专利名称：一种组织工程化房室结及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于治疗心脏房室传导阻滞疾病的组织工程化房室结及其制备方法。
背景技术：
目前生物起搏治疗房室传导阻滞的思路是利用基因转染或细胞移植的方法在传导阻滞部位以下(如室间隔或左右心室壁)建立一个新的稳定起搏点，提供并提高心室自主节律，或将起搏基因、起搏细胞导入传导阻滞部位，修复病损的传导组织，从而使患者避免接受电子心脏起搏器的植入，达到生物心脏起搏所倡导的理想治疗状态。然而，转染起搏类基因虽然提高和产生了心肌细胞的自律性，初步证明可以创建异位起搏点，但依然面临巨大的挑战，如外源基因在体内缺乏长期稳定的表达并且难以有效的调控；不能得到高效、安全、导向性好的载体系统等。利用细胞移植的方法创建新的起博点，理论上可以克服上述基因导入的局限性，该方法是将具有较高起博活性的外源细胞移植到心室，使其与宿主心肌细胞之间形成电机械耦联，从而可以作为一个发放冲动的有效起搏点驱动心室收缩，达到治疗目的。然而该种细胞由于移植到心脏后微环境适应能力差以及取材来源问题，来 艮难应用至Ij临床治疗。Potapova 等(Irina Potapova, et a 1. Human Mesenchymal Stem Cells as a Gene Delivery System to Create Cardiac Pacemakers. Circulation Research. 2004 ；94 :952.)将起搏基因修饰的间充质干细胞移植到窦停模型动物心室中， 但移植的细胞极易在心脏内迁移、弥散，不能形成稳定统一的心脏节律或传导通路。特别是，导入基因和细胞在心室创建新的起搏点、力图提高心室自主节律治疗房室传导阻滞的思路，和安置电子起搏器一样，毕竟只是对传导阻滞所产生症状的一个缓解治疗，对心脏功能的全面改善和疾患的彻底治愈作用有限。针对上述基因转染和细胞移植治疗房室传导阻滞存在的问题和面临的困难，并综合考虑生物起搏治疗研究的现状，体外构建组织工程化的房室结，将之移植到心脏中修复或再建心脏传导通路，应为房室传导阻滞治疗课题的理想解决方案。目前国内、外尚无构建组织工程化房室结的研究报道，仅有个例报道关于利用工程化组织构建物建立房室传导通路的研究。Choi等(Choi YH, et al. 2006，Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006 ； 169(1) :72-85.)利用骨豁肌细胞和matrigel (水凝胶)在体外构建了一个组织体，并将之移植到大鼠心脏冠状沟心外膜下，对再建房室传导通路做了初步的尝试。结果表明该构建物可以和周围宿主心肌建立电机械耦联，并且允许房室之间有电冲动传导，初步证明了利用组织工程化组织再建房室传导通路的可行性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程化房室结及其构建方法与应用。本发明人设想，利用起搏细胞和传导细胞作为种子细胞，以胶原海绵为支架材料，体外构建组织工程化的房室结，将之移植到心脏中修复或再建心脏传导通路，应为房室传导阻滞治疗课题的理想解决方案。房室传导阻滞的位点一般发生在房室间隔内的传导路径上，大体位置约在Koch三角的区域，包括房室结以及与之相连的房结区和结束区。理论上， 将组织工程化房室结移植到房室交界处的心外膜下，即将组织工程化房室结连接到心脏冠状沟两侧房室心肌中，可越过阻滞位点并沟通其两端的传导，达到对房室阻滞的治疗目的。本发明的技术方案是利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞分别诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞，构建组织工程化房室结。本发明的关键在于如何采用骨髓间充质干细胞分别诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞作为种子细胞，胶原海绵作为支架，在体外构建具有起搏特性和心电传导特性的组织工程化房室结，为治疗心脏房室传导阻滞疾病提供移植体。胶原海绵是一种可降解的生物支架材料，在体外培养条件下随着培养环境的改变和时间的推移会逐渐的萎缩和降解。且种子细胞在其上的生长是否良好亦受种植的时间、浓度、方式的影响。因此，控制种子细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等，是利用胶原海绵和心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程房室结的关键。本发明提供了一种组织工程化房室结的构建方法，具体技术方案如下A、与窦房结细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为起搏细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取窦房结组织进行原代培养获得窦房结细胞。然后利用细胞培养池(Transwell)将窦房结细胞与骨髓间充质干细胞共培养，并且在培养液中添加lOmmol/L的5-氮杂胞苷结合10_8M的内皮素_1，培养时间6_7天，诱导骨髓间充质干细胞为心脏起搏细胞。通过倒置相差显微镜和透射电镜观察搏动情况以及形态、超微结构特征；利用免疫细胞化学检测诱导前后细胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX40、CX43、CX45的表达；以及全细胞膜片钳技术检测细胞的膜电流情况，记录动作电位等方法进行心脏起搏细胞鉴定。B、与心耳肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取心耳部位组织进行原代培养获得心耳肌细胞。然后利用细胞培养池(Transwell)将心耳肌细胞与骨髓间充质干细胞共培养， 并且施加旁分泌因子内皮素-1和神经调节蛋白-1 (浓度范围1 X IO-8M-L 5X 10_8M)，培养时间6-7天，诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞。通过对缝隙链接蛋白40、HCN2等标记物的检测进行心脏传导细胞鉴定。C、利用胶原海绵和诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程化房室结将诱导成功的心脏起搏细胞和传导细胞按一定的比例(1 1 1 2)制备成混合细胞悬液(混合细胞悬液的浓度范围IX IO6个/ml-1. 2 X IO6个/ml)，采用沉淀法(参见《组织工程学教程》，人民军医出版社，2001版。将细胞悬液滴到支架材料上，不使其溢出为准)种植该混合细胞到胶原海绵支架上(种植密度3X105个/cm3-6X105个/cm3)，定期更换培养液在体外条件下培养15天，直到细胞支架复合体形成有功能的房室结，体外电刺激检测传导速率。上述的组织工程化房室结的构建方法中，窦房结细胞、心耳肌细胞、骨髓间充质干细胞可以选自犬、大鼠、兔子、小鼠等。上述的组织工程化房室结的构建方法中，胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提{共。上述的组织工程化房室结的构建方法中，步骤C具体为将胶原海绵剪成1. 5X 1. 0X0. 2cm大小，用钴6°照射12小时以上消毒备用；分别取诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml， 于37°C、5% CO2培养箱中消化1-2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含10% FBS的DMEM/F12培养基(Gibco公司)Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为IXlO6个/ml，将两种细胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合细胞悬液，置4°C冰箱保存备用；于6孔培养板底滴加50 μ 1的细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的细胞悬液，置于37°C，含5% CO2的培养箱中孵育 1小时，再向培养孔中加入2ml含10% FBS的新鲜培养液，继续置于37°C、5% CO2的培养箱中培养2周，每2天换一次液。本发明还提供了根据上述方法制备得到的组织工程化房室结。本发明还提供了上述组织工程化房室结在制备治疗房室传导阻滞疾病移植体中的应用。经动物实验将构建成功的本发明组织工程化房室结移植治疗房室传导阻滞取得良好效果。通过移植手术，将构建成功的组织工程化房室结移植到心右纤维三角，显微外科缝合，分别于两周和一个月后给移植动物造成房室传导阻滞，心电图监测组织工程化房室结改善房室传导的情况。本发明获取了一种具有起搏特性和心电传导特性、可用于治疗移植的组织工程化房室结，为治疗心脏房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。
具体实施例方式现结合实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1 诱导犬骨髓间充质干细胞制备心起搏细胞和传导细胞1.分离、培养犬骨髓间充质干细胞、犬窦房结细胞和犬心耳肌细胞(1)犬骨髓间充质干细胞的分离、培养犬全骨髓直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞抽取成年杂交犬(第二军医大学实验动物中心，15千克)髂骨骨髓10ml，900Xg离心lOmin，弃上清与脂肪；加入红细胞裂解液TrisNH4Cl,40C 5min去除红细胞，以IX 106/ml接种于纤粘连蛋白(FN) (Sigma公司) 包被的培养皿中，培养基为60% DMEM-F12 (Gibco公司),10% FCS(Gibco公司)UOng/ml EGF(cytolab公司)UOOOU/ml LIF(Chemicon公司)。24h后去除悬浮未贴壁细胞，每3天换液1次，直到需要传代。(2)新生犬窦房结细胞培养出生24h的犬心脏，在解剖显微镜下，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取犬窦房结组织；剪成Imm大小的碎块，在0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C过夜消化。第一次的消化液弃去，再加入新鲜0. 07%的胰酶，37°C消化15分钟，吸出消化液并中止消化，重复2 3次，直至全部组织块消化完全。将消化液用200目的不锈钢滤网过滤后，IOOOrpm离心 8min，加入含 20% FBS(Gibco 公司)的 DMEM-F12 培养基(Gibco 公司)，37°C 5% CO2 培养4小时，吸出含未贴壁细胞的培养液在6孔板中培养，调整细胞数至1 X 105/ml细胞，每孔接种2ml。培养48小时后换液。每孔加入2ml含0. lmmol/L BrdU和20% FBS的DMEM-F12
培养基。(3)犬心耳肌细胞的分离培养取新生犬心耳肌组织块；剪成Imm大小的碎块，在 0. 07%的胰酶(Gibco公司)中4°C过夜消化。第一次的消化液弃去，再加入新鲜0. 07%的胰酶，37°C消化15分钟，吸出消化液并中止消化，重复2-3次，直至全部组织块消化完全。将消化液用200目的不锈钢滤网过滤后，IOOOrpm离心8min，加入含20% FBS (Gibco公司)的 DMEM-F12培养基(Gibco公司)，37°C 5% CO2培养4小时，吸出含未贴壁细胞的培养液在6 孔板中培养，调整细胞数至1 XlO5Ail，每孔接种anl。培养48小时后换液。每孔加入aiil 含0. lmmol/L BrdU(Sigma公司)禾口 20% FBS的DMEM-F12培养基继续培养。2.骨髓间充质干细胞向心脏起搏细胞和传导细胞方向的诱导分化(1)骨髓间充质干细胞向心脏起搏细胞方向的诱导分化及鉴定骨髓间充质干细胞加入Transwell小室，密度为每孔IX IO4个细胞。将种植细胞的Transwell小室插入生长窦房结细胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培养箱中培养。M小时后，施加IOmmol/L的5-氮杂胞苷(Sigma)结合1(Γ8Μ的内皮素_1 (Tocris)，连续培养7 天后进行诱导细胞的检测鉴定。倒置相差显微镜可以观察到单个细胞的搏动，细胞形态大部分为梭形和三角形。 免疫细胞化学检测结果发现细胞HCN2、HCN4、CX30. 2、CX45 (Abeam公司)的表达阳性；全细胞膜片钳技术检测单个细胞的动作电位，显示舒张末期有自动去极化，证明诱导后细胞为起搏细胞。(2)骨髓间充质干细胞向心脏传导细胞方向的诱导分化及鉴定骨髓间充质干细胞加入Transwell小室，密度为每孔IX IO4个细胞。将种植细胞的"Transwell小室插入生长心耳肌细胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培养箱中培养。M小时后，向上述六孔板和Transwell小室加入旁分泌因子内皮素-I(Tocris)和神经调节蛋白-1 (RD公司)，使其终浓度为10_8M，连续培养7天后进行诱导细胞的检测鉴定。倒置相差显微镜可以观察到单个细胞的搏动，细胞形态大部分为梭形和三角形。 免疫细胞化学检测诱导前后细胞缝隙连接蛋白40(CX40)和HCN2(Abcam公司)的表达，结果显示CX40和HCN2的阳性表达明显升高(ρ < 0. 05)，表明骨髓间充质干细胞已经向心脏传导细胞方向转化。全细胞膜片钳技术检测单个细胞的动作电位，显示舒张末期有自动去极化，证明诱导后细胞为传导细胞。实施例2 诱导获得的犬心脏起搏细胞和传导细胞种植到胶原海绵构建组织工程
化房室结1.组织工程化房室结的构建(1)胶原海绵准备胶原蛋白来源于牛跟腱的I型胶原，胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提供。将胶原海绵剪成1. 5X1. 0X0. 2cm大小，用钴6(1照射12小时以上消毒备用。(2)犬心脏起搏细胞和传导细胞混合液接种胶原海绵
分别取诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞，加0. 25%胰酶(Gibco公司)1ml，于 37°C,5% CO2培养箱中消化1-2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含 10% FBS的DMEM/F12培养基(Gibco公司)Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液， IOOOrpm离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为IXlO6个/ml，将两种细胞按一定的比例(1 1 1 2)混合制成混合细胞悬液，置4°C冰箱保存备用。于6孔培养板底滴加50 μ 1的混合细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的混合细胞悬液，置于 37°C，含5% CO2的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml新鲜含10%胎牛血清的培养液，继续置于37°C，含5% CO2的培养箱中培养2周，每2天换一次液。2.组织工程化房室结的检测鉴定(I)HE染色观察心脏起搏细胞和传导细胞在胶原海绵上的生长将上述生长2周的心脏起搏细胞、传导细胞和胶原海绵复合体制备成石蜡切片进行HE染色，步骤如下苏木素液染lOmin，自来水冲洗，75 %盐酸乙醇溶液分化30s，水洗 lh，95%乙醇1 2min，伊红复染1 2min，95%乙醇1 2min，脱水透明，中性树胶封片。 通过HE染色观察细胞胶原海绵复合体中种子细胞生长均勻、接触紧密，心脏起搏细胞和传导细胞与胶原海绵复合良好。(2)光学电位检测仪(Optical mapping)和多导生理仪检测细胞胶原海绵复合体的起搏特性和传导速率使用光学电位检测仪可检测到胶原海绵复合体的起搏电位，多导生理仪检测细胞胶原海绵复合体传导速率，结果显示电冲动的传导速度为0. 014士0. OOlm/s，类似在体房室结区电位和传导速率，证明所构建细胞胶原海绵复合体(组织工程化房室结)具有类似心脏房室结的特性。实施例3 组织工程化房室结移植体内观察传导效果通过开胸手术将上述构建成功的组织工程化传导束移植到犬(第二军医大学实验动物中心，15千克)房室交界处的心外膜下，即将组织工程化传导束连接到心脏冠状沟两侧房室心肌中，显微外科缝合；移植前3天开始应用环孢素A (北京双鹭药业股份有限公司，剂量为0. 25mg/天)和泼尼松龙(上海通用药业股份有限公司，剂量为0. Img/天)抑制免疫排斥反应。结果显示本发明的组织工程房室结可以在宿主心肌中存活，移植组织中的细胞和宿主心肌细胞形成了电机械藕联；移植一个月后给动物造房室传导阻滞，心电图(奥尔科特生物有限公司)监测显示组织工程化房室结可改善房室间传导，证实所构建的组织工程化房室结具有再建心脏房室传导通路的潜能。
权利要求
1.一种组织工程化房室结的构建方法，包括如下步骤A、与窦房结细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为起搏细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取窦房结组织进行原代培养获得窦房结细胞，然后利用细胞培养池将窦房结细胞与骨髓间充质干细胞共培养，并且在培养液中添加 lOmmol/L的5-氮杂胞苷结合1(Γ8Μ的内皮素_1，培养时间6_7天，诱导骨髓间充质干细胞为心脏起搏细胞；B、与心耳肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取心耳部位组织进行原代培养获得心耳肌细胞，然后利用细胞培养池将心耳肌细胞与骨髓间充质干细胞共培养，并且施加旁分泌因子内皮素-1和神经调节蛋白-1，浓度均为1 X IO-8M-L 5 X 10 培养时间6_7天，诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞；C、利用胶原海绵和诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程化房室结将诱导成功的心脏起搏细胞和传导细胞按1 1 1 2制备成混合细胞悬液，混合细胞悬液的浓度范围1 X IO6个/ml-1. 2X IO6个/ml，采用沉淀法种植该混合细胞到胶原海绵支架上，种植密度为3 X IO5个/cm3-6 X IO5个/cm3，定期更换培养液在体外条件下培养15 天。
2.根据权利要求1所述的组织工程化房室结的构建方法，其特征在于其中所述的窦房结细胞、心耳肌细胞、骨髓间充质干细胞来源于犬、大鼠、兔子或小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的组织工程化房室结的构建方法，其特征在于其中的步骤 C具体为将胶原海绵剪成1. 5 X 1. 0X0. 2cm大小，用钴6°照射12小时以上消毒备用；分别取诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞，加0. 25%胰酶1ml，于37°C、5% CO2培养箱中消化1-2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含10% FBS的DMEM/ F12培养基Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为IX IO6个/ml， 将两种细胞按1 1 1 2混合制成混合细胞悬液，置4°C冰箱保存备用；于6孔培养板底滴加50 μ 1的细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的细胞悬液，置于37°C，含5% CO2的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml含10% FBS的新鲜培养液，继续置于37°C、5% CO2的培养箱中培养两周，每两天换一次液。
4.根据权利要求1至3任一构建方法制备得到的组织工程化房室结。
5.一种如权利要求4所述的组织工程化房室结在制备治疗房室传导阻滞疾病移植体中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医学工程技术领域，目前国内、外尚无构建组织工程化房室结的研究报道。本发明提供了一种利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程化房室结的方法。本发明采用与窦房结细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为起搏细胞，与心耳肌细胞共培养的方法诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞。将此两种细胞作为种子细胞，胶原海绵作为支架，在体外构建具有起搏特性及心电传导特性的组织工程化房室结。本发明经动物实验将构建成功的组织工程化房室结移植治疗房室传导阻滞取得良好的治疗效果。本发明获取了一种具有心电传导特性、可用于治疗移植的组织工程化房室结，为治疗心脏房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。
文档编号A61L27/24GK102488923SQ201110415250
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者刘镇, 姬瑞娟, 张传森, 张喜, 张璐萍, 李玉泉, 杨向群, 郭金萍, 黄会龙 申请人:中国人民解放军第二军医大学