专利名称：两亲聚合物-pdgf复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子(PDGF)的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物理和化学稳定性。
背景技术：
PDGF类是通过经由两个二硫化物桥彼此连接的两个多肽链构成的大约30000道尔顿的糖蛋白类。已经识别出四种类型的链:A、B、C和D。天然蛋白质以同二聚体或AB型异二聚体的形式存在(Oefner C.EMBO J.11，3921-2926，1992)。PDGF最初分离自血小板。TOGF类是在血液凝结过程中释放出来的能够促进各种细胞类型的生长的生长因子(Ross R等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1974,71，1207 ；Kohler N.&Lipton A., Exp.Cell Res.，1974，87，297)。已知的是，血小板以外的某些细胞也会产生TOGF，其对于多数源自间叶细胞的细胞即血液、肌肉、骨骼和软骨细胞以及结缔组织细胞来说是促有丝分裂的(Raines E.ff., “Biology of Platelet-Derivated GrowthFactor (血小板源生长因子生物学)”，1993, Westermark, B.和 C.Sorg, Ed.Basel, Kerger,第74页)。许多文章往往也证实，巨噬细胞源TOGF对于平滑肌细胞起到趋化和促有丝分裂剂的作用并且其有助于动脉硬化特有的动脉壁的肌内膜增厚(Ross R等人，Science(科学)，1990，248，1009)。PDGF的活性此外还特别包括刺激嗜中性单核细胞的微粒释放(Tzeng D.Y等人，Blood (血液),1985, 66, 179),促进间质细胞的类固醇合成(RisbridgerG.P., Mol.Cell, Endocrinol., 1993,97，125)，刺激嗜中性吞噬作用(Wilson E 等人，Proc.Natl.Acad.Sc 1.USA, 1987，84，2213)，调节凝血栓蛋白表达和分泌(Majak R.A等人，J.Biol.Chem.，1987，262，8821)，以及血管平滑肌细胞中ICAM-1基因的后调节(MorisakiN 等人，Biochem.Biophys.Res.Commun., 1994, 200, 612)。由于这些不同性质，已经设想了重组I3DGF类在制药领域中的应用。I3DGF已经特别被批准用于糖尿病足部溃瘍的治疗(Regranex, J&J)和用于牙周修补(GEM21S, Biomimetic)0溃疡愈合，就像一般来说的皮肤愈合一样，是一种复杂的现象，其要求许多细胞类型随时间和在空间上的协调干预，这可以概括为三个阶段:发炎阶段、增殖阶段和重塑阶段。在对正常愈合而言大约7天的发炎阶段中，巨噬细胞杀死细菌，清除受损组织并使组织再生。为此，巨噬细胞分泌出胶原酶、细胞因子和生长因子。在对正常愈合而言从第3天到第三周的增殖阶段的过程中，相继发生三个事件。伤口被肉芽组织填充，血管生成且伤口被上皮细胞覆盖。肉芽组织从边缘向中心生长。成纤维细胞大量产生III型胶原。
在从第3周到I甚至2年的重塑过程中，肉芽组织成熟，且成纤维细胞产生较少胶原。通过细胞凋亡消除肉芽形成过程中形成的没用的血管。III型胶原被I型胶原替代，其依照张力线组织和交联。在此过程中，TOGF起到基本作用。在伤口形成过程中，血小板聚集并释放roGF。roGF将嗜中性白细胞、巨噬细胞和成纤维细胞引向伤口并且是有力的促细胞分裂剂。巨噬细胞和内皮细胞又合成和分泌roGF。roGF刺激成纤维细胞产生新的细胞外基质，基本是非胶原化合物，例如葡胺聚糖和粘着蛋白(J.F.Norton等人，Essential practice ofsurgery (外科基本实践),Springer, 2003,第 7 章，77-89)。慢性伤口例如糖尿 病足部溃疡、静脉溃疡和压疮具有愈合非常缓慢且有时不完全的特性，这是因为愈合过程不是正常进行(R.Lobmann等人，J.0f Diabetes and itscomplications (糖尿病及其并发症杂志)，2006, 20, 329-335)。愈合过程实际上是消除对组织的损伤所必须的破坏过程与引起新组织形成的修复过程之间的精妙平衡。蛋白酶和生长因子在此过程中通过调节此平衡来发挥基本作用。在慢性伤口的情况下，这种平衡向着有利于破坏的方向被扰乱，因此这些伤口的愈合缓慢。尽管存在不同类型的慢性伤口，但是在它们以持续发炎阶段(这造成高的蛋白酶含量并因此降低生长因子活性)为特征的意义上，它们在生物化学上相对类似(G.Lauer 等人，J.1nvest.Dermatol.115 (2000) 12-18)。这种生长因子的劣化造成与这些慢性伤口有关的组织的整体损失，这不利于愈合(D.R.Yager等人，J.1nvest.Dermatol.107(1996)743-748)。目前在市场上存在与国际非有产权名称“becaplermin(贝卡普勒明)”对应的，以商品名Regranex 出售的人重组fogf-ββ-基药品。这种药品用于糖尿病的下肢溃瘍的治疗。其是局部施用的凝胶形式并且能够促进溃疡愈合。其就像内源roGF—样特别能够促进细胞增殖并因此促进新组织的形成。这种治疗的效力有限(Cullen等人，The international journal ofbiochemistry&Cell Biology (国际生物化学与细胞生物学杂志)34，1544-1556, 2002),即使临床研究已经显示了在愈合和愈合所需的时间周期方面的改进(Greenhalgh等人，American Journal of pathology (美国病理学杂志)，136, 1235-12461990 ；Ladin Plasticand Reconstructive Surgery (Ladin 整形和重建外科学)，105, 1230-12312000 ； Ho I loway等人，Wounds, 5/4, 198-206 ；Mandracchia 等人，Clinics in Podiatric Medecine andSurgery (足病医学和外科学临床)，18，189-2092001 ;Wieman T.J.American Journal ofSurgery (美国外科学杂志)，176，74S-79S1998)。J&J出售的含有roGF-BB的Regranex产品已经通过将治疗的患者的康复率提高至50%而证实了其效力，与之相比，仅接受标准伤口治疗的患者的康复率仅为36%。尽管在糖尿病足部溃疡的治疗中具有这种显著改进，但必须指出，只有50%患者在长期和昂贵的治疗后实现康复。在未康复的情况下，后果可能极其严重，在许多情况下则导致下肢切除。应该补充的是，该治疗的平均持续时间非常长，大约20周，且其施用昂贵并有限制，这是因为必须清洁伤口并在早晨施用Regranex，然后在12小时后清洁伤口。这两个程序大多需要护士的护理。此外，持续20周的平均治疗成本过高(大约1400美元)。可以通过roGF在要治疗的伤口上的迅速降解来解释这种部分效力。这种降解在慢性伤口的情况下来自持续的发炎状态，这由于刺激蛋白酶的过度生产而在伤口上产生对PDGF不利的环境。尽管降解控制对于伤口愈合是必须的，但过度的蛋白水解活性是有害的，因为其造成细胞外基质的降解(F.Grinnell 等人，J.1nvest.Dermatol.106 (1996) 335-341 和C.N.Rao等人，J.1nvest.Dermatol.105(1995)572-578)和具有关键功能性作用的分子如生长因子的降解(V.Falanga 等人，J.Derm.Surg.0ne.18 (1992) 604-606 ；D.R.Yager 等人，Wound Rep, Reg.5 (1997) 23-32.和 M.Wlaschek 等人，Br.J.Dermatol.137(1997)646-647)。实际上，生长因子如H)GF、TGF^或bFGF由于它们诱发细胞迁移、增殖、蛋白质合成和基质形成的能力，并且更一般地由于它们控制修复过程的事实而成为愈合过程中的关键因素。但是，这些生长因子是蛋白质分子并因此对蛋白水解降解敏感。一些研究表明，在它们与来自慢性伤口的流体接触时，如I3DGF这样的生长因子的降解快得多，这是因为它们含有高浓度的金属蛋白酶(D.R.Yager 等人，J.1nvest.Dermatol.107 (1996) 743-748)。对于静脉溃瘍的治疗，在出版物(T.J.ffieman, Wounds, 2003,卷15, N0.8,257-264)中报道的试验性临床研究中，与基于用加压疗法常规清洁伤口的现有治疗相比，Regranex仅表现出轻微改进。在蛋白质生成过程中体现出例如I3DGF的不稳定性的问题。已知的是，I3DGF对转译后的蛋白水解特别敏感(Hart等人，Biochemistry (生物化学)29:166-172, 1990和美国专利序列号07/557，219)，尤其是在蛋白质的成熟链的位置32处的精氨酸氨基酸与位置33处的苏氨酸氨基酸之间的结合程度上。其它位置对蛋白水解敏感，例如I3DGF的B链的位置79处的精氨酸与位置80处的赖氨酸之间的结合，或位置27处的精氨酸与位置28处的精氨酸之间的结合。这种蛋白水解不稳定性在获得这种蛋白质方面具有严重问题，其根据美国专利N0.4，845，075中所述的方法在酵母中以重组方式制成。具体而言，美国专利N0.7，084, 262教导我们，PDGF-BB的分析和提纯导致由转译后内切蛋白酶解裂解产生21种异型。这种极大的结构异质性因此导致基因 工程产生的蛋白质活性与成熟形式的完整蛋白质相比降低50%。此外，根据日期为2006年8月14日的关于在14周后尚未康复的糖尿病足部溃疡的新闻公报(WWW, prnewswire.com), Cardium最近的临床结果表明使用F1DGF-BB的治疗可以提供的潜力。Cardium提出的解决方案在于在伤口细胞中引入表达TOGF-BB的基因以使其局部过度表达。借助腺病毒载体的这种基因疗法在15位患者组中能够使耐受普通治疗的这些糖尿病足部溃疡愈合接近80%。这种治疗方案是有前途的。但是，由于与腺病毒型病毒载体的使用有关的安全性，基因疗法的制药发展迄今仍然非常危险。因此需要改进和有可能改进使用I3DGF的糖尿病足部溃疡的现有治疗。在糖尿病足部溃疡治疗的情况下，最终目的是三重的:-加速康复-提高康复率-简化治疗程序。也存在静脉溃疡和压疮的情况，它们会造成相当大的疼痛和非常严重的医疗并发症。
因此，要解决的问题基本上是保护慢性伤口上的I3DGF。已经提出各种解决方案。美国专利5，905，142描述了通过产生对蛋白水解侵袭具有更高抗性的蛋白质突变体，通过取代或通过删除一个或多个接近潜在裂解位点的赖氨酸或精氨酸氨基酸来减轻与roGF有关的这些蛋白水解问题。制造更耐受蛋白酶的蛋白质的这种策略并不令人满意。PDGF的这种基因改性会导致生物活性的改变，产生不同的与其各种受体的亲合力，这也可能引发毒理学问题。此外，PDGF的这种改性要求新的药物开发，这是极其昂贵和冒险的。在1970年代，大量研究了这种蛋白质，据发现，提纯极其棘手，因为TOGF由于其阳离子和疏水性质而是“非常粘的蛋白质”(Heldin，C.H.EMBO J.11:4251-4259, 1992 ；Raines和 Ross, J.Biol.Chem.257(9):5154-5160，1982 ；Antoniades, PNAS78:7314，1981 ；Deuel 等人，J.Biol.Chem.256:8896, 1981)。PDGF实际上是高度阳离子性的蛋白质，其等电点为9.8至10.5。其它作者证实了这一性状，例如Wei等人(Journal of controlled release (受控释放杂志)112:103-110, 2006)，其解释了 I3DGF容易吸附到容器表面上，其在该容器中处于溶解状态。该作者通过在该混合物中加入0.1%BSA或0.1%BSA/Tween20混合物来解决该问题。这些解决方案在很大程度上解决了该问题，因为多达95%的蛋白质被发现处于溶解状态。但是，考虑到BSA的动物来源和与牛绵状脑病相关的风险，从制药角度看，这些解决方案并不令人满意。相同的作者提出的另一解决方案在于加入更有力的阴离子表面活性剂(SDS)，其能够使roGF保持溶解。遗憾地，SDS也引发蛋白质的部分变性，造成生物活性的损失。这种解决方案因此对于蛋白质的稳定化并不令人满意。在专利W093/08825中，发明人已经证实，纯化的TOGF在以局部施用的凝胶形式配制时具有极大的不稳定性。作为例子，他们举出roGF与某些传统用于配制药品的产品如甲基纤维素或羟丙基纤维素以及某些传统防腐剂如苄基醇的不相容性。作者通过解释需要在具有良好长期稳定性的同时配制局部施用的凝胶形式`roGF来提出此问题。相同的作者表示，溶解的roGF由于在中性pH值下的脱酰胺作用而降解且蛋白质在微酸性pH值下更稳定。该作者表示，通过结合几种参数-没有与蛋白质表现出任何相互作用的聚合物、能够限制脱酰胺反应的在微酸性PH值下的缓冲剂和对于蛋白质为中性的防腐剂，从而可以配制PDGF以获得从制药角度来看稳定的制剂。该作者表示，通过加入没有与蛋白质表现出任何相互作用的聚合物可以获得储存稳定的制剂，只要该制剂保持在微酸性PH值下以避免通过脱酰胺作用使蛋白质降解的反应。但是，这一解决方案并不令人满意，因为其不能保护生长因子避免在生理pH值下的体内蛋白水解降解。在专利W097/12601中描述了凝胶形式的I3DGF制剂，作者解释到，他们使用的纤维素衍生物能够使生长因子稳定化以避免储存过程中可能的活性损失。为此，他们使用之前在美国专利4，717, 717中对EGF获得的结果作为基础。但是，他们还解释到，通过在制剂中加入带电化学物质如带电氨基酸或金属离子，可以极大改进含有TOGF的纤维素凝胶的稳定性。在此，该解决方案能够使制剂中的生长因子在产品储存过程中稳定化，但不能使这些生长因子在生理PH值下对慢性伤口中存在的蛋白酶稳定化。因此在稳定化和保护生长因子(特别是TOGF)方面存在治疗优点，从而提高其在慢性伤口治疗，更特别是糖尿病足部溃疡伤口治疗中的效力。本发明因此涉及通过开发出两亲聚合物与I3DGF之间的复合物，从而在体外和体内在生理pH值下可能发生的化学或物理降解方面使I3DGF稳定化。

发明内容
本发明因此涉及两亲聚合物与I3DGF之间的复合物(两亲聚合物-PDGF)的形成，这种复合物为蛋白质提供了对于在体外和体内在生理PH值下在降解方面的化学和物理稳定性。本发明因此涉及水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于:-该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成:
权利要求
1.水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于: -该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成:
2.根据权利要求1的复合物，其特征在于I3DGF从由含有两个B链的人重组TOGF类(rhPDGF-BB)构成的组中选择。
3.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于聚合物选自取代基无规分布的聚合物。
4.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于两亲聚合物选自聚氨基酸。
5.根据权利要求4的复合物，其特征在于聚氨基酸选自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
6.根据权利要求5的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚谷氨酸。
7.根据权利要求6的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚天冬氨酸。
8.根据权利要求7的复合物，其特征在于聚氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸的共聚物。
9.根据权利要求1至5之一的复合物，其特征在于该聚合物选自多糖。
10.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚半乳糖醛酸 、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素构成的组中选择。
11.根据权利要求10的复合物，其特征在于纤维素的组由用酸官能化的纤维素如羧甲基纤维素构成。
12.根据权利要求10的复合物，其特征在于葡聚糖的组由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖构成。
13.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖构成的组中选择。
14.根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由与下式(I)对应的可溶性葡聚糖的衍生物所构成的组中选择: DMCaBbSuc (I) 其中: -D代表多糖链，优选由糖苷单元的链状连接构成， -MC代表甲基羧基基团， -B代表N-苄基亚甲基甲酰胺基团， -Su代表硫酸根基团(糖苷单元所带的游离羟基官能团的硫酸化)， -a、b和c分别代表基团MC、B和Su的取代程度(ds)，其中 i)a严格大于O ; ii)b为: 要么b大于或等于0.3且c为0.1至0.5 ; 要么b严格小于0.3且c符合下式(I): c ^ 8.5b2-5.41b + 0.86 (I)。
15.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于疏水基团Hy从由脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、苄胺、胆固醇衍生物和酚构成的组中选择。
16.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于两亲聚合物-PDGF复合物的形成是可逆的。
17.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于其满足验证化学和物理稳定性的试验。
18.根据权利要求17的复合物，其特征在于验证化学和物理稳定性的试验选自:复合物的验证试验(凝胶迁移率变动分析)、通过与蛋白酶接触进行的酶促降解减缓的试验以及通过SDS-Page进行的在生理pH值下的物理稳定性的试验。
19.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于TOGF/两亲聚合物比率为1/5至1/5000。
20.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于roGF/两亲聚合物比率为1/100至1/5000。
21.根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于TOGF/两亲聚合物比率为1/300至1/700。
22.制备根据前述权利要求任一项的两亲聚合物-PDGF复合物的方法，其特征在于在含水介质中在不存在可使蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备这种聚合物/PDGF-BB复合物。
23.治疗用组合物，其特征在于其包含根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物。
24.根据权利要求20的治疗用组合物，其特征在于其能够以100微克/毫升的TOGF施用。
25.根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。
26.人用或兽用治疗方法，其特征在于其包括在治疗位置施用包含根据权利要求1至22任一项的两亲聚合物-PDGF复合物的治疗性组合物。
全文摘要
本发明涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子(PDGF)的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物理和化学稳定性。本发明还涉及制备PDGF-两亲聚合物复合物的方法，其特征在于在含水介质中和在不存在可能导致蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备这种聚合物/PDGF-BB复合物并涉及所述两亲聚合物-PDGF复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。
文档编号A61K47/34GK103203023SQ20131012029
公开日2013年7月17日 申请日期2006年9月26日 优先权日2005年9月26日
发明者G·迪布勒克, L·达里-科雷亚, J·科雷亚, D·迪拉谢尔, R·苏拉, O·苏拉, G·苏拉 申请人:阿道恰公司