在世界范围内或中国范围内，肿瘤的发病率与死亡率均呈上升的趋势。据WHO统计，2008年全世界约有1270万癌症新增患者，死亡人数达760万。我国2000年癌症发病人数180-200万，死亡140-150万。纤维肉瘤(fibrosarcoma)是一种成纤维细胞和胶原纤维细胞形成的恶性软组织肉瘤，曾一度被误以为是成人软组织肉瘤中发病率最高的一种，随着免疫组织化学及分子诊断学等新技术的应用以及软组织肉瘤分类的细化，最新的数据显示纤维肉瘤在软组织肉瘤中只占到10%(Am J Surg Pathol, 2010, 34: 1504-1513)。虽然其发病率不高，但由于其对常规化疗药物的反应 率不高，其预后也不容乐观，易出现无法控制的全身转移。这就需要有新药的研究与开发应用于纤维肉瘤的治疗之中。恶性黑色素瘤(melanoma)是一种恶性程度相当高的恶性肿瘤，又称恶性黑瘤，黑色素瘤多数是在色素病变的基础上发生，少数发生于正常皮肤或粘膜的色素细胞。具体原因不明，多数认为与内分泌因素有关。恶性黑色素瘤的发生率在皮肤癌里占不到5%，但是每年的死亡率却是其他皮肤癌的3倍，因此对于黑色素瘤的治疗越来越成为研究的热点。黑色素瘤的早期治疗主要是手术广泛切除原发病源，由于黑色素瘤对放疗不敏感，晚期不能手术的或扩散性病变采用化疗联合细胞因子和肿瘤基因疫苗等进行治疗，即药物治疗联合免疫治疗(N Eng J Med，2004, 351: 998-1012)。因此药物治疗对于晚期的恶性黑色素瘤的治疗起着至关重要的作用，急需有新药的研究与开发应用于恶性黑色素瘤的治疗之中。死亡受体(deathreceptors)是一类受体超家族，包括 Fas/CD95、TNFR (tumornecrosis factor receptor)、DR-3 (death receptor 3)、DR-4 和 DR-5。当相应的配体与其结合以后，其通过在胞内的死亡结构域(death domain, DD)启动细胞内在一系列的机制，诱导细胞凋亡。其中Fas信号途径是最具代表性的死亡受体途径。当相应的配体与Fas受体结合后，膜上的受体就会发生二聚化，存在于胞浆中的结构域就会发生改变，之后募集细胞内的接头蛋白FADD (Fas-associated death domain),进而使FADD的另一端死亡效应结构域(death effector domain, DED)结构发生变化,继而募集procaspase_8,共同形成死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex, DISC), DISC形成后，可诱导procaspase-8自身激活,产生活性的caspase-8,活化的caspase-8则进一步激活下游的caspase-3,从而诱导凋亡(Science, 1998, 281: 1305-1308)。p53基因家族调控着多种基因的表达，在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制肿瘤血管生成等方面具有重要的作用。野生型p53能够引导或促进细胞凋亡；与野生型P53相反，突变型p53则对细胞凋亡有抑制作用。p53在细胞中的半衰期很短，主要是通过转录后的磷酸化和乙酰化使蛋白稳定。P53可在多个位点发生磷酸化，磷酸化还可促进p53转位到细胞核内。细胞损伤较大、不能够被修复时，p53蛋白会促使细胞进行凋亡。Bcl-2家族中p53的靶基因主要有Bax，Noxa，PUMA和Bid。近期研究表明，p53可直接转位到线粒体上与线粒体膜上的Bcl-xL和Bcl-2结合,增加线粒体膜通透性。此外，P53也可不通过转录途径，直接促进胞浆中的Bax转位到线粒体上，改变线粒体膜通透性。Noxa通过p53依赖和非依赖两条通路诱导凋亡，是p53诱导细胞凋亡的下游靶基因，通过线粒体定位域定位于线粒体外膜，置换出促凋亡Bax亚家族,Bax亚家族转位并嵌入到线粒体，使线粒体膜的通透性增强，而使线粒体内的细胞色素c释放入胞浆，细胞色素c能与凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1及caspase-9形成复合体,进一步激活caspase-3,启动caspase级联反应，诱导细胞凋亡(Science, 2003, 302: 1036-1038)。通过对肿瘤细胞的研究发现，肿瘤细胞的抗凋亡机制对肿瘤的发生及发展有着重要的意义。凋亡过程是一个细胞复杂的调控过程，其中起着至关重要作用的是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白(cysteine aspartic specific protease, caspase),它也是多条凋亡通路的汇聚点和执行凋亡的最终途径。正常细胞中以无活性的前体形式(procaspase)存在，当凋亡信号表达，procaspase被激活转化为caspase,最终导致细胞凋亡。细胞的凋亡过程并不是一个简单线性通路，其中细胞凋亡过程中的信号分子相互影响，从而构成了一个细胞凋亡的环形通路。在这个环形通路中，caspase酶家族、Bcl-2蛋白家族相互影响，Bcl-2蛋白家族能够激活或者抑制procaspase转化为caspase来调控细胞的凋亡,激活的caspase又能反过来影响Bcl-2家族蛋白的表达(Nature, 1998, 391: 441-442)。酸衆又名锦灯笼、灯笼草、红姑娘、挂金灯iPhysalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)为爺科(solanaceace)酸衆属植物,其干燥宿萼或带果实的宿萼作为锦灯笼药用(中国药典2010版I部，337-338)。酸浆始载于《神农本草经》，其中记载“酸衆，味酸平， 主热烦满，定志益气，利水道，产难，吞其实，立产”，《本草纲目》中也记载“酸浆利湿除热，除热故清肺止咳，利湿故能化痰治疽”。其味苦、酸，性寒，具有清热解毒、利咽、化痰、利尿作用，在抗癌、抗炎方面有着独特的疗效(《中华本草》7册，上海科学技术出版社，286-290)。酸浆苦素A (Physalin A)为酸浆宿萼中的主要成分之一，白色晶体，分子量526，目前对酸浆的药理作用研究较多，但是对酸浆苦素A药理作用机制的研究极少，仅有一篇文献报道其对前列腺癌细胞有诱导凋亡作用(Biol Pharm Bull, 2011，34:1584-1588)，而对酸浆苦素A在其它肿瘤中的应用及具体作用机制均未见报道。对酸浆苦素A (Physalin A)这一酸浆中的主要药效成分的提取制备工艺未见文献报道。

发明内容
本发明首次发现了酸浆苦素A对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，并且对正常细胞活力影响极小，优于已上市的抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel)和5_氟尿喃唳(5_Fu),小鼠急性毒性实验表明，1.0g/kg酸浆苦素A灌胃剂量下未见毒副作用和不良反应。本发明还首次涉及了酸浆苦素A在人纤维肉瘤细胞及人黑色素瘤细胞中的作用机制，可制备用于治疗肿瘤的药物。
本发明的首要目的在于提供一种酸浆苦素A的提取工艺。本发明的另一目的在于提供酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物方面的新用途。
本发明所使用酸衆苦素A由本课题组从酸衆(.Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)中提取分离得到，为白色晶体(Acetone),核磁数据与文献(Journal of Natural Product, 2008, 71:642-646)对照一致，确定其结构为酸衆苦素 A(Physalin A),纯度 >98%。
权利要求
1.酸浆苦素A的提取工艺，其特征在于:以酸浆药材为原料，通过乙醇进行回流提取，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；总浸膏分散到水中，用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取次数为一次或多次，萃取完成后减压浓缩，得到乙酸乙酯层浸膏；浸膏用丙酮溶解，放置，隔夜后，丙酮溶液中有晶体产生，按照同样方法经丙酮多次重结晶后得到酸浆苦素A。
2.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于:乙醇浓度为30% 90%，料液比为10:1 70:1，每次回流提取0.5 2小时，提取次数为一次或多次。
3.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于:总浸膏分散到5-10倍水中。
4.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，提取的酸浆苦素A与临床上接受的赋形剂混合制成肠道或非肠道给药制剂。
5.权利要求1提取的酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为人纤维肉瘤，人黑色素瘤，人肝癌，人宫颈鳞癌，人肺腺癌，人组织细胞淋巴瘤，人结肠癌，人表皮癌，人乳腺癌，人白血病。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:酸浆苦素A通过激活Fas死亡受体途径，进而激活下游caspase家族相关蛋白，诱导肿瘤细胞发生凋亡；同时，酸浆苦素A可诱导肿瘤细胞发生自噬，自噬和凋亡存在相互关系。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:酸浆苦素A通过激活p53蛋白并诱导线粒体活性氧的产生进而诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时酸浆苦素A可激活p38蛋白诱导肿瘤细胞发生自噬，自噬和 凋亡存在相互关系。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及酸浆苦素A(physalinA)提取工艺及其医药用途，具体涉及酸浆苦素A在制备抗肿瘤药物中的新用途，尤其是治疗人纤维肉瘤和人恶性黑色素瘤中的使用。经过工艺优化后，酸浆苦素A提取得率为0.2133%。酸浆苦素A可抑制多种肿瘤细胞生长，尤其对人纤维肉瘤和人黑色素瘤细胞生长抑制明显，但对人正常细胞活力影响不明显。其机制通过激活Fas死亡受体途径，进而激活下游caspase家族相关蛋白，诱导肿瘤细胞发生凋亡；同时，酸浆苦素A可诱导肿瘤细胞发生自噬，在HT1080及A375-S2细胞中自噬拮抗凋亡；p53蛋白及MAPKs家族p38蛋白起到关键性调节作用。酸浆苦素A可制备消化道及非消化道给药剂型，用于人纤维肉瘤及黑色素瘤等肿瘤的治疗。
文档编号A61P35/02GK103214497SQ20131012900
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者邱峰, 何昊, 池岛乔, 陈丽霞, 康宁 申请人:沈阳药科大学