专利名称：三环酰胺类用于抑制g－蛋白功能及治疗增生疾病的制作方法
背景Ras致癌基因的生物学意义、及Ras以及称之为法呢基蛋白转移酶的酶在正常细胞转化成癌细胞过程中的作用，在PCT国际公开号Nos.WO95/00497和WO95/10516上作了描述。这些专利中的每个也描述了一类独特的化合物，它们抑制法呢基蛋白转移酶的活性，从而抑制Ras蛋白的法呢基化。
PCT国际公开号No.WO95/10516涉及通式(1.0)的三环酰胺和脲类化合物，及它们在抑制Ras功能和细胞异常生长方法中的应用。也描述了通式(1.0)的一些亚类化合物，
它们包括式(5.0c)、(5.1c)和(5.2a)以及化合物(5.0c)和(5.1c)的11-R-异构体和11-S-异构体。本发明也描述了该通式各亚类中的一些具体化合物，以及这些化合物的生物活性。
发明摘要本发明给出了选自下组化合物中的新颖三环酰胺化合物，该组化合物包括
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体；(-)-对映体；
(+)-对映体；
或其可供药用的盐。
于25℃在甲醇或乙醇中测定化合物的旋光度((+)-或(-)-)。
本发明包括以上化合物的无定形态或结晶态。
因此，本发明的化合物包括选自下组化合物化合物1.0，2.0，3.0，5.0，6.0，7.0，7.0A，8.0，8.0A，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，15.0，16.0和17.0，或其可药用的盐，其中所说的化合物如上所定义。
本发明的化合物也包括选自下组的化合物化合物18.0，19.0，20.0，21.0，22.0，23.0，24.0，25.0，26.0，27.0，28.0，29.0，30.0，31.0，32.0，33.0，34.0，35.0，36.0，37.0，38.0，39.0，40.0和41.0，或其可药用的盐，其中所说的化合物如上所定义。
本发明的化合物也包括选自下组的化合物“(+)-对映体化合物70.0，71.0，72.0，73.0，74.0，75.0，76.0，77.0，78.0，79.0和80.0，或其可药用的盐，其中所说的化合物如上所定义。
本发明的化合物还包括选自下组的化合物化合物42.0，43.0，44.0，45.0，46.0，47.0，48.0，49.0，50.0，51.0，52.0，53.0，54.0，55.0，56.0，57.0，58.0，59.0，60.0，61.0，62.0，63.0，64.0，65.0，66.0，67.0，68.0和69.0，或其可药用的盐，其中所说的化合物如上所定义。
优选化合物包括有(-)-旋光度的3，7，8-三卤代化合物。例如，化合物22.0，23.0，25.0和27.0。
优选化合物也包括有(+)-旋光度的3，8，10-三卤代化合物。例如，化合物29.0，31.0，32.0，34.0，36.0，37.0，39.0和41.0。
优选化合物也包括有(+)-旋光度的3，10-二卤代化合物。例如，化合物20.0。
优选化合物也包括在C-11-位上有S-立体化学的3，7-二溴-8-氯化合物。例如，化合物50.0，53.0，55.0和57.0。
优选的化合物也包括在C-11-位上有R-立体化学的3，10-二溴-8-氯化合物。例如，化合物62.0，64.0，66.0和68.0。
优选的化合物也包括化合物16.0，17.0，39.0，40.0，41.0，68.0和69.0。
更优选的化合物是化合物16.0，39.0，40.0，68.0和69.0。最优选的化合物是化合物16.0，39.0和68.0。甚至更优选的化合物是化合物39.0和68.0。
本领域的技术人员明白三环体系如下编排位号
本领域的技术人员也知道在C-11-位的S-和R立体化学是
本发明的三环化合物对法呢基蛋白转移酶的抑制作用以前未曾有报道。因此，本发明提供了用本发明的三环化合物抑制法呢基蛋白转移酶的方法它们，(i)在体外，有效地抑制法呢基蛋白转移酶，但不抑制牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶I；(ii)阻断由作为法呢基受体的转化Ras形式诱导的表型变化，但该表型变化不是由基因工程的牻牛儿基牻牛儿基受体的转化Ras形式诱导；(iii)阻断Ras的胞内过程，该Ras是一种法呢基受体，但不是Ras基因工程改造的牻牛儿基牻牛儿基受体；及(iv)阻断由转化Ras诱导的在培养基中异常的细胞生长。本发明的化合物已表明在动物模型中具有抗肿瘤活性。
本发明提供了一种抑制细胞异常生长的方法，包括转化了的细胞，该方法是通过给以有效量的本发明的化合物。细胞的异常生长指的是不依赖于正常调节机制的细胞生长(例如，丧失接触抑制)。这包括如下的异常生长(1)肿瘤细胞(肿瘤)表达的一种激活的Ras致癌基因；(2)肿瘤细胞，其中Ras蛋白作为在另一种基因中的致癌基因突变的结果而被激活；和(3)其他增生疾病的良性和恶性的细胞，其中发生了异常的Ras激活。
本发明也提供了一种抑制肿瘤生长的方法，该方法是通过给需要这种治疗的哺乳动物(例如，人)以有效量的这里所描述的三环化合物。特别是，本发明通过给以有效量的上述化合物，提供了一种抑制表达一种激活了的Ras致癌基因的肿瘤生长的方法。这些可被抑制的肿瘤包括，但不局限于，肺癌(肺腺癌)，胰腺肿瘤(例如，胰腺癌，如外分泌的胰腺癌)，结肠癌(例如，直肠癌，如结肠腺癌和结肠腺瘤)，髓样白血病〔例如，急性髓样白血病(AML)〕，甲状腺滤泡癌，脊髓发育不良综合征(MDS)，膀胱癌，表皮癌，乳腺癌和前列腺癌。
据信，本发明也提供了一种抑制良性和恶性增生疾病的方法，其中Ras蛋白作为其他基因中的致癌基因突变的结果被异常地激活了，即，Ras基因本身不会被突变激活成一种致癌基因的形式，而这是通过给需要该种治疗的哺乳动物(例如人)以有效量的这里所述的三环化合物来实现所说的抑制作用。例如，良性增生疾病多发性神经纤维癌，或肿瘤，其中Ras由于酪氨酸激酶致癌基因(例如，neu，src，abl，lck和fyn)突变或过度表达而被激活。
本发明的化合物抑制法呢基蛋白转移酶和致癌基因蛋白Ras的法呢基化作用。本发明还进一步提供了一种抑制哺乳动物，特别是人的Ras法呢基蛋白转移酶的方法，该方法通过给以上述有效量的三环化合物而实现抑制作用。将本发明的化合物给药于病人，来抑制法呢基蛋白转移酶，可用于治疗上述肿瘤。
用于本发明方法的三环化合物可抑制细胞的异常生长。由于不希望被理论所束缚，据信这些化合物可以通过抑制G-蛋白功能而发挥作用，例如抑制ras p21，通过阻断G-蛋白的异戊二烯化，这样使其可用于治疗增生疾病，例如肿瘤生长和癌。由于不希望被理论所束缚，据信这些化合物抑制ras法呢基蛋白转移酶，因此对ras转化细胞显示抗增生活性。发明详述这里所使用的下列术语定义如下，除非另有注明。
M+代表质谱图中分子的分子离子峰；MH+代表质谱图中分子的分子离子加上氢；吡啶-N-氧化物在这里代表基因
下列溶剂和试剂在文中用缩写表示四氢呋喃(THF)；乙醇(EtOH)；甲醇(MeOH)；乙酸(HOAc或AcOH)；乙酸乙酯(EtOAc)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；三氟乙酸(TFA)；三氟乙酸酐(TFAA)；1-羟基苯并三唑(HOBT)；间氯过氧苯甲酸(MCPBA)；三乙胺(Et3N)；乙醚(Et2O)；氯甲酸乙酯(ClCO2Et)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(DEC)；二并丁基氢化铝(DIBAL)；异丙醇(i-PrOH)；二甲亚砜(DMSO)。
本发明的一些化合物可以以不同的异构体形式存在(例如，对映体或非对映体)，包括阻转异构体(即其中七员环是在固定构象中存在的化合物，由于10-溴取代基的存在，致使11-碳原子位于稠合的苯环的平面上或平面下)。本发明期望所有的异构体，或是纯的形式或是混合物，包括外消旋混合物，烯醇式也包括在内。
一些碱性三环化合物也形成可药用的盐，例如，酸加成盐。譬如，吡啶并-氮原子可以和强酸形成盐。适合形成盐的酸的例子有盐酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，苹果酸，富马酸，肉桂酸，抗坏血酸，马来酸，甲磺酸及其他本领域常见的无机酸和羧酸。盐的制备方法是，用常规的方法使游离碱和足够量的所要的酸接触以生成盐。游离的碱形式可通过合适的稀碱水溶液处理盐而再生，这些碱例如，为稀NaOH水溶液，碳酸钾，氨和碳酸氢钠水溶液。游离碱形式不同于它们各自的盐形式在于一些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度，但是从发明的目的来说，酸和碱的盐和各自的游离碱形式是等价的。
所有的盐在发明范围内为可药用的盐，而且，从发明的目的来说，全都被认为与相应的化合物的游离碱形式是等价的。
本发明的化合物可通过下述方法制备。
实施例10的化合物是以晶体状态得到的。本领域的技术人员知道，以无定形状态得到的化合物可以得到其晶体形式，方法是按照本领域中熟知的方法，以溶剂或混合溶剂中，如丙酮，乙醚，乙酸乙酯，乙醇，2-丙醇，叔丁醚，水，等等结晶该无定形的原料。
本领域的技术人员也知道化合物7.0A外消旋混合物可以按照下述方法制备。例如，制备实例6的中间体可以用来制备化合物7.0A。
制备实例1
步骤A
于-20℃混合10g(60.5mmol)4-吡啶乙酸乙酯和120ml无水二氯甲烷，加入10.45g(60.5mmol)MCPBA，于-20℃搅拌1小时，然后于25℃搅拌67小时。再加另外的3.48g(20.2mmol)MCPBA，25℃搅拌24小时。用CH2Cl2稀释，饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后水洗。MgSO4干燥，真空浓缩得残余物，色谱分离〔硅胶，2％-5.5％(10％NH4OH的MeOH溶液)/CH2Cl2〕得8.12g产物。质谱MH+＝182.15。步骤B
混合3.5g(19.3mmol)步骤A的产物。17.5ml EtOH和96.6ml10％的NaOH水溶液，并于67℃加热2小时。加入2N HCl水溶液调节pH＝2.37，真空浓缩得残余物。加200ml无水EtOH，硅藻土过滤，用无水EtOH(2×50ml)洗涤滤饼。真空浓缩合并的滤液，得2.43g标题化合物。
制备实例2
通过公开于PCT国际公开号WO 95/10516中的方法制备标题化合物。
制备实例3
步骤A
混合14.95g(39mmol)的8-氯-11-(1-乙氧基羰基-4-哌啶基)-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2-b]吡啶和150ml CH2Cl2，然后加入13.07g(42.9mmol)的(n-Bu)4NNO3，并冷却混合物至0℃。于1.5小时内慢慢加入(逐滴)6.09ml(42.9mmol)的TFAA在20ml二氯甲烷的溶液。于0℃保持混合物过夜，然后依次用饱和NaHCO3(水溶液)，水和饱和食盐水洗涤。Na2SO4干燥有机相，真空浓缩得残余物，色谱分离(硅胶，乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)分别得到4.32g 3A(i)和1.903A(ii)两种产物。
化合物3A(i)的质谱MH+＝428.2。
化合物3A(ii)的质谱MH+＝428.3。步骤B
混合22.0g(51.4mmol)步骤A的产物3A(i)，150ml 85％EtOH(水溶液)，25.85g(0.463mol)Fe粉和2.42g(21.8mmol)CaCl2并加热回流过夜。加入12.4g(0.222mol)的Fe粉和1.2g(10.8mmol)Call2，加热回流2小时。再加入12.4g(0.222mol)Fe粉和1.2g(10.8mmol)CaCl2，再加热回流2小时。通过硅藻土过滤热溶液，用50ml热EtOH洗涤硅藻土，真空浓缩滤液得残余物，加入100ml无水EtOH，浓缩得残余物，色谱分离残余物(硅胶，MeOH/CH2Cl2梯度洗脱)得16.47g产品化合物。MH+＝398。步骤C
混合16.47g(41.4mmol)步骤B的产物，和150ml 48％NBr(水溶液)并冷却至-3℃。慢慢加入(逐滴)18ml溴，然后慢慢加入(逐滴)8.55g(0.124mol)NaNO2的85ml水溶液。于-3℃～0℃搅拌45分钟，然后加入50％NaOH(水溶液)调节pH＝10。用EtOAc萃取，用饱和食盐水洗涤萃取液并用Na2SO4干燥萃取液。浓缩得残余物并色谱分离(硅胶，EtOAc/己烷梯度洗脱)，分别得到10.6g 3C(i)和3.28g 3C(ii)两个产品化合物。
化合物3C(i)的质谱MH+＝461.2。
化合物3C(ii)的质谱MH+＝539。步骤D
将步骤C的产物3C(i)溶于浓HCl并于约100℃加热16小时水解，冷却混合物，用1M NaOH(水溶液)中和。用CH2Cl2萃取，MgSO4干燥萃取液，过滤并真空浓缩，得标题化合物。
质谱MH+＝466.9。
制备实例4
步骤A
于-5℃混合25.86g(55.9mmol)4-(8-氯-3-溴-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-1-羧酸乙酯和250ml浓H2SO4，然后加入4.8g(56.4mmol)NaNO3并搅拌2小时。将反应混合物倾入至600g冰中，用浓NH4OH(水溶液)碱化。过滤混合物，用300ml水洗，然后用500ml CH2Cl2萃取。用200ml水洗涤萃取液，MgSO4干燥，然后过滤并真空浓缩得到残余物。色谱分离残余物(硅胶，10％EtOAc/CH2Cl2)得24.4g(86％产率)产物。m.p.＝165～167℃，质谱MH+＝506(CI)。元素分析计算值，C，52.13；H，4.17；N，8.29。
实测值，C，52.18；H，4.51；N，8.16。步骤B
于20℃混合20g(40.5mmol)步骤A的产物和200ml浓H2SO4，然后冷却至0℃。加入7.12g(24.89mmol)1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲至混合物中并于20℃搅拌3小时。冷却至0℃，加入另外1.0g(3.5mmol)二溴乙内酰脲并于20℃搅拌2小时。将混合物倾入至400g冰中，用浓NH4OH(水溶液)于0℃时碱化，过滤收集析出的固体。用300ml水洗涤固体，放入200ml丙酮中形成淤浆，过滤，得19.79g(85.6％产率)产物。m.p.＝236～237℃，质谱MH+＝584(CI)。元素分析计算值，C，45.11；H，3.44；N，7.17。
实测值，C，44.95；H，3.57；N，7.16。步骤C
于50℃混合25g(447mmol)Fe屑，l0g(90mmol)CaCl2和20g(34.19mmol)步骤B的产物在700ml 90∶10 EtOH/H2O中的悬浮液。加热混合物回流过夜，通过硅藻土过滤并用2×200ml热EtOH洗涤滤饼。合并滤液和洗涤液并真空浓缩得残余物。用600ml CH2Cl2萃取残余物，用300ml水洗涤，MgSO4干燥。过滤，真空浓缩得残余物，色谱分离(硅胶，30％EtOAc/CH2Cl2)得11.4g(60％产率)产物。m.p.＝211～212℃，质谱MH+＝554(CI)。元素分析计算值，C，47.55；H，3.99；N，7.56。
实测值，C，47.45；H，4.31；N，7.49。步骤D
于-10℃向8g(116mmol)NaNO2的120ml浓HCl(水溶液)溶液中，慢慢加入(分批)20g(35.9mmol)步骤C的产物。将所得混合物于0℃搅拌2小时，然后在0℃于1小时内慢慢加入(逐滴)150ml(1.44mol)50％H3PO2。于0℃搅拌3小时，然后倾入至600g冰中并用浓NH4OH(水溶液)碱化。用2×300ml CH2Cl2萃取。MgSO4干燥，然后过滤，真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，25％EtOAc/己烷)得13.67g(70％产率)产物。m.p.＝163～165℃，质谱MH+＝539(CI)。元素分析计算值，C，48.97；H，4.05；N，5.22。
实测值，C，48.86；H，3.91；N，5.18。步骤E
混合6.8g(12.59mmol)步骤D的产物和100ml浓HCl(水溶液)并于85℃搅拌过夜。将混合液冷却，倾入至300g冰中并用浓NH4OH(水溶液)碱化。用2×300ml CH2Cl2萃取，MgSO4干燥。过滤，真空浓缩得残余物，色谱分离(硅胶，10％ MeOH/EtOAc+2％NH4OH(水溶液))得5.4g(92％产率)标题化合物。m.p.＝172～174℃，质谱MH+＝467。元素分析计算值，C，48.69；H，3.65；N，5.97。
实测值，C，48.83；H，3.80；N，5.97。
制备实例5
步骤A
通过基本上如制备实例3、步骤D所描述的相同方法，水解2.42g的4-(8-氯-3-溴-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2，-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-1-羧酸乙酯，得1.39g(69％产率)产物。MH+＝389。步骤B
混合1g(2.48mmol)步骤A的产物和25ml无水甲苯，加入2.5ml1M DIBAL的甲苯溶液并加热回流混合物。0.5小时后，加入另一份2.5ml 1M DIBAL的甲苯溶液并加热回流1小时。(TLC检测反应，用50％MeOH/CH2Cl2+NH4OH(水溶液))。冷却混合物至室温，加入50ml 1N HCl(水溶液)并搅拌5分钟，加入100ml 1N NaOH(水溶液)，然后用EtOAc(3×150ml)萃取。用MgSO4干燥萃取液，过滤，真空浓缩得1.1g标题化合物。MH+＝391。
制备实例6 步骤A
混合16.6g(0.03mol)制备实例4、步骤D的产物和CH3CN/H2O的3∶1溶液(212.65ml CH3CN+70.8ml H2O)并于室温搅拌该淤浆状混合物过夜。加入32.833g(0.153mol)NaIO4，然后加入0.31g(2.30mmol)RuO2并于室温搅拌(加入RuO2时伴随着放热反应，温度从20℃上升到30℃)。搅拌混合物1.3hrs。(约30分钟后温度下降至25℃)，然后过滤除去固体并用CH2Cl2洗涤固体。真空浓缩滤液得残余物，用CH2Cl2溶解残余物。过滤除去不溶物并用CH2Cl2洗涤固体。水洗滤液，浓缩至体积约为200ml，用漂白剂洗涤，然后用水洗。用6NHCl(水溶液)萃取。将水萃取液冷至0℃，慢慢加50％NaOH(水溶液)以调节pH＝4，同时保持温度＜30℃。用CH2Cl2萃取两次，MgSO4干燥，真空浓缩得残余物。将残余物于20ml乙醇中形成淤浆并冷至0℃。过滤收集生成的固体，真空干燥得7.95g产物。
1H NMR(CDCl3，200MHz)8.7(s，1H)；7.85(m，6H)；7.5(d，2H)；3.45(m，2H)；3.15(m，2H)。步骤B
混合21.58g(53.75mmol)步骤A的产物和500ml EtOH和甲苯的1∶1无水混合物，加入1.43g(37.8mmol)NaBH4并加热回流混合物10分钟。冷却混合物至0℃，加入100ml水，然后用1M HCl(水溶液)调节pH≈4～5并同时保持温度＜10℃。加250ml EtOAc，分离水层和有机层。有机层用饱和食盐水(3×50ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥。真空浓缩得残余物(24.01g)，色谱分离残余物(硅胶，30％己烷/CH2Cl2)，得产物。不纯的分离组份再次分离纯化，共得18.57g产物。
1H NMR(DMSO-d6，400MHz)8.5(s，1H)；7.9(s，1H)；7.5(d of d，2H)；6.2(s，1H)；6.1(s，1H)；3.5(m，1H)；3.4(m，1H)；3.2(m，2H)。步骤C
混合18.57g(46.02mmol)步骤B的产物和500ml CHCl3，然后加入6.70ml(91.2mmol)SOCl2并于室温搅拌4hrs。于5分钟内加入35.6g(0.413mol)哌嗪的800ml THF溶液并于室温搅拌1小时。加热混合物回流过夜。然后冷至室温并用1L CH2Cl2稀释混合物。用水(5×200ml)洗涤，用CHCl3(3×100ml)萃取水洗涤液。合并所有的有机溶液，用饱和食盐水(3×200ml)洗涤，MgSO4干燥。真空浓缩得残余物，色谱分离(硅胶，5％，7.5％，10％MeOH/CH2Cl2/+NH4OH梯度洗脱)得18.49g标题化合物的外消旋混合物。步骤D-对映体的分离
步骤C的外消旋标题产物的分离，是用制备的手性色谱(ChiralpackAD，5cm×50cm柱，流速100ml/分.，20％i-PrOH/己烷+0.2％二乙胺)，得9.14g(+)-对映体和9.30(-)-对映体。
(+)-对映体的物理化学数据m.p.74.5°～77.5℃；质谱MH+＝471.9；[α]D25＝+97.4°(8.48mg/2ml MeOH)。
(-)-对映体的物理化学数据m.p.82.9°～84.5℃；质谱MH+＝471.8；[α]D25＝-97.4°(8.32mg/2ml MeOH)。
制备实例7
步骤A
于-5℃混合15g(38.5mmol)4-(8-氯-3-溴-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-1-羧酸乙酯和150ml浓H2SO4，然后加入3.89g(38.5mmol)KNO3并搅拌4小时。将混合物倾入至3L冰中并用50％NaOH(水溶液)碱化。用CH2Cl2萃取，MgSO4干燥，然后过滤并真空浓缩得残余物。自丙酮重结晶残余物得6.69g产物。
1H NMR(CDCl3，200MHz)8.5(s，1H)；7.75(s，1H)；7.6(s，1H)；7.35(s，1H)；4.15(q，2H)；3.8(m，2H)；3.5-3.1(m，4H)；3.0-2.8(m，2H)；2.6-2.2(m，4H)；1.25(t，3H)。MH+＝506。步骤B
混合6.69g(13.1mmol)步骤A的产物和100ml 85％EtOH/H2O，然后加入0.66g(5.9mmol)CaCl2和6.56g(117.9mmol)Fe并加热混合物回流过夜。通过硅藻土过滤热反应混合物，用热EtOH洗涤滤饼。真空浓缩滤液得7.72g产物。质谱MH+＝476.0。步骤C
混合7.70g步骤B的产物和35ml HOAc，然后加入45ml Br2的HOAc溶液并于室温搅拌过夜。加入300ml 1N NaOH(水溶液)，然后再加入75ml 50％NaOH(水溶液)，用EtOAc萃取。MgOS4干燥并真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，20％～30％EtOAc/己烷)得3.47g产物(同时得到另外的1.28g部分纯化的产物)。质谱MH+＝554。1H NMR(CDCl3，300MHz)8.5(s，1H)；7.5(s，1H)；7.15(s，1H)；4.5(s，2H)；4.15(m，3H)；3.8(br s，2H)；3.4-3.1(m，4H)；9-2.75(m，1H)；2.7-2.5(m，2H)；2.4-2.2(m，2H)；1.25(m，3H).步骤D
混合0.557g(5.4mmol)亚硝酸叔丁酯和3ml DMF，并于60°～70℃加热混合物。慢慢加入(逐滴)2.00g(3.6mmol)步骤C的产物和4ml DMF的混合物，然后冷至室温。于40℃时加入0.64ml亚硝酸叔丁酯并重新加热混合物至60°～70℃0.5小时。冷至室温并倾入至150ml水中。用CH2Cl2萃取，MgSO4干燥，真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，10％～20％EtOAc/己烷)得0.74g产物。质谱MH+＝539.0。1H NMR(CDCl3，200MHz)8.52(s，1H)；7.5(d，2H)；7.2(s，1H)；4.15(q，2H)；3.9-3.7(m，2H)；3.5-3.1(m，4H)；3.0-2.5(m，2H)；2.4-2.2(m，2H)；2.1-1.9(m，2H)；1.26(t，3H).步骤E
混合0.70g(1.4mmol)步骤D的产物和8ml浓HCl(水溶液)并加热混合物回流过夜。加入30ml 1N NaOH(水溶液)，然后再加入5ml 50％NaOH(水溶液)并用CH2Cl2萃取。MgSO4干燥，真空浓缩得0.59g标题化合物。质谱MH+＝467。m.p.＝123.9°～124.2℃。
制备实例8
(+)-和(-)-对映体及外消旋体步骤A
制备从制备实例7的8.1g标题化合物在甲苯中的溶液，并加入17.3ml1M的DIBAL的甲苯溶液。加热混合物至回流，并于40分钟内慢慢加入(逐滴)21ml 1M DIBAL/甲苯溶液。冷却反应混合液至大约0℃并加入700ml HCl(水溶液)。分离并弃去有机相。用CH2Cl2洗涤水相，弃去萃取液，然后通过加入50％NaOH(水溶液)碱化水相。用CH2Cl2萃取，MgSO4干燥萃取液，真空浓缩得7.30g标题化合物，为对映体的外消旋混合物。MH+=469。步骤B-对映体的分离
将步骤A的外消旋标题混合物用制备手性色谱分离(ChiralpackAD，5cm×50cm柱，用20％i-PrOH/己烷+0.2％二乙胺)，得标题化合物的(+)-对映体和(-)-对映体。
(+)-对映体的物理化学数据m.p.＝148.8℃；质谱MH+＝469；[α]D25＝+65.6°(12.93mg/2ml MeOH)。
(-)-对映体的物理化学数据m.p.＝112℃；质谱MH+＝469；[α]D25＝-65.2°(3.65mg/2ml MeOH)。
制备实例9
(+)-和(-)-对映体及外消旋体步骤A
混合40.0g(0.124mol)的起始原料酮和200ml H2SO4并冷却至0℃。于1.5小时内慢慢加入13.78g(0.136mol)的KNO3，然后温热至室温并搅拌过夜。通过基本上如制备实例4、步骤A所描述的相同方法对反应进行后处理。色谱分离(硅胶，20％、30％、40％、50％EtOAc/己烷，然后100％EtOAc)得28g 9-硝基产物，及少量的7-硝基产物和19g 7-硝基和9-硝基化合物的混合物。MH+(9-硝基)＝367。步骤B
通过基本上如制备实例4、步骤C所描述的相同方法，将28g(76.2mmol)步骤A的9-硝基产物，400ml 85％EtOH/H2O，3.8g(34.3mmol)的CaCl2和38.28g(0.685mol)的Fe反应，得24g产物。MH+＝337。步骤C
混合13g(38.5mmol)步骤B的产物，140ml HOAc并于20分钟内慢慢加入2.95ml(57.8mmol)Br2的10ml HOAc溶液。室温搅拌反应混合物，然后真空浓缩得残余物。加入CH2Cl2和水，然后用50％NaOH(水溶液)调节pH＝8～9。用水洗涤有机相，然后用饱和食盐水并用Na2SO4干燥。真空浓缩得11.3g产物。
1H NMR(200MHZ，CDCl3)8.73(d，1H)；7.74(d，1H)；7.14(s，1H)；4.63(s，2H)；3.23-3.15(m，2H)；and 3.07-2.98(m，2H).步骤D
冷却100ml浓HCl(水溶液)至0℃，然后加入5.61g(81.4mmol)的NaNO2并搅拌10分钟。慢慢加入(分批)11.3g(27.1mmol)步骤C的产物并于0～3℃搅拌混合物2.25小时。慢慢加入(逐滴)180ml50％H3PO2(水溶液)并让混合物于0℃静置过夜。于30分钟内慢慢加入(逐滴)150ml 50％NaOH，以调节pH＝9，然后用CH2Cl2萃取。用水、然后用饱和食盐水洗涤萃取液，并用Na2SO4干燥。真空浓缩得残余物并色谱分离(硅胶，2％EtOAc/CH2Cl2)得8.6g产物。MH+＝399.9。
1H NMR(200MHZ，CDCl3)8.75(d，1H)；7.77(d，1H)；7.56(d，1H)；7.21(d，1H)；and 3.3-3.0(m，4H).步骤E
混合8.6g(21.4mmol)步骤D的产物和300ml MeOH并冷却至0°～2℃。加入1.21g(32.1mmol)的NaBH4并于～0℃搅拌混合物1小时。加入另一份0.121g(3.21mmol)的NaBH4，于0℃搅拌2小时，然后于0℃静置过夜。真空浓缩得残余物，然后在CH2Cl2和水之间分配残余物。分离有机相并真空浓缩(50℃)得8.2g产物。
1H NMR(200MHZ，CDCl3)8.44(d，1H)；7.63(d，1H)；7.47(d，1H)；7.17(d，1H)；6.56(d，1H)；4.17-4.0(m，1H)；7.39(d，1H)；3.46-3.3(m，1H)；3.05-2.74(m，2H).步骤F
混合8.2g(20.3mmol)步骤E的产物和160ml CH2Cl2，冷却至0℃，然后于30分钟内慢慢加入(逐滴)14.8ml(203mmol)的SOCl2。使混合物温热至室温并搅拌4.5小时，然后真空浓缩得残余物，加入CH2Cl2并用1N NaOH(水溶液)然后用饱和食盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。真空浓缩得残余物，然后加无水THF和8.7g(101mmol)的哌嗪并于室温搅拌过夜。真空浓缩得残余物，加CH2Cl2，并用0.25N NaOH(水溶液)，水，然后用饱和食盐水洗涤。MgSO4干燥并真空浓缩得9.46g粗产物。色谱分离(硅胶，5％MeOH/CH2Cl2+NH3)得3.59g标题化合物，为外消旋物。
1H NMR(CDCl3，200MHz)8.43(d，1H)；7.55(d，1H)；7.45(d，1H)；7.11(d，1H)；5.31(s，1H)；4.86-4.65(m，1H)；3.57-3.40(m，1H)；2.98-2 55(m，6H)；2.45-2.20(m，5H)。MH+＝470。步骤G-对映体的分离
用30％i-PrOH/己烷+0.2％二乙胺，如制备实例6、步骤D所述色谱分离步骤F的外消旋标题化合物(5.7g)，得标题化合物的2.88g R-(+)-对映体和2.77g S-(-)-对映体。
R-(+)-对映体的物理化学数据质谱MH+＝470；[α]D25＝+12.1°(10.9mg/2ml MeOH)。
S-(-)-对映体的物理化学数据质谱MH+＝470；[α]D25＝-13.2°(11.51mg/2ml MeOH)。
制备实例10 步骤A
于20℃混合13g(33.3mmol)制备实例4、步骤D的标题化合物，和300ml甲苯，然后加入32.5ml(32.5mmol)的1M DIBAL的甲苯溶液。加热混合物回流1小时，冷至20℃，加入另一份32.5ml的1M DIBAL溶液并加热回流1小时。冷却混合物至20℃并把它倾入到400g冰、500ml EtOAc和300ml 10％NaOH(水溶液)的混合物中。用CH2Cl2(3×200ml)萃取水层，用MgSO4干燥有机层，然后真空浓缩得残余物。色谱分离(硅胶，12％MeOH/CH2Cl2+4％NH4OH)得10.4g标题化合物的外消旋物。质谱MH+＝469(FAB)。部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；7.57(s，1H)；7.27(d，1H)；7.06(d，1H)；3.95(d，1H)。步骤B-对映体的分离
用制备手性色谱分离(Chiralpack AD，5cm×50cm柱，用5％i-PrOH/己烷+0.2％二乙胺)步骤A的外消旋标题化合物，得标题化合物的(+)-对映体和(-)-对映体。
(+)-对映体的物理化学数据质谱MH+＝469(FABS)；[α]D25＝+43.5°(c＝0.402 EtOH)；部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；7.57(s，1H)；7.27(d，1H)；7.05(d，1H)；3.95(d，1H)。
(-)-对映体的物理化学数据质谱MH+＝469(FAB)；[α]D25＝-41.8°(c＝0.328 EtOH)；部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；7.57(s，1H)；7.27(d，1H)；7.05(d，1H)；3.95(d，1H)。
制备实例11
通过基本上如制备实例6、步骤A～D所描述的同样方法处理4-(8-氯-3-溴-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚并[1，2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-2-羧酸乙酯，得到如步骤C的产物，外消旋的标题化合物，及如步骤D的产物，标题化合物的R-(+)-对映体和S-(-)-对映体。
R-(+)-对映体的物理化学数据13C NMR(CDCl3)；155.8(C)；146.4(CH)；140.5(CH)；140.2(C)；136.2(C)；135.3(C)；133.4(C)；132.0(CH)；129.9(CH)；125.6(CH)；119.3(C)；79.1(CH)；52.3(CH2)；52.3(CH2)；45.6(CH2)；45.6(CH2)；30.0(CH2)；29.8(CH2)。[α]D25＝+25.8°(8.46mg/2ml MeOH)。
S-(-)-对映体的物理化学数据13C NMR(CDCl3)155.9(C)；146.4(CH)；140.5(CH)；140.2(C)；136.2(C)；135.3(C)；133.3(C)；132.0(CH)；129.9(CH)；125.5(CH)；119.2(C)；79.1(CH)；52.5(CH2)；52.5(CH2)；45.7(CH2)；45.7(CH2)；30.0(CH2)；29.8(CH2)。[α]D25＝-27.9°(8.90mg/2ml MeOH)。
实例1
步骤A
在20ml DMF中溶解1.160g(2.98mmol)制备实例3的标题化合物，室温搅拌，并加入0.3914g(3.87mmol)的4-甲基吗啉，0.7418g(3.87mmol)的DEC，0.5229g(3.87mmol)的HOBT，及0.8795g(3.87mmol)的1-N-叔丁氧羰基哌啶基-4-乙酸。室温搅拌混合物两天，然后真空浓缩得残余物并在CH2Cl2和水之间分配残余物。依次用饱和NaHCO3(水溶液)，10％NaH2PO4(水溶液)和饱和食盐水洗涤有机相。用MgSO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2+NH3)得1.72g产物。m.p.94.0～94.5℃，质谱MH+＝614。元素分析计算值，C，60.54；H，6.06；N，6.83，实测值，C，59.93；H，6 62；N，7.45。步骤B
混合1.67g(2.7mmol)步骤A的产物和20ml CH2Cl2并于0℃搅拌。加入20ml TFA，搅拌混合物2小时然后用1N NaOH(水溶液)碱化混合物。用CH2Cl2萃取。用MgSO4干燥有机相，过滤并真空浓缩得1.16g产物。m.p.＝140.2～140.8℃，质谱MH+＝514。步骤C
混合0.50g步骤B的产物，20ml CH2Cl2和4.5当量的(CH3)3SiNCO并于室温搅拌3小时。用饱和NaHCO3(水溶液)萃取混合物并用MgSO4干燥有机相。过滤并真空浓缩得0.8g粗产物。色谱分离粗产物(硅胶，5％MeOH/CH2Cl2+NH3)得0.26g产物。m.p.＝170.2～170.5℃，质谱MH+＝557。
实例2
于0℃混合0.5g(1.06mmol)制备实例4的标题化合物，0.4g(2.61mmol)制备实例1的标题化合物，5ml无水DMF，及0.5ml(4.53mmol)的4-甲基吗啉，然后加入0.6g(3.12mmol)的DEC和0.4g(2.96mmol)的HOBT并于20℃搅拌混合物过夜。真空浓缩得残余物并用CH2Cl2(2×50ml)萃取残余物。用25ml水洗涤萃取液，MgSO4干燥，然后真空浓缩得残余物并色谱分离(硅胶，10％MeOH/EtOAc+2％NH4OH(水溶液))得0.6g(93.7％产率)的标题化合物。质谱MH+＝602(FABS)；部分的1H NMR(CDCl3，300MHz)8.48(s，1H)；8.16(d，2H)；7.61(s，1H)；7.29(m，1H)；7.18(d，2H)；7.04(d，1H)；3.71(s，2H)。元素分析计算值，C，48.81；H，4.10；N，6.57，实测值，C，49.10；H，3.79；N，6.74。
实例3
于0℃在300ml 1∶5的CH2Cl2/EtOAc中溶解5.9g(9.78mmol)实例2的标题化合物。慢慢加入(逐滴)3ml 4N HCl(水溶液)并于0℃搅拌混合物5分钟。加入200ml Et2O，过滤收集生成的固体并用50ml Et2O洗涤固体。于20℃，0.2mmHg时干燥固体得5.9g(96％产率)的标题化合物。质谱MH+＝602(FAB)。部分的1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.66(d，2H)；8.51(s，1H)；7.95(s，1H)；7.67(d，2H)；7.47(m，1H)；7.15(m，1H)；3.99(s，2H)。元素分析计算值，C，48.77；H，3.62；N，6.56，实测值，C，48.34；H，3.95；N，6.84。
实例4
步骤A
混合0.501g(1.28mmol)制备实例5的标题化合物和20ml无水DMF，然后加入0.405g(1.664mmol)的1-N-叔丁氧羰基哌啶基-4-乙酸，0.319g(1.664mmol)的DEC，0.225g(1.664mmol)的HOBT，及0.168g(1.664mmol)的4-甲基吗啉并室温搅拌混合物过夜。真空浓缩混合物得残余物，然后在150ml CH2Cl2和150ml饱和NaHCO3(水溶液)之间分配残余物。用另一份150ml CH2Cl2萃取水相。用MgSO4干燥有机相，并真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，500ml己烷，1L 1％MeOH/CH2Cl2+0.1％NH4OH(水溶液)，然后1L 2％MeOH/CH2Cl2+0.1％NH4OH(水溶液))得到0.575g产物。m.p.＝115°～125℃；质谱MH+＝616。步骤B
混合0.555g(0.9mmol)步骤A的产物和15ml CH2Cl2并冷却混合物至0℃。加入15ml TFA并于0℃搅拌2小时。于40～45℃真空浓缩得残余物，然后在150ml CH2Cl2和100ml饱和NaHCO3(水溶液)之间分配残余物。用100ml CH2Cl2萃取水层，合并萃取液并用MgSO4干燥。真空浓缩得0.47g产物。m.p.＝140°～150℃；质谱MH+＝516。步骤C
混合0.449g(0.87mmol)步骤B的产物，20ml CH2Cl2和0.501g(0.59mmol)的(CH3)3SiNCO并室温搅拌过夜。加入50～75ml饱和NaHCO3(水溶液)并搅拌0.5小时。用CH2Cl2稀释，分离两层并用2×100ml的CH2Cl2萃取水层。用MgSO4干燥合并的CH2Cl2萃取液并真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(硅胶，500ml CH2Cl2；1L 1％的MeOH/CH2Cl2+0.1％NH4OH；1L 2％的MeOH/CH2Cl2+0.2％NH4OH；然后用3％的MeOH/CH2Cl2+0.3％的NH4OH)得0.33g标题化合物。m.p.＝145°～155℃；质谱MH+＝559。
实例5
(-)-对映体混合3.0g(6.36mmol)制备实例6、步骤D的标题化合物的(-)-对映体，和70ml无水DMF。加入3.84ml(34.94mmol)N-甲基吗啉，3.28g(17.11mmol)的DEC，2.23g(16.52mmol)的HOBT和2.09g(13.55mmol)制备实例1的4-吡啶乙酸N-氧化物并室温搅拌混合物过夜。真空浓缩除去DMF，加入100ml饱和NaHCO3(水溶液)和10ml CH2Cl2并搅拌15分钟。用CH2Cl2(2×500ml)萃取混合物，用MgSO4干燥萃取液并真空浓缩得残余物。色谱分离残余物(500g反相C18硅胶，75％、80％，然后85％MeOH/水+0.1％HOAc梯度洗脱)。真空浓缩所要的组分以除去MeOH并加入50ml 1M NaOH(水溶液)。搅拌15分钟，然后用CH2Cl2(2×500ml)萃取。用MgSO4干燥萃取液并真空浓缩得3.4g标题化合物。m.p＝148.9°～150.5℃；[α]D25＝-56.37°(9.4mg/2ml MeOH)；质谱MH+＝605。
通过室温处理产物在HCl和CH2Cl2中的溶液，接着真空浓缩可以分离得到实例5标题化合物的HCl盐。[α]D25＝-31.9°(4.80mg/2mlMeOH+1ml水)。
用制备实例6产物的(+)-对映体并接着用基本上如上实例5所描述的同样方法，制得类似物(+)-对映体(实例5A)，即，实例5标题化合物的对映体。m.p.＝149.0°～150.5℃；质谱MH+＝605；[α]D25＝+67.1°(7.0mg/2ml MeOH)。
如上实例5所描述的，实例5A的标题化合物也能以HCl盐分离得到。m.p.＝152.9℃(分解)；[α]D25＝+41.7°(2ml MeOH+1ml水)。
用制备实例6、步骤C的外消旋的标题化合物，并接着用基本上如上述实例5所描述的同样方法，制备了外消旋物(实例5B)。m.p.＝84.3°～85.6℃；质谱MH+＝607。
实例6
(-)-对映体步骤A
混合3.21g(6.80mmol)制备实例6的(-)-对映体产物和150ml无水DMF。加入2.15g(8.8mmol)的1-N-叔丁氧羰基哌啶基-4-乙酸，1.69g(8.8mmol)DEC，1.19g(8.8mmol)的HOBT和0.97ml(8.8mmol)的N-甲基吗啉并于室温搅拌混合物过夜。真空浓缩除去DMF并加入50ml饱和碳酸氢钠(水溶液)。用CH2Cl2(2×250ml)萃取，用50ml饱和食盐水洗涤萃取液并用MgSO4干燥。真空浓缩得残余物并色谱分离(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2+10％NH4OH)得4.75g产物。m.p.＝75.7°～78.5℃；质谱MH+＝695；[α]D25＝-5.5°(6.6mg/2ml MeOH)。步骤B
混合4.70g(6.74mmol)步骤A的产物和30ml MeOH，然后于1小时内加入10ml一份的50ml 10％H2SO4/二氧六环溶液。将混合物倾入至50ml水中并加入15ml 50％的NaOH(水溶液)以调节pH≈10～11。过滤除去生成的固体并用CH2Cl2(2×250ml)萃取滤液。真空浓缩水层除去MeOH并再用250ml CH2Cl2萃取。用MgSO4干燥合并的萃取液并真空浓缩得产物。m.p.＝128.1°～131.5℃；质谱MH+＝595；[α]D25＝-6.02°(9.3mg/2ml MeOH)。步骤C
混合3.64g(5.58mmol)步骤B的产物和30ml CH2Cl2，然后加入6.29ml(44.64mmol)的(CH3)3SiNCO并室温搅拌混合物2天。加入25ml NaHCO3(水溶液)，然后用CH2Cl2(2×250ml)萃取。用25ml饱和食盐水洗涤萃取液并用MgSO4干燥。真空浓缩得残余物并色谱分离(硅胶，2.5％、5.0％，然后用7.5％MeOH/CH2Cl2+10％NH4OH梯度洗脱)得标题化合物m.p.＝150.5°～153.0℃；质谱MH+＝638；[α]D25＝-61.4°(8.18mg/2ml MeOH)。
实例7
用基本上如实例2所述的同样方法，使制备实例7的标题化合物和制备实例1的标题化合物反应，得0.25g标题化合物，它是阻转异构体的外消旋混合物。质谱MH+＝602，m.p.＝167.2°～167.8℃。
通过和HCl/CH2Cl2搅拌1小时，然后真空浓缩，制得实例7标题化合物的HCl盐。
实例7A和7B
实例7A实例7B实例7的标题化合物是阻转异构体的外消旋混合物。通过制备手性色谱(HPLC)，用Chiralpack AD柱(5cm×50cm)和40％i-PrOH/己烷+0.2％二乙胺作流动相，分离那些阻转异构体，分别得(+)-和(-)-对映体，实例7B和7A。
(-)-对映体，实例7A的物理化学数据m.p.＝114.2°～114.8℃，[α]D25＝-154.6°(8.73mg/2ml MeOH)。
(+)-对映体，实例7B的物理化学数据m.p.＝112.6°～113.5℃，[α]D25＝+159.7°(10.33mg/2ml MeOH)。
实例8
步骤A
将6.0g(12.8mmol)制备实例7的标题化合物和3.78g(16.6mmol)1-氮-叔丁氧羰基哌啶基-4-乙酸反应，使用和实例6步骤A所述基本上相同的方法，得到8.52g产品。质谱MH+＝692(FAB)。1H NMR(CDCl3，200MHz)8.5(d，1H)；7.5(d，2H)；7.2(d，1H)；4.15-3.9(m，3H)；3.8-3.6(m，1H)；3.5-3.15(m，3H)；2.9(d，2H)；2.8-2.5(m，4H)；2.4-1.8(m，6H)；1.8-1.6(br d，2H)；1.4(s，9H)；1.25-1.0(m，2H).步骤B
混合8.50g步骤A的产物和60ml CH2Cl2，然后冷却至0℃并加入55ml TFA。将混合物在0℃搅拌3小时，然后加入500ml 1N NaOH(水溶液)，接着加入30ml 50％NaOH(水溶液)。用CH2Cl2萃取，MgSO4干燥，减压浓缩得到7.86g产品。
质谱MH+＝592(FAB)。1H NMR(CDCl3，200MHz)8.51(d，1H)；7.52(d of d，2H)；7.20(d，1H)；4.1-3.95(m，2H)；3.8-3.65(m，2H)；3.5-3.05(m，5H)；3.0-2.5(m，6H)；2.45-1.6(m，6H)；1.4-1.1(m，2H).步骤C
将7.80g(13.1mmol)步骤B的产物用12.1g(105mmol)(CH3)3SiNCO处理，使用和实例6步骤C所述的基本上相同的方法，得到5.50g标题化合物，它是一种阻转异构体的外消旋混合物。m.p.＝163.6°～164.0℃。质谱MH+＝635(FAB)。1H NMR(CDCl3，200MHz)8.5(d，1H)；7.52(d，1H)；7.48(d，1H)；7.21(d，1H)；4.54(s，2H)；4.1-3.6(m，4H)；3.45-3.15(m，4H)；3.0-2.5(m，5H)；2.45-1.6(m，7H)；1.4-1.0(m，2H)。
实例8A和8B
实例8A 实例8B实例8的标题化合物是阻转异构体的外消旋混合物。那些阻转异构体是通过制备性色谱(HPLC)分离的，使用一种Chiralpack AD柱(5cm×50cm)，20％异丙醇/己烷+0.2％二乙胺作为流动相，流速100ml/分钟，得到(+)-和(-)-对映体，分别为实例8B和8A。
(-)-对映体，即实例8A的理化数据m.p.＝142.9°～143.5℃，[α]D25＝-151.7°(11.06mg/2ml，MeOH)。
(+)-对映体，即实例8B的理化数据m.p.＝126.5°～127.0℃，[α]D25＝+145.6°(8.38mg/2ml MeOH)。
实例9
混合3.32g制备实例8中步骤B的标题化合物的(+)-对映体，2.38g制备实例1的标题化合物，1.92g HOBT，2.70g DEC，1.56mlN-甲基吗啉和50ml干燥的DMF并在25℃搅拌24小时。在真空下浓缩，然后将残余物用CH2Cl2稀释。先用1N NaOH(水溶液)，然后用饱和NaH2PO4(水溶液)洗涤，用MgSO4干燥。真空下浓缩得到的剩余物色谱分离(硅胶，2％MeOH/CH2Cl2+NH4OH)，得到3.82g标题化合物。质谱MH+＝604(FAB)。
该化合物的盐酸盐是通过将实例9的标题化合物溶解在用氯化氢饱和的二氯甲烷中制得的。真空浓缩得到实例9标题化合物的盐酸盐。m.p.＝166.5℃，[α]D22＝+70.8°(9.9mg/2ml MeOH)。
实例9A和9B
实例9A 实例9B
将制备实例8、步骤B的标题化合物的(-)-对映体(3.38g)与2.20g制备实例1的标题化合物反应，经由和实例9所述基本上相同的方法得到3.58g实例9A的标题化合物。
实例9A标题化合物的HCl盐的制备，包括将标题化合物溶解于CH2Cl2，加入6M HCl(g)在CH2Cl2中的溶液，然后真空浓缩得到该盐。m.p.＝129℃，[α]D25＝-72.3°(3.32mg/2ml MeOH)。
将制备实例8，步骤A的外消旋的标题化合物，与制备实例1的标题化合物反应，经由和实例9所述基本上相同的方法得到了实例9B的标题化合物。m.p.＝145.0℃。
实例10
步骤A
将1.33g制备实例8中步骤B的标题化合物的(+)-对映体，与1.37g 1-氮-叔丁氧基-羰基哌啶基-4-乙酸反应，使用和实例6、步骤A所述基本上相同的方法，得到2.78g产品。质谱MH+＝694.0(FAB)；[α]D25＝+34.1°(5.45mg/2ml，MeOH)。步骤B
将2.78g步骤A的产物，经由与实例8、步骤B所述基本上相同的方法处理，得到1.72g产物。m.p.＝104.1℃；质谱MH+＝594；[α]D25＝+53.4°(11.42mg/2ml，MeOH)。步骤C
以和实例6、步骤C所述的基本上相同的方法，用6ml(CH3)3SiNCO处理1.58g步骤B的产物，得到1.40g标题化合物。m.p.＝140℃；质谱MH+＝637；[α]D25＝+49.1°(4.24mg/2ml，MeOH)。
用丙酮重结晶制得标题化合物，为固体。m.p.＝214.5-215.9℃。
实例10A和10B
实例10A 实例10B经由和实例10、步骤A-C所述基本上相同的方法，将制备实例8、步骤B标题化合物的(-)-对映体(3.38g)转化成(实例10A)标题化合物，得到实例10A的标题化合物。m.p.＝152℃；质谱MH+＝637；[α]D25＝-62.5°(1.12mg/2ml，MeOH)。
经由和实例10、步骤A-C所述基本上相同的方法，将制备实例8、步骤A的外消旋标题化合物转化成(实例9B)标题化合物，得到实例10B的标题化合物。m.p.＝111.2℃(分解)。
实例11
标题化合物是用制备实例9、步骤F的外消旋标题化合物，经过和实例2所述基本上相同的方法制得的。1H NMR(CDCl3，400MHz)8.44(d，1H)；8.14(d，2H)7.58(d，1H)；7.47(d，1H)；7.14(m，3H)；5.32(s，1H)；4.65-4.57(m，1H)；3.68(s，2H)；3.65-3.39(m，4H)；2.91-2.87(m，1H)；2.69-2.63(m，1H)；2.45-2.33(m，.4H).MH+＝605.
实例11A和11B
实例11A 实例11B该R-(+)-对映体(实例11A)或S-(-)-对映体(实例11B)是用制备实例9中步骤G标题化合物的R-(+)-或S-(-)-对映体，用与实例2所述基本上相同的方法制得的。
R-(+)-对映体，实例11A的理化数据m.p.＝167.0°-167.8℃；
＝+32.6°(c＝1，MeOH)；1H NMR(CDCl3，400MHz)8.44(d，1H)；8.14(d，2H)7.58(d，1H)；7.47(d，1H)；7.14(m，3H)；5.32(s，1H)；4.65-4.57(m，1H)；3.68(s，2H)；3.65-3.39(m，4H)；2.91-2.87(m，1H)；2.69-2.63(m，1H)；2.45-2.33(m，4H).MH+＝605.
S-(-)-对映体，实例11B的理化数据
＝-38.2°(14.67mg/2mL，MeOH)；1H NMR(CDCl3，400MHz)8.44(d，1H)；8.14(d，2H)7.58(d，1H)；7.47(d，1H)；7.14(m，3H)；5.32(s，1H)；4.64-4.57(m，1H)；3.67(s，2H)；3.70-3.34(m，4H)；2.95-2.87(m，1H)；2.69-2.63(m，1H)；2.45-2.31(m，4H).MH+＝605.
实例12
本实例的标题化合物是使用制备实例9、步骤F的外消旋标题化合物，经过与实例8中步骤A-C所述基本上相同的方法制得的。该化合物是一种外消旋物。
实例12A和12B
实例12A 实例12B实例12的标题化合物是一种外消旋混合物。色谱分离2.45g实例12的化合物，使用一种Chiralpack AD柱和20％异丙醇/己烷+0.2％二乙胺作为流动相，流速100ml/分，得到0.970g(+)-对映体和0.982g(-)-对映体，分别为实例12B和12A。
(-)-对映体，实例12A的理化数据1H NMR(CDCl3，200MHz)8.43(d，1H)；7.58(d，1H)；7.48(d，1H)；7.14(d，1H)；5.32(s，1H)；4.5-4.75(m，1H)；4.4(s，2H)；3.9(d，2H)；3.2-3.7(m，5H)；2.52-3.05(m，4H)；1.85-2.5(m，6H)；1.5-1.85(m，4H)；1.0-1.4(m，1H).
＝-31.2°(c＝0.453，MeOH).
(+)-对映体，实例12B的理化数据1H NMR(CDCl3，200MHz)8.43(d，1H)；7.58(d，1H)；7.48(d，1H)；7.14(d，1H)；5.32(s，1H)；4.5-4.75(m，1H)；4.4(s，2H)；3.9(d，2H)；3.2-3.7(m，5H)；2.52-3.05(m，4H)；1.85-2.5(m，6H)；1.5-1.85(m，4H)；1.0-1.4(m，1H).
＝+29.8°(c＝0.414，MeOH).
实例13
步骤A
将1.35g制备实例10步骤B的标题化合物的(-)-对映体和1.4g1-N-叔丁氧基-羰基哌啶基-4-乙酸反应，按照与实例6中步骤A所述基本上相同的方法，得到2.0g产物。质谱MH+＝694(FAB)。部分的1H NMR(CDCl3，300MHz)8.38(s，1H)；7.60(s，1H)；7.25(d，1H)；7.05(m，1H)；1.45(s，9H)。步骤B
将1.95g步骤A的产物经由与实例8、步骤B所述基本上相同的方法处理，得到1.63g产物。质谱MH+＝594(FAB)。部分的1H NMR(CDCl3，300MHz)8.38(s，1H)；7.60(s，1H)；7.25(d，1H)；7.03(m，1H)；4.64(d，1H)；3.90(m，2H)。步骤C
(-)-异构体将1.6g步骤B的产物用1.3ml(CH3)3SiNCO处理，使用与实例6步骤C所述基本上相同的方法，得到1.27g标题化合物。质谱MH+＝637(FABS)；[α]D25＝-33.1°(c＝0.58，EtOH)。部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；7.59(s，1H)；7.25(d，1H)；7.04(m，1H)；4.60(d，1H)；4.41(s，2H)。
实例13A和13B
实例13A 实例13B经由与实例10中步骤A-C所述基本上相同的方法，将制备实例10步骤B标题化合物的(+)-对映体(2.1g)转化成本标题化合物，得到标题化合物实例13A。质谱MH+＝637(FABS)；[α]D25＝+32.4°(c＝0.57，EtOH)。部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.39(s，1H)；7.59(s，1H)；7.25(d，1H)；7.04(m，1H)；4.60(d，1H)；4.41(s，2H)。部分的1H NMR(DMSO-d6，400MHz)8.42(s，1H)；7.88(s，1H)；7.41(d，1H)；7.29(m，1H)；5.85(s，2H)；4.20(d，1H)。
用类似的方法，将制备实例10中步骤A的外消旋标题化合物转化成为外消旋的标题化合物实例13B。部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；7.59(s，1H)；7.25(d，1H)；7.04(m，1H)；4.60(d，1H)；4.41(s，2H)。部分的1H NMR(DMSO-d6，400MHz)8.42(s，1H)；7.88(s，1H)；7.41(d，1H)；7.29(d，1H)；5.85(s，2H)；4.20(d，1H)。
实例14
按照与实例9所述基本上相同的方法，使2.6g制备实例10中步骤B标题化合物的(+)-对映体和1.68g制备实例1的标题化合物反应，得到2.10g标题化合物。质谱MH+＝604(FAB)；[α]D25＝+34.1°(10.98mg/2ml，EtOH)。部分的1H NMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；8.15(d，2H)；7.58(s，1H)；7.26(d，1H)；7.15(d，2H)；7.03(d，1H)；4.57(d，1H)。
为制备实例14标题化合物的HCl盐，将700mg标题化合物溶解在4ml CH2Cl4中，加入4ml Et2O，冷至0℃并慢慢加入(逐滴)1ml的HCl(g)二噁烷溶液。加入2ml Et2O并在0℃搅拌7分钟。用30mlEt2O稀释，过滤收集固体产物并用30ml Et2O洗涤。将固体真空干燥得到0.836g实例14的HCl盐。[α]D25＝+64.8°(9.94mg/2ml，EtOH)。
实例14A和14B
实例14A 实例14B经由与实例9所述基本上相同的方法，使制备实例10中步骤B标题化合物的(-)-对映体(0.60g)和0.39g制备实例1的标题化合物反应，得到0.705g标题化合物。质谱MH+＝604(FABS)；[α]D25＝-41.8°(EtOH)。部分的1H NMR(CDCl3，300MHz)8.38(s，1H)；8.15(d，2H)；7.58(s，1H)；7.26(d，1H)；7.15(d，2H)；7.03(d，1H)；4.57(d，1H)。
实例14A标题化合物的HCl盐是经由与实例14所述基本上相同的方法制得的。[α]D25＝-63.2°(EtOH)。
将制备实例10中步骤A的外消旋标题化合物，通过与实例9所述基本上相同的方法，转化成实例14B的外消旋标题化合物。部分的1HNMR(CDCl3，400MHz)8.38(s，1H)；8.15(d，2H)；7.58(s，1H)；7.26(d，1H)；7.15(d，2H)；7.03(d，1H)；4.57(d，1H)。部分的1H NMR(DMSO-d6，400MHz)8.77(d，2H)；8.47(s，1H)；7.95(s，1H)；7.74(d，2H)；7.43(m，1H)；7.27(d，1H)；4.35(d，1H)。
实例15
将制备实例4的标题化合物，经由与实例8中步骤A-C所述基本上相同的方法反应，得到标题化合物，它是一种外消旋物。质谱MH+＝635(FAB)。部分的1H NMR(CDCl3)8.45(s，1H)；7.60(s，1H)；7.35(d，1H)；7.05(d，1H)；4.45(s，1H)。
实例16A和16B
实例16A 实例16B将制备实例11标题化合物的R-(+)-对映体或S-(-)-对映体，经由与实例2所述基本上相同的方法处理，得到标题化合物的R-(+)-对映体或标题化合物的S-(-)-对映体，分别为实例16A和16B。
R-(+)-对映体的理化数据13C NMR(CDCl3)166.5(C)；154.8(C)；146.6(CH)；140.8(CH)；140.4(C)；138.5(CH)；138.5(CH)；136.3(C)；134.6(C)；133.8(C)；133.6(C)；132.0(CH)；130.0(CH)；126.3(CH)；126.3(CH)；125.8(CH)；119.6(C)；78.4(CH)；51.1(CH2)；50.6(CH2)；45.4(CH2)；41.5(CH2)；38.0(CH2)；30.1(CH2)；30.0(CH2).
＝+30.7°(10.35mg/2mL MeOH).
S-(-)-对映体的理化数据13C NMR(CDCl3)166.5(C)；154.8(C)；146.6(CH)；140.8(CH)；140.4(C)；138.5(CH)；138.5(CH)；136.3(C)；134.6(C)；133.8(C)；133.6(C)；132.0(CH)；130.0(CH)；126.3(CH)；126.3(CH)；125.8(CH)；119.6(C)；78.4(CH)；51.1(CH2)；50.6(CH2)；45.4(CH2)；41.5(CH2)；38.0(CH2)；30.1(CH2)；29.9(CH2).
＝-30.9°(9.70mg/2mL MeOH).
实例17和17A
实例17实例17A将制备实例11标题化合物的(+)-对映体或(-)-对映体，经由与实例1中步骤A-C所述基本上相同的方法处理，得到标题化合物的R-(+)-对映体或标题化合物的S-(-)-对映体，分别为实例17和17A。
R-(+)-对映体的理化数据13C NMR(CDCl3)169.3(C)；157.5(C)；155.0(C)；146.6(CH)；140.8(CH)；140.4(C)；136.3(C)；134.8(C)；133.7(C)；132.0(CH)；130.0(CH)；125.8(CH)；119.6(C)；78.5(CH)；51.4(CH2)；50.9(CH2)；45.2(CH2)；43.9(CH2)；43.9(CH2)；41.1(CH2)；38.8(CH2)；32.5(CH)；31.5(CH2)；31.5(CH2)；30.1(CH2)；30.0(CH2).
＝+28.7°(10.1mg/2mL MeOH).
S-(-)-对映体的理化数据13C NMR(CDCl3)169.3(C)；157.6(C)；155.0(C)；146.6(CH)；140.8(CH)；140.4(C)；136.3(C)；134.8(C)；133.7(C)；132.0(CH)；130.0(CH)；125.8(CH)；119.6(C)；78.5(CH)；51.4(CH2)；50.9(CH2)；45.2(CH2)；43.9(CH2)；43.9(CH2)；41.1(CH2)；38.8(CH2)；32.5(CH)；31.5(CH2)；31.5(CH2)；30.1(CH2)；30.0(CH2).
＝-28.5°(10.1mg/2 mL MeOH).
实例18
步骤A
将制备实例7中步骤B的产物9.90g(18.9mmol)溶解在150mlCH2Cl2和200ml CH3CN中并加热至60℃。加入2.77g(20.8mmol)N-氯代琥珀酰亚胺并加热回流3小时，用TLC(30％EtOAc/H2O)监测反应。加入另外的2.35g(10.4mmol)N-氯代琥珀酰亚胺并再回流45分钟。将反应混合物冷至室温并用1N NaOH和CH2Cl2萃取。CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤并用闪式色谱(1200ml正常态硅胶，用30％EtOAc/H2O洗脱)纯化，得到6.24g期望的产物。M.p.193-195.4℃。MH+＝510。步骤B
于-10℃下将2.07g(30.1mmol)NaNO2加入至160ml浓HCl中并搅拌10分钟。加入步骤A的产物5.18g(10.1mmol)并将反应混合物从-10℃温热至0℃2小时。将反应冷至-10℃，加入100ml H3PO2并放置过夜。萃取反应混合物，将其倾入至碎冰中并用50％NaOH/CH2Cl2碱化。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干。用闪式色谱(600ml正常态硅胶，用20％EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到3.98g产物。质谱MH+＝495。步骤C
将步骤B的产物3.9g溶解在100ml浓HCl中并回流过夜。冷却混合物，用50％w/w NaOH碱化并用CH2Cl2萃取所得混合物。用MgSO4干燥CH2Cl2层，蒸发走溶剂并真空干燥，得到3.09g期望的产物。质谱MH+＝423。步骤D
使用与制备实例8所述类似的方法，得到1.73g目的产物。m.p.169.6-170.1℃；[α]D25＝+48.2°(c＝1，MeOH)。MH+＝425。步骤E以步骤D的产物为起始原料，使用与实例4相似的方法，得到标题化合物。M.p.152.3-153.3℃；[α]D25＝+53.0°(c＝1，MeOH)。MH+＝593。
实例19
步骤A
用6.52g(48.9mmol)N-氯代琥珀酰亚胺处理15.0g(44.4mmol)制备实例9中步骤B的产物，使用与实例18中步骤A相似的方法，并如所述萃取，得到16.56g目的产物，m.p.234.7-235.0℃。MH+＝370。步骤B
将16.95g(45.6mmol)步骤A的产物用实例18中步骤B所述的方法处理，得到13.07g目的产物，m.p.191.7-192.1℃。MH+＝356。步骤C
使用基本上如制备实例9中步骤E所述的方法，将10.0g(28.0mmol)步骤B的产物用NaBH4处理，得到目的产物，它没经进一步纯化就用于下一步反应。步骤D
在N2保护并于室温搅拌下，将10.0g(27.9mmol)步骤C的产物溶解在200ml CH2Cl2中。将反应混合物冷至0℃并加入2.63g三乙胺和4.80g(41.9mmol)甲磺酰氯。在0℃下将16.84g(19.6mmol)哌嗪和100ml THF的溶液加入至生成的溶液中，随后立即加入100mlDMF。室温搅拌过夜。蒸发溶剂并用CH2Cl2和饱和NaHCO3萃取所得残余物。用MgSO4干燥CH2Cl2层，过滤并浓缩得到粗产物。于1200ml硅胶上用色谱法分离粗制品，用5％CH3OH(用NH3饱和)的CH2Cl2溶液洗脱得到一种外消旋混合物。用手性色谱层析分离该外消旋化合物，应用一种Chiralpack AD柱(5cm×50cm)，用30％的异丙醇/己烷和0.2％二乙胺洗脱。质谱MH+＝426。目的异构体是(+)-对映体。步骤E在N2保护下将步骤D的产物2.0g(4.7mmol)在40ml DMF中搅拌，将混合物冷至0℃，加入0.615g(6.1mmol)N-甲基吗啉、1.1668g(6.1mmol)DEC、0.8225g(6.1mmol)HOBT和1.6042g(6.1mmol)制备实例1的产物。室温搅拌过夜。蒸发溶剂，用CH2Cl2/H2O、饱和NaHCO3、10％NaH2PO4和盐水萃取所得残余物。分离出CH2Cl2层，用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干。于400ml标准态硅胶上用闪式色谱纯化所得残余物，用5％CH3OH/NH3-CH2Cl2洗脱，得到2.43g标题化合物，m.p.145.3-146.1℃；[α]D25＝+33.6°(c＝1，MeOH)。MH+＝561。
实例20
(+)-对映体步骤A
将200mg氰基起始原料在17g多磷酸中于190-200℃加热45分钟。把总的混合物倾入至冰中，加入30％HCl并搅拌30分钟。用CH2Cl2萃取，盐水洗涤，Na2SO4干燥，过滤并浓缩。用制备性TLC纯化，用EtOAc/己烷洗脱得到21mg目的产物(也得到59mg 10-氯代产物)。步骤B
使用基本上如制备实例9中步骤E所述的方法，将1.75g(5.425mmol)步骤A的产物用NaBH4处理得到目的产物。步骤C
将步骤B中所得的残余物在室温下溶解于50ml CH2Cl2中，加入3.95ml(5.425mmol)SOCl2并于室温搅拌过夜。在真空下除去过量的SOCl2和溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2中，用饱和NaHCO3和盐水洗涤，Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将25ml THF加入至生成的残余物中，加入2.33g(27.125mmol)哌嗪并在室温下搅拌过夜。蒸走溶剂，加入CH2Cl2并用饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得残余物用手性色谱分离，使用Chiralpack AD柱并用20％异丙醇/己烷和0.2％二乙胺洗脱。质谱MH+＝392。目的异构体是(+)-对映体。步骤D将770mg(1.960mmol)步骤C的产物，与323μl(2.548mmol)N-甲基吗啉、344mg(2.548mmol)HOBT、487mg(2.548mmol)DEC和390mg(2.548mmol)制备实例1的化合物在8ml DMF中混合，并在室温下搅拌过夜。蒸走溶剂，加入EtOAc并用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥。于硅胶上用闪式色谱纯化，用EtOAc在10、12％(10％NH4OH/CH3OH)/EtOAc的梯度洗脱。用制备性TLC(1000μ硅胶)进一步纯化得到750mg标题化合物，[α]D25＝+23.3°(c＝0.322，MeOH)。
实例21
外消旋的步骤A
于室温下将制备实例9中步骤B的产物10.0g(29.6mmol)溶解在150ml CH2Cl2和200ml CH3CN中。将混合物加热至60℃，加入10.45g(32.6mmol)1-氟-4-羟基-1，4-二氮鎓(diazonia)二环[2，2，2]辛烷双-(四氟硼酸盐)并加热回流4小时。将混合物冷至室温，用CH2Cl2和1N NaOH萃取。CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干。所得残余物用闪式色谱纯化，使用1400ml标准态硅胶，用10％EtAOc-CH2Cl2+2滴NH4OH洗脱得到2.00g产物，m.p.103.2-103.5℃。MH+＝355。步骤B
应用基本上如制备实例9中步骤D所述的方法，处理1.80g(5.1mmol)步骤A的产物。粗产物用闪式色谱纯化，使用200ml标准态硅胶，用20％EtOAc/己烷洗脱。质谱MH+＝339。步骤C
使用基本上如制备实例9中步骤E所述的方法，用NaBH4处理0.47g(1.4mmol)步骤B的产物，得到目的产物。质谱MH+＝342。步骤D
在N2保护下将0.37g(1.1mmol)步骤C的产物溶解在20ml甲苯中并从室温冷却至0℃。加入0.3855g(3.2mmol)SOCl2并在室温搅拌，然后加入10ml CHCl3并搅拌3小时。蒸发溶剂，用1N NaOH-CH2Cl2萃取所得残余物，CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干。在N2保护下将残余物溶解在10ml THF中，加入0.465g(5.4mmol)哌嗪、10ml THF并在室温搅拌过夜。重复萃取步骤得到目的产物。质谱MH+＝410。步骤E将步骤D的产物0.44g(1.1mmol)，与N-甲基吗啉、4-吡啶基乙酸N-氧化物、DEC和HOBT的DMF溶液，用实例5所述方法处理。蒸发溶剂，所得残余物用CH2Cl2-H2O、饱和NaHCO3、10％NaH2PO4和盐水萃取。CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干。所得残余物用闪式色谱纯化，使用150ml标准态硅胶，用5％CH3OH/NH3-CH2Cl2洗脱得到0.41g标题化合物，m.p.155.0-155.6℃；质谱MH+＝545。
使用合适的起始原料和上述方法，可制得以下化合物
测定1.体外酶测定对法呢基蛋白转移酶和牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶的抑制作用。
用硫酸铵分级分离并随之用Q-琼脂糖凝胶(Pharmacia Inc.)阴离子交换色谱、基本上如Yokoyama等所述〔Yokoyama，K.，等，(1991)〕方法，将来自大鼠脑的法呢基蛋白转移酶(FPT)和牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶(GGPT)I进行部分纯化。来自小牛脑的蛋白牻牛儿基牻牛儿基转移酶是有蛋白异戊二烯基化特异性，Proc.Natl.Acad.Sci USA885302-5306，它的公开也在此作为参考文献列入本文中。人的法呢基蛋白转移酶也通过用编码a和b亚单位的cDNA克隆，表达在E.coli中。使用的方法类似于已出版的那些方法〔Omer.C.等，(1993)〕，重组的人法呢基蛋白转移酶的鉴别，克隆，表达，法呢基二磷酸酯结合，和用酵母异戊二烯基-蛋白转移酶的功能同系物。Biochemistry 325167-5176〕。人的法呢基蛋白转移酶是如上述E.coli的可溶的蛋白组分进行部分纯化的。在此公开的三环法呢基蛋白转移酶抑制剂均以相同强度抑制人类和大鼠的酶。作为这些酶的底物制备了两种形式的Val12-Ha-Ras蛋白，其不同处在于它们的羧基末端序列。一种形式末端为半胱氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸(Ras-CVLS)，另一种为半胱氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ras-CVLL)。Ras-CVLS是法呢基蛋白转移酶的底物，而Ras-CVLL是牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶I的底物。组建了编码这些蛋白的cDNAs，以使这些蛋白质包含有6个组氨酸残基的氨基末端突出。两种蛋白质均在Escherichiacoli中表达并用金属络合亲合色谱纯化。放射标记的异戊二烯基焦磷酸酯底物，〔3H〕法呢基焦磷酸酯和〔3H〕牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯，是从DuPont/New England Nuclear购得的。
一些测量法呢基蛋白转移酶活性的方法已有描述(Reiss等1990，Cell6281；Schaber等1990。J.Biol.Chem.26514701；Manne等1990，PNAS.877541；和Barbacid & Manne 1993，U.SPatent No 5,185,248)。通过测量从〔3H〕法呢基焦磷酸酯到Ras-CVLS的〔3H〕法呢基的转移，用类似于Reiss等1990(Cell6281)所述条件，来鉴定活性。总体积100ml反应混合物包含40mM Hepes，pH 7.5；20mM氯化镁；5mM二硫苏糖醇；0.25μM[3H]法呢基焦磷酸酯；10ml Q-琼脂糖凝胶纯化的法呢基蛋白转移酶；指定浓度的三环化合物或二甲基亚砜(DMSO)载体对照(5％DMSO最终浓度)；和5mM Ras-CVLS。将反应在室温下进行30分钟，然后用0.5ml 4％十二烷基硫酸钠(SDS)，随之用0.5ml冷的30％TCA终止反应。将样品置于冰上45分钟然后在GF/C过滤纸垫上用Brandel细胞收获器收集沉淀的Ras蛋白。滤纸垫用6％TCA，2％SDS洗涤一次，并于Wallac1204 Betaplate BS液体闪烁计数器测定其放射活性。百分抑制率是按相对于DMSO载体对照计算的。
牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶I的测定基本上是如上述法呢基蛋白转移酶相同的测定方法，但有两处例外〔3H〕牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯代替了法呢基焦磷酸酯作为异戊二烯类供体并且Ras-CVLL是蛋白受体。这类似于Casey等报道的测定试验〔Casey.P.J.，等，(1991)〕，用牻牛儿基牻牛儿基异戊二烯进行蛋白的酶修饰，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888631-8635，它的公开内容在此作为参考文献列于本文中。
2.基于细胞的测定在COS猴的肾细胞中Val12-Ha-Ras-CVLS和Val12-Ha-Ras-CVLL的瞬时表达法呢基蛋白转移酶抑制剂对Ras过程和对由转化的Ras所诱导的无序细胞生长的作用。
用含有一种插入的编码Ras-CVLS或Ras-CVLL的CDNA的质粒pSV-SPORT(Gibco/BRL)通过电穿孔来转染COS猴的肾细胞，这导致分别对法呢基蛋白转移酶或牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶I的Ras底物瞬间超量表达(见上述)。
在电穿孔之后，将细胞涂敷于含有1.5ml的Dulbecco′s-改良的Eagle′s培养基(GIBCO，Inc.)，并补充有10％胎牛血清和适宜的法呢基蛋白转移酶抑制剂的6-孔组织培养皿中。24小时后，除去培养基并重新加入含有适宜药物的新鲜培养基。
电穿孔后48小时，在显微镜下检查细胞以监测由转化的Ras诱导的无序细胞生长。表达转化的Ras的细胞变得更圆且更可折，同时过度生长单层细胞，像是转化的表型。然后拍摄细胞，用1ml冷的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并用橡胶细胞刮棒从碟中刮下并移入至1ml含有25mM Tris，pH 8.0，1mM乙二胺四乙酸；1mM苯基甲基磺酰基氟；50mM亮抑蛋白酶肽；和0.1mM的胃酶抑素的缓冲液中。通过均浆化溶解细胞并在2000xg离心10分钟以除去细胞碎片。
通过加入冰冷的三氯乙酸沉淀细胞蛋白并重新溶解于100ml SDS-电泳样品缓冲液中。将样品(5-10ml)装至14％聚酰胺微型凝胶(Novex，Inc.)上并进行电泳直到接近凝胶的底部有示踪染料。将溶解在凝胶上的蛋白电印迹在硝化纤维素膜上以进行免疫监测。
在4℃于含有2.5％干燥牛奶和0.5％吐温-20的PBS中孵育过夜将膜封闭，然后用Ras特异的单克隆抗体，Y13-259[Furth，M.E.，等(1982)，Harvey鼠肉瘤病毒的转化基因和细胞的ras基因族p21产物的单克隆抗体J.Virol，43294-304]，在含1％胎牛血清的PBS中于室温下孵育1小时。洗涤之后，将膜于室温下用1∶5000稀释的二级抗体，即兔抗大鼠IgG缀合至辣根过氧化物酶，在含有1％胎牛血清的PBS中孵育1小时。用比色的过氧化物酶试剂(4-氯-1-萘酚)如制造商(Bio-Rad)所述检测被加工的或未被加工的Ras-CVLS或Ras-CVLL的存在。
3.细胞簇分析将正常人HEPM成纤维细胞以5×104细胞/皿的密度在2ml生长培养基中植入3.5cm皿中，并孵育3-5天以达到融合。从每个皿中吸取培养基并将指示的肿瘤细胞，表达活化的H-ras基因的T24-BAG4人膀胱癌细胞，在2ml生长培养基中以2×103细胞/皿的密度植入到成纤维细胞单层的顶部，并允许附着过夜。在肿瘤细胞植入24小时后，通过直接加入系列稀释的化合物至生长培养基中，并且另外再孵育细胞14天以允许集落形成以测定化合物诱导的集落抑制作用。用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗单层细胞两次终止检验，并用在PBS中的1％戊二醛溶液固定单层细胞，然后通过用X-Gal染色使肿瘤细胞显影[Price，J.，等，用逆病毒介导的基因转染对脊椎动物神经系统的线性分析，Proc，Natl.Acad.Sci.84156-160(1987)]。在集落抑制测定中，化合物是基于两个IC50数值来评价的阻止肿瘤细胞数目增加50％所需的药物浓度(tIC50)和降低含有细胞簇的细胞密度50％所需的药物浓度(mIC50)。两种IC50值均是通过在显微镜下进行视觉观察和对每集落细胞以及集落的数目计数来测定肿瘤细胞和簇细胞的密度获得的。化合物的治疗指数是由mIC50/tIC50比值定量表示的，当数值大于1时表明对肿瘤靶有特异性。
按上述基本相同的方法进行另外的测定，但用另外的指示肿瘤细胞系来代替T24-BAG细胞。用表达为活化的K-ras基因的DLD-1-BAG人结肠癌细胞或者表达为活化的K-ras基因的SW620-BAG人结肠癌细胞进行测定。使用本领域已知的其他肿瘤细胞系，可以证明本发明的化合物对其它类型癌细胞(例如本文前述的那些)的活性。
4.软琼脂测定无贴壁依赖性生长是致癌性细胞系的一种特征。将人肿瘤细胞悬浮于含有0.3％琼脂糖和指明浓度的法呢基转移酶抑制剂的生长培养基中。将溶液覆盖至用0.6％琼脂糖固化的，含有与顶层相同浓度的法呢基转移酶抑制剂的生长培养基上。顶层固化后，将平板于37℃在5％CO2中孵育10-16天以使集落过度生长。孵育后，用MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物，噻唑基蓝)(1mg/ml在PBS中)溶液覆盖琼脂将集落染色。计数集落并测定IC50′s。
表1-FPT抑制作用
<p>表2FPT抑制和GGPT抑制的对比
表3在COS细胞中的活性
表4抑制肿瘤细胞生长-簇测定
人肿瘤细胞生长的抑制作用——软琼脂测定软琼脂测定是用实例10化合物和以下肿瘤细胞系进行的K rasNIH 3T3；H ras NIH 3T3；HTB 177(NBCLC)K ras突变； HTB173(NCI H146)(SCLC)ras突变未被检测；A549(肺)K ras突变；HTB 175(SCLC)ras突变未被检测；HTB 119(NCI H69)(SCLC)；HTB 183(NCI H661)(NSCLC)ras突变未被检测；HPAF II(胰腺)K ras突变；MCF-7(乳腺)ras突变未被检测；HBL 100(乳腺)ras突变未被检测；Du 4475(乳腺)ras突变未被检测；MDA MB468(乳腺)ras突变未被检测；DU 145(前列腺)ras突变未被检测；MDA MB453(乳腺)；BT 474(乳腺)；PC3(前列腺)；DLD1(结肠)K ras突变；和AsPc-1(胰腺)K ras突变。Ras突变情况通过ELISA(Oncogene Science)测定。对各细胞系的IC50(μM)是在0.04至3.0的范围内。
软琼脂测定是以实例18化合物和以下肿瘤细胞系进行的K rasNIH 3T3；H ras NIH 3T3；HTB 177(NSCLC)K ras突变，A549(肺)K ras突变；和HTB 175(SCLC)ras突变未被检测。对Ras突变情况通过ELISA(Oncogene Science)测定。各细胞系的IC50(μM)是在0.175和3.8的范围内。结果1.酶学数据表明，用部分纯化的大鼠脑的法呢基蛋白转移酶(FPD)，本发明化合物是Ras-CVLC法呢基化的抑制剂。数据也表明，用部分纯化的大鼠脑FPT，本发明中的一些化合物可被认为是非常强(IC50＜＜0.1μM)的Ras-CVLS法呢基化抑制剂。
数据也表明，在用Ras-CVLL作为异戊二烯类受体来测定时，本发明的化合物是弱的牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶(GGPT)抑制剂。这种选择性对本发明方法中使用的化合物的治疗潜力是很重要的，并且当化合物对Ras-转化的细胞具有选择性的生长抑制性质时，将增加其治疗潜力。
2.以细胞为基础的COS细胞测定对在Ras转染的COS细胞中表达的Ras蛋白的Western印迹分析并随之用本发明的三环法呢基蛋白转移酶抑制剂处理，表明它们抑制Ras-CVLS的加工，导致未加工的Ras的聚积(见表3)。实例2的化合物，例如，抑制Ras-CVLS的加工，IC50值为0.025μM，但在浓度高达33μM却不阻断Ras-CVLL的牻牛儿基牻牛儿基化。
这些结果提供了本发明化合物在完整的细胞中特异性地抑制法呢基蛋白转移酶，但不抑制牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶I的证据，并且表明它们阻断由活化的Ras致癌基因引起的细胞转化的潜力。
3.以细胞为基础的细胞簇测定本发明三环的法呢基蛋白转移酶抑制剂在簇测定中也抑制了Ras-转化的肿瘤细胞的生长，而没有表现出对正常单层细胞的毒性活性。体内抗肿瘤研究皮下接种DLD-1(人结肠癌细胞ATCC#CCL 221)肿瘤细胞(5×105至8×106)至5-6周龄无胸腺nu/nu雌性小鼠的胁腹。当肿瘤形成时，选择带有肿瘤的动物并随机分组。只用载体(腹腔注射β-环糊精或口服玉米油)或用溶于在载体中的本发明化合物，每日四次(QID)，每周7天处理动物4周。通过对肿瘤的测量来测定对于载体对照组肿瘤生长的百分抑制。
对实例1、2、4、5、6、7、7A、8B、9、10、11A、11B、12B、13、14A、16B和18的每个化合物的平均％肿瘤抑制率，剂量为10mg/kg口服时是7至50％，和剂量为50mg/kg口服时是35.4-83。
为从本发明所述的化合物制备药物组合物，惰性的，可药用的载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉剂，片剂，可分散的颗粒剂，胶囊剂，扁囊剂和栓剂。粉剂和片剂可包含有从约5-70％的活性成分。适宜的固体载体在本领域中是已知的，例如碳酸镁，硬脂酸镁，滑石粉，糖，乳糖。片剂，粉剂，扁囊剂和胶囊剂可用作适宜口服给药的固体剂型。
为制备栓剂，低熔点的蜡例如脂肪酸甘油酯的混合物或可可奶油可先熔化，并通过搅拌将活性成分在其中均匀地分散。然后将熔化均匀的混合物倾入至大小适宜的模具中，使其冷却固化。
液体形式制剂包括溶液，悬浮剂及乳剂。做为实例可提及的是水或水-丙二醇溶液供肠道外注射。
液体形式制剂也可包括鼻内给药的溶液。
适宜于吸入的气雾剂可以包括溶液或粉末剂式的固体，它可以与可药用的载体，例如与惰性压缩气体组合。
也包括固体形式制剂，该制剂可在使用前很快转变成液体形式制剂以供口服或非肠道给药。这样的液体形式包括溶液，悬浮剂及乳剂。
本发明的化合物也可以经皮输送。经皮的组合物可以采用乳膏，洗剂，气雾剂和/或乳剂并且可以包括在基质的经皮膏药或以此为目的在本领域中常见贮备形式。
优选的化合物是口服给药。
优选地，药物制剂是单位剂量形式。在这样的形式中，制剂分为含有适宜量的(例如达到期望目的的有效量)活性组分的单位剂量。
在制剂的单位剂量中活性化合物的量，按照具体的施用，可以从约0.1mg到1000mg变化或调整，更优选地从约1mg到300mg。
实际应用的剂量可以根据患者的需要以及需处理病情的严重性而变化。对具体情况确定适宜的剂量是在本领域的技术中。一般来说，治疗是以小于化合物最适剂量的较小的剂量开始的。此后，以小的增加度增加剂量直到在此情况下达到最佳效果。为了方便，可将总的每日剂量分开并在该天分批给药。
施用本发明化合物的其可药用的盐的量和频率可以根据医生所考虑到的因素如年龄，病情和患者形体以及需要治疗的症状的严重性的判断而加以调整。典型的推荐剂量规则是口服给药从10mg至2000mg/天，优选地10至1000mg/天，分成二到四次的剂量以阻止肿瘤生长。当在此剂量范围中给药时，化合物是无毒性的。
以下为药物剂型的实例，它包含有本发明的化合物。在其药物组合物方面，本发明的范围并不受所提供的实例的限制。
药物剂型实例实例A片剂
制备方法将第1和2项在适宜的混合器中混合10-15分钟。将混合物用第3项制粒。如果需要通过粗筛(例如1/4″，0.63cm)磨潮湿的颗粒。干燥潮湿颗粒。如果需要将干燥的颗粒过筛并与第4项混合10-15分钟。加入第5项并混合1-3分钟。压缩混合物至合适的形状并在适宜的片剂机上称重。
实例B胶囊剂<
在适宜的掺合器中将第1、2、3项混合10-15分钟。加入第4项并混合1-3分钟。将混合物装填入适宜的包囊操作机上适宜的两半片硬明胶胶囊中。
当本发明与以上说明的具体实施方案一起描述时，它的许多变换，修改和变化对本领域普通的技术人员是显而易见的。所有这样的变换，修改和变化仍包含在本发明的精神与范围中。
权利要求
1.选自以下的一种化合物或其可药用的盐
(+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体(-)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体；(+)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体；
2.权利要求1的化合物选自以下
(+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(-)-对映体；(+)-对映体；
(-)-对映体； (+)-对映体；
(-)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体；
(+)-对映体；(+)-对映体，
(-)-对映体；(+)-对映体；
(-)-对映体；(+)-对映体；
(+)-对映体；(-)-对映体；
(+)-对映体； (-)-对映体 ；
(+)-对映体；
3.权利要求1的化合物选自以下
(-)-对映体； (-)-对映体；
(-)-对映体(-)-对映体；
4.权利要求1的化合物选自以下
(+)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (+)-对映体；
(+)-对映体； (+)-对映体；
5.一种化合物选自以下
(+)-对映体；
(-)-对映体；
6.权利要求5的化合物选自以下
(+)-对映体；
7.权利要求5的化合物具有下式
8.权利要求5的化合物具有下式
(+)-对映体
9.权利要求5的化合物具有下式
10.权利要求1的化合物选自以下
(+)-异构体
11.一种药物组合物，包括有效量的权利要求1到10中任一化合物和可药用的载体。
12.权利要求1到10的任一化合物，用于制造抑制法呢基蛋白转移酶的药物。
13.权利要求1到10的任一化合物制造用于治疗胰腺癌、肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征、表皮癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌的药物。
14.权利要求1到10的任一化合物用于在需要治疗的患者中抑制法呢基蛋白转移酶，包括施用有效量的权利要求1到10的任一化合物。
15.权利要求1到10的任一化合物用于在需要治疗的患者中治疗胰腺癌、肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征、表皮癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌，包括施用有效量的权利要求1到10的任一化合物。
16.权利要求1到10的任一化合物用于制造抑制细胞异常生长的药物。
17.权利要求1到10的任一化合物用于制造抑制细胞异常生长的药物，其中被抑制的细胞是一种表达活化的ras致癌基团的肿瘤细胞。
18.权利要求1到10的任一化合物用于制造抑制细胞异常生长的药物，其中被抑制的是肿瘤细胞，而其中是Ras蛋白而不是Ras基因作为基因中致癌基因突变的结果被活化。
19.权利要求11的化合物用于制造抑制法呢基蛋白转移酶的药物。
20.权利要求11的化合物用于制造治疗胰腺癌、肺癌、骨髓性白血病、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征、表皮癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌的药物。
全文摘要
公开了新化合物,如式(1.0)、(4.0)、(22.0)、(27.0)、(32.0)和(39.0)。也公开了用新化合物抑制细胞的异常生长,抑制法呢基蛋白转移酶及治疗癌症的方法。
文档编号A61K31/496GK1209127SQ96180075
公开日1999年2月24日 申请日期1996年12月19日 优先权日1995年12月22日
发明者R·J·多尔, J·M·克利, F·G·恩乔罗格, A·K·马拉姆斯, S·W·雷米斯泽斯基, A·G·塔维拉斯 申请人:先灵公司