专利名称：间充质干细胞在干燥综合征中的应用的制作方法
技术领域：
本研究涉及人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)抑制干燥综合征(SjGgren's Syndrome，SS)患者T细胞的免疫调节功能及其在SS 小鼠中的治疗作用。
背景技术：
MSCs是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可从血液、肝脏、骨髓、脂肪、皮肤等 多种组织获得，是一群多潜能细胞，可以向多种组织细胞如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪 等分化。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随 着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs， 并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。其他方法如从脐带血和外周 血中培养MSCs具有一定难度，且MSCs在足月分娩的脐带血或动员的外周血中数量尚存在 争议。因此，从分娩后的废弃材料脐带中分离培养UCMSCs，为MSCs的应用提供了新的材料 来源和基础资料。SS是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为特征的全身性自身免疫疾病。该病最 常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴系统、血管及肝脏等器官。此病无明 显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁，特别是绝经后的女性居多，男女之比 为1 :9。在我国的患病率为0.77%，在老年人群中的患病率高达4%，全国有近1000万患 者。现有SS的治疗方法包括传统的免疫抑制剂及生物制剂，存在副作用大、价钱高等弊端， 为此需要不断寻求更经济有效且无明显副作用的治疗方法。NOD小鼠是目前国际上比较公 认的SS自发鼠模型。已有的研究证实，MSCs具有免疫调节功能，多项研究表明MSCs可抑制 多种自身免疫病患者T细胞的增殖及炎性细胞因子的分泌。为此，本课题组利用UCMSCs在 体外与SS患者T细胞共培养，并将UCMSCs移植到NOD体内，观察UCMSCs在SS治疗中的作 用。发现UCMSCs可抑制T细胞的免疫功能并明显改善了 NOD的唾液流率及组织病理。为 UCMSCs治疗SS的临床应用提供依据。

发明内容
本研究利用UCMSCs在体外与SS患者T细胞共培养，并将UCMSCs移植到NOD小鼠 体内，观察其在SS治疗中的作用。发现UCMSCs可抑制T细胞的增殖，抑制炎性细胞因子 (TNF- α、IL-6、IFN- γ )的分泌，上调IL-10的表达，上调CD4+F0XP3+Treg细胞的表达，并明 显改善了 NOD的唾液流率及组织病理。为UCMSCs治疗SS的临床应用提供依据。


图1. UC-MSCs的鉴定㈧UCMSCs形态特征(第三代)⑶流式细胞术细胞表型 分析(C) :UCMSCs的脂肪诱导分化-油红0染色(D) :UCMSCs的成骨诱导分化-碱性磷酸酶 染色
图2. UC-MSCs对NOD小鼠的治疗作用(A)无论在4周及8周给药，UC-MSCs均能 明显抑制NOD小鼠唾液流量的下降，*P < 0. 05，< 0. 01 (B)无论在4周及8周给药， UC-MSCs均能明显降低NOD小鼠血清中SS相关抗体的表达，*P < 0. 05，**P < 0. 01 (C)组 织病理学显示，UC-MSCs能明显改善NOD小鼠颂下腺灶性淋巴细胞的浸润图3. UC-MSCs对NOD小鼠的脾脏单个核细胞(MNCs)的免疫调节功能(A) =UCMSCs 治疗组丽Cs的增殖能力较PBS组明显降低，< 0.01 (B) =UCMSCs治疗组丽Cs中调节性 T细胞(Treg)的表达较PBS组明显上调，*P < 0. 05(C)在体外，将未干预的16周龄NOD 小鼠丽Cs与UCMSCs共培养，可见UCMSCs能明显上调Treg的表达，**P < 0. 01图4. UC-MSCs对NOD小鼠细胞因子分泌的影响(A) =UC-MSCs可下调NOD小鼠血 清中IL-6的表达，< 0. 01 (B) =UCMSCs治疗组与PBS组相比，MNCs细胞上清中IL-6表 达下调，IL-10表达上调，< 0.01(C)在体外，将未干预的16周龄NOD小鼠MNCs与 UCMSCs共培养，可见UCMSCs能明显下调TNF-α、IFN-γ的表达，上调IL-10的表达，**Ρ
<0. OIUC-MSCs对SS患者T细胞的影响(A) =UC-MSCs可抑制T细胞的增殖，并呈剂量依 赖性，*Ρ < 0. 05，< 0. 01 (B)抗IL-10单抗可逆转UC-MSCs对T细胞增殖的抑制作 用，#P< 0.01(C):优1^08与1~细胞共培养，可下调1顺-0的表达，上调IL-10的表达，*Ρ
<0. 05 (D) =UCMSCs能明显上调SS患者Treg的表达，*Ρ < 0. 0具体实施例方式实施例1 脐带间充质干细胞的分离、培养。a.取正常阴道分娩或剖腹产脐带，经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测，HLA分型 检测，梅毒抗体检测，HIV免疫检测，CMV抗体检测，乙型肝炎抗原抗体检测)确定安全后，无 菌生理盐水冲洗去除肉眼可见污物及血液。 b.无菌手工剪脐带至3-5mm大小。c.将步骤b中获得的组织块，转移入50ml离心管中，加入含青链霉素的 PBS40ml，室温离心250g 5分钟，弃上清。d.步骤c所获组织块用10% α MEM培养，每3天换液。e.至7天左右组织块周围有梭形及多角形细胞爬出，且逐渐增多。f.至10-14天左右细胞达80%左右融合时，用0. 25%胰酶消化传代。g.以后每隔3-5天传代一次。h.至第三代鉴定。i.经鉴定后的细胞继续培养备用或冻存。见图1。实施例2 =UCMSCs对NOD小鼠的治疗作用该实验分为预防组及治疗组。预防组选取4周龄雌性NOD小鼠20只，治疗组选取 8周龄雌性NOD小鼠20只。各组内20只小鼠随机分为2组。分别给予UC-MSCs及PBS。腹 腔注射1Χ 106/100ιι1细胞，共一次。每两周进行唾液流量测定。至第16W结束观察。留取 小鼠血清，颂下腺组织及脾细胞，ELISA检测小鼠血清SS相关抗体，HE染色做颂下腺病理学 分析。结果显示治疗组及预防组NOD小鼠，UC-MSCs均能明显增加其唾液流量；能明显降低 NOD小鼠血清中抗体的表达；组织病理学显示，UC-MSCs能明显改善NOD小鼠颂下腺灶性淋
4巴细胞的浸润。见图2。实施例3 =UCMSCs对NOD小鼠MNCs的免疫调节功能(A)取UCMSCs治疗组及PBS组MNCs，4 X IO5/孔接种于96孔板中，每孔均加 ConA (2 μ g/ml)刺激。120小时，3H掺入法检测T细胞增殖情况。UCMSCs治疗组的MNCs增 殖能力较PBS组明显降低(B)同理，取UCMSCs治疗组及PBS组MNCs，2X IO6/孔接种于 24孔板，48小时后，流式细胞术检测小鼠脾细胞Treg的表达，UCMSCs治疗组MNCs中Treg 的表达较PBS组明显上调(C):在体外，将未干预的16周龄NOD小鼠MNCs(1X106/^L) 与UCMSCs (2 X IO4/孔)共培养，48小时后，流式细胞术检测小鼠脾细胞Treg的表达，可见 UCMSCs能明显上调Treg的表达。见图3。实施例4 =UCMSCs对NOD小鼠细胞因子分泌的影响(A)实验结束时，留取小鼠血清，ELISA检测小鼠血清中细胞因子分泌，发现 UC-MSCs可下调NOD小鼠血清中IL-6的表达(B)取UCMSCs治疗组及PBS组MNCs，2 X IO6/ 孔接种于24孔板，48小时后，收取细胞上清，检测细胞因子，结果显示UCMSCs治疗组与PBS 组相比，MNCs细胞上清中IL-6表达下调，IL-10表达上调(C)在体外，将未干预的16周龄 NOD小鼠MNCs (1 X IO6/孔)与UCMSCs (2 X IO4/孔)共培养，48小时后，检测细胞上清中细 胞因子，可见UCMSCs能明显下调TNF-α、IFN-γ的表达，上调IL-10的表达。见图4。实施例5 =UC-MSCs对SS患者T细胞的影响(A)分离SS患者外周血PBMC，磁珠分选⑶3+Τ细胞。分成两组，一组为UCMSCs 与τ细胞共培养组，一组为单纯T细胞对照组，两组均加⑶3/⑶28 (5 μ g/ml)刺激。120小 时，3H掺入法检测T细胞增殖情况。结果发现无论UCMSCs与T细胞是否接触，共培养组T 细胞增殖受到明显抑制，且呈剂量依赖性。(B)在UCMSCs与T细胞共培养体系中，加入抗 IL-10单抗(10 μ g/ml)，可逆转UC-MSCs对T细胞增殖的抑制作用(C)将SS患者T细胞 (1X106/孔)与UCMSCs (2X IO4/孔)共培养，48小时后，检测细胞上清中细胞因子，可见 UCMSCs可下调TNF- α的表达，上调IL-10的表达(D)将SS患者T细胞(1 X IO6/孔)与 UCMSCs (2 X IO4/孔)共培养，48小时后，流式细胞术检测Treg的表达，UCMSCs能明显上调 SS患者Treg的表达。见图5。
权利要求
各种来源的间充质干细胞。
2.权利要求1的间充质干细胞在治疗干燥综合征中的用途。
3.权利要求1的间充质干细胞施用给干燥综合征患者。
4.权利要求1的间充质干细胞在治疗其它自身免疫病中的用途。
5.权利要求1的间充质干细胞施用给其它自身免疫病患者。
全文摘要
本发明证实间充质干细胞可用于干燥综合征的治疗。其特征在于抑制干燥综合征的异常免疫反应，从根本上控制本病的发展。
文档编号A61K35/44GK101974483SQ201010503679
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者何菁, 刘燕鹰, 栗占国 申请人:北京大学人民医院