专利名称：基因重组蛛丝蛋白－高聚物组织工程多孔支架材料的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域，具体说涉及一种组织工程支架材料，尤其是重组蛛丝蛋白-高聚物多孔支架材料。
背景技术：
组织和器官的衰竭、损伤是最主要的临床医学问题，而目前的治疗方法主要是器官移植、外科修复、人工取代物，这些方法虽然能起到一定的作用，但它们都存在这样或那样的不足，如器官移植是以牺牲健康组织为代价的“以伤治伤”的方法；现有人工取代物存在生物相容性的问题。直到20世纪80年代，美国学者提出了组织工程再生医学，它是利用生命科学和工程科学的原理和方法，研究和开发用于替代组织或器官的一部分或全部功能的取代物(Langer R，Vacanti J P.Tissue engineering.Science，1993，260920)。组织工程的发展，提高了组织工程组织和器官的衰竭、损伤的治疗水平，改善了患者的生活质量，有效地降低医疗成本.
组织工程学研究的主要科学问题之一是可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。理想的生物材料在组织工程中起关键作用，并成为组织工程研究的主流。
在生物材料的研究经历了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性质之后，已发展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料(L.L.Hench etal.Science，2002，2951014)。
目前，组织工程中天然生物材料的主要是胶原蛋白，人工合成的替代物主要是聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)。要获取理想的天然支架材料有一定困难，而且也存在一些问题，如胶原蛋白的抗原性强、力学强度不够，在处理过程中胶原蛋白容易变性等；人工合成的替代物虽然也具有可生物降解特点，如美国FDA认可的体内植入材料，已被制成可吸收的缝线、夹板、螺钉及敷料等，但这些材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性等方面还需改进。因此，目前研究的着重点更多的是寻找可人工合成、生物相容性好、可降解的支架材料。
作为组织工程的第三代生物新材料开发，蜘蛛丝蛋白具有得天独厚的条件。蜘蛛丝膜具有很好的透明性、生物可降解性和水-空气界面的通透性。与胶原蛋白和弹性蛋白相似，蜘蛛丝蛋白具自装配性质，通过二级结构调节以提供机械支撑；与聚酯比较，丝的柔韧性和弹性使其经得起重压和疲劳。丝蛋白生物相容性好，与胶原起同样的细胞粘附、扩展、分化和生长的作用。丝基质还有机械诱导作用，通过调整丝基质的硬度，提供控制基质的最终机械特性来模仿天然机体组织的机械特性和支持宿主组织内生长。因此它在医学应用、外科缝合线、生物材料衬膜和支架、细胞生长支撑支架和控制释放基质上表现出极大的应用潜力(Winkler S，Kaplan DL.Molecular biology of spidersilk.Reviews in Molecular Biotechnology，2000，7485)。
福建师范大学李敏等在福建省自然科学基金重大科技项目(2001F 006)、教育部重点项目(02072)和国家自然科学基金项目(30370414)的支持下分别于2002年(李敏，章文贤，黄建坤等.蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达，生物工程学报，2002，18(3)331)和2004年(李敏，黄建坤，涂桂云等，RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因的构建、表达与纯化，生物医学工程学杂志，2004，21(6)1006)先后公开了该研究小组根据蜘蛛丝的结构和功能特性，应用基因工程为核心的现代生物技术，利用原核生物表达体系，结合鸟枪法与物理图谱法对蜘蛛拖丝蛋白全基因进行克隆、测序与表达，构建了多种特殊序列的蛛丝蛋白基因，建立了可生产化的发酵罐高密度发酵工艺条件等技术，使得公众能以简便易行、低成本和有效的分离纯化方法规模化制备重组蛛丝蛋白，为大量应用蜘蛛丝蛋白作为组织工程新材料奠定了研究开发基础。

发明内容
为了解决现有组织工程材料在生物相容性、生物降解性和机械性能的不足，本发明的目的就是根据蜘蛛丝独特的机械特性和生物相容性以及其本质是蛋白质的结构特点，利用已经公开的可规模化制备的重组蜘蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物为主要原料制备生物相容性好、可降解的组织工程支架材料。该支架材料不仅能被降解成人体可吸收氨基酸，具有很好的生物相容性和较好的机械性能，且可批量生产。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是以基因重组蜘蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物为主要原料制备生物相容性好、可降解的支架材料。其中基因重组蜘蛛丝蛋白所占的质量百分比为55-95％，生物可降解的高聚物所占的质量百分比为45-5％。
本发明中生物可降解的高聚物是指聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己内酯、聚对二氧杂环己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羟基丁酸、其他线性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲壳素、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚氧乙烯中一种或他们的组合。
本发明可以用致孔法来制备多孔支架材料，具体工艺1.配制支架制备液取基因重组蛛丝蛋白粉溶解于80-98％甲酸得到蛋白溶液，再加入高聚物，混匀即得到含基因重组蛛丝蛋白和高聚物的支架制备液。其中基因重组蛛丝蛋白所占的质量百分比为55-95％，生物可降解的高聚物所占的质量百分比为45-5％。
2.添加致孔剂加入致孔剂如氯化钠，混匀。
3.倒模、加热将添加有致孔剂的支架制备液倒入模具中，置于55-90℃烘箱10-60分钟形成支架。
4.变性将支架浸泡在变性剂溶液(如乙醇)中变性10-15小时后取出，置于蒸馏水浸泡8-12小时。
5.冷冻干燥变性后的支架于-70℃冷冻干燥1-5小时即可得多孔支架材料。
本发明的有益效果是1.采用基因重组蛛丝蛋白制得的多孔支架材料，由于它的本质是天然蛋白质分子，使它具有了很好的生物相容性和可降解性。
2.加入生物可降解的高聚物不仅进一步提高多孔支架机械性能、调控泡沫支架材料的可降解特性，而且也有利于降低泡沫支架的成本。
3.支架的加工工艺简单，成本低，对于工业化大批量生产也适合。
附1、图2是泡沫支架材料外观图。
图3、图4是泡沫支架材料剖面扫描电镜图。
下面根据实施例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
实施例11.配制支架制备液取2.25g基因重组蛛丝蛋白粉溶解于7.5ml 98％甲酸得到30％(w/v)蛋白溶液，再加入0.45g聚乙烯醇，混匀，即得到含基因重组蛛丝蛋白和聚乙烯醇的支架制备液。
2.添加致孔剂加入1.5g致孔剂氯化钠，混匀。
3.倒模、加热将添加有致孔剂的支架制备液倒入圆柱形模具(R＝2cm)中，放入70℃烘箱30分钟。
4.变性、蒸馏水浸泡将支架浸泡在乙醇中变性15小时，蒸馏水浸泡10小时。
5.冷冻干燥变性后的支架，-70℃冷冻2小时即可得多孔支架材料。
实施例21.配制支架制备液取2.5g基因重组蛛丝蛋白粉溶解于10ml98％甲酸得到25％(w/v)蛋白溶液，加入1.25g壳聚糖，混匀，即得到含基因重组蛛丝蛋白和壳聚糖的支架制备液。
2.添加致孔剂加入2.0g致孔剂氯化钠，混匀。
3.倒模、加热将添加有致孔剂的支架制备液倒入长方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入60℃烘箱20分钟。
4.变性、蒸馏水浸泡将支架浸泡在乙醇中变性10小时，蒸馏水浸泡8小时。
5.冷冻干燥变性后的支架，-70℃冷冻4小时即可得多孔支架材料。
实施例31.配制支架制备液取2g基因重组蛛丝蛋白粉溶解于6ml98％甲酸得到33％(w/v)蛋白溶液，再加入1.0g壳聚糖和0.25g聚乙烯醇，混匀，即得到含基因重组蛛丝蛋白、壳聚糖和聚乙烯醇的支架制备液。
2.添加致孔剂加入1.0g致孔剂氯化钠，混匀。
3.倒模、加热将添加有致孔剂的支架制备液倒入长方形模具(4cm×3cm×3cm)中，放入65℃烘箱30分钟。
4.变性、蒸馏水浸泡将支架浸泡在乙醇中变性13小时，蒸馏水浸泡12小时。
5.冷冻干燥变性后的支架，-70℃冷冻3小时即可得多孔支架材料。
权利要求
1.本发明涉及一种组织工程多孔支架材料，其特征在于以基因重组蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物共混得到多孔支架材料。
2.根据权利要求1所述，制备多孔支架材料的蛋白质是基因重组蛛丝蛋白。
3.根据权利要求1所述，制备多孔支架材料的高聚物是生物可降解的高聚物，包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己内酯、聚对二氧杂环己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羟基丁酸、其他线性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲壳素、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚氧乙烯等。
4.根据权利要求1、3所述，制备多孔支架材料的高聚物可以是其中的一种或他们的组合。
5.根据权利要求1所述，基因重组蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物的配比(质量比)为基因重组蛛丝蛋白所占的质量百分比为55-95％，生物可降解的高聚物所占的质量百分比为45-5％。
全文摘要
本发明属于生物医学材料科学工程领域，涉及一种组织工程支架材料，尤其是多孔支架材料。本发明以基因重组蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物共混得到组织工程支架材料，基因重组蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物的配比(质量比)为基因重组蛛丝蛋白所占的质量百分比为55－95％，生物可降解的高聚物所占的质量百分比为45－5％。本发明得到的多孔支架材料具有很好的生物相容性、可降解性和较优越的机械特性，不仅加工工艺简单、成本低，而且也适合工业化批量生产。
文档编号A61L27/56GK1751748SQ200510076750
公开日2006年3月29日 申请日期2005年6月14日 优先权日2005年6月14日
发明者李敏, 陈登龙, 涂桂云, 黄曦, 周志华 申请人:福建师范大学