专利名称：用于预防和治疗hiv感染的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的HIV多肽构建体、它们在医药中的用途、含有它们的药物组合物和它们的制备方法。本发明还涉及编码该多肽的多核苷酸。具体而言，本发明涉及包含HIV-I Nef和HIV-I Gag或其片段的融合蛋白，和编码它们的多核苷酸。更具体而言，本发明涉及包含HIV-I Nef、HIV-l Pol和HIV-I Gag蛋白或其片段的融合蛋白和编码它们的多核苷酸。HIV-I是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要原因，AIDS被认为是世界主要健康问题中的ー种。因此需要能够用于HIV感染的预防和/或治疗的疫苗。
背景技术：
HIV-I是逆转录病毒科的RNA病毒。HIV基因组编码至少9种蛋白，它们分成三类主要的结构蛋白Gag、Pol和Env、调节蛋白Tat和Rev及辅助蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组显示所有逆转录病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3/组构。HIV包膜糖蛋白gpl20是用于附着宿主细胞的病毒蛋白。这种附着通过与称作⑶4的辅助T细胞和巨噬细胞的两种表面分子和两种趋化因子受体CCR-5或CXCR-4之ー结合而介导产生。gpl20蛋白首先表达为较大的前体分子(gpl60)，然后翻译后裂解产生gpl20和gp41。gpl20蛋白通过与插入到病毒膜中的gp41分子连接而保留在病毒体表面上。gpl20蛋白是中和抗体的主要靶，但遗憾的是，该蛋白最具免疫原性的区(v3环)也是该蛋白变异性最大的部分。因此，认为gpl20(或其前体gpl60)用作引发中和抗体的疫苗抗原对于广泛的保护性疫苗仅具有有限的作用。gpl20蛋白还含有被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够消除病毒-感染的细胞，且因此构成第二种主要抗病毒免疫机制。与中和抗体的目标区相反，某些CTL表位似乎在不同HIV株中相对保守。为此，认为gpl20和gpl60是疫苗中的有效抗原性组分，目的在于引发细胞-介导的免疫反应(特别是CTL)。HIV-I的非包膜蛋白包括，例如内部结构蛋白如gag和pol基因产物和其它非结构蛋白如 Rev、Nef、Vif 和 Tat (Green 等人，New England J. Med, 324, 5, 308et seq(1991)和Bryant 等人(Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J. ,11,5, 390et seq (1992) HIV Nef是早期蛋白，即它们在感染早期及没有结构蛋白的情况下表达。Nef基因编码早期辅助HIV蛋白，其已经显示出具有若干活性。例如，Nef蛋白已知可引起⑶4、HIV受体、和细胞表面的I类MHC分子的下调，但还没有讨论过这些功能的生物学重要性。此外，Nef与T细胞信号途径相互作用并诱导活性状态，其依次可促进更有效 的基因表达。某些HIV分离物在该区具有突变，其引起它们不编码功能性蛋白且严重危害它们的体内复制和发病。
Gag基因作为前体糖蛋白被翻译，其被蛋白酶裂解产生产物，该产物包括基质蛋白(P17)、衣壳(p24)、核衣壳(p9)、p6和两个间隔肽，p2和pi。Gag基因导致产生55-千道尔顿(kD) Gag前体蛋白，也称作p55，其自未剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被肉豆蘧酰化，引起它与细胞膜的胞质方面相关联。膜相关的Gag糖蛋白募集病毒基因组RNA的两个拷贝连同引起病毒颗粒从感染细胞表面出芽的其它病毒蛋白和细胞蛋白。出芽后，在病毒成熟为4个被称作MA (基质[pl7])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])、和p6的较小蛋白的过程中，p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)裂解。除了 3种主要的Gag蛋白外，所有Gag前体均含有若干其它区，它们被裂解并作为 各种大小的肽保留在病毒体中。这些蛋白具有不同作用，例如，P2蛋白在蛋白酶的调节活性中具有预期的作用并对蛋白分解处理的正确时间控制作出贡献。pl7(MA)多肽来源于p55的N-末端的肉豆蘧酰化末端。绝大多数MA分子保持附着于病毒体脂双层的内表面，从而使颗粒稳定。MA的一个亚群在病毒体深层募集，它在那里变成复合物的一部分，其运送病毒DNA到细胞核。这些MA分子可帮助病毒基因组的核转运，这是因为MA上的亲核信号可由细胞核输入机械识别。这ー现象使得HIV感染未-分裂的细胞，这是逆转录病毒与众不同的性质。p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A已被证实可与p55的p24区相互作用，导致其掺入到HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用很重要，因为亲环蛋白A所致该相互作用的破坏可抑制病毒复制。Gag的NC区负责特异性识别HIV所谓的包装信号。该包装信号由位于病毒RNA 5’末端附近的4个茎环结构组成，且足以介导异源RNA插入到HIV-I病毒体中。NC通过由两个锌-指基序介导的相互作用与包装信号結合。NC也促进逆转录。p6多肽区介导p55 Gag与辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr掺入到组装中的病毒体中。P6区还含有所谓的晚期结构域，其是从感染细胞出芽的病毒体有效释放所需的。Pol基因编码含有早期感染中病毒所需的两种活性的两种蛋白，即RT和病毒DNA整合到细胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒体蛋白酶裂解产生氨基末端RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA-依赖性DNA聚合酶活性以及RNA酶H功能)并产生羧基末端整合酶蛋白。HIV RT是全长RT(p66)和缺少羧基末端RNA酶H结构域的裂解产物(P51)的异ニ聚物。RT是由逆转录基因组编码的保守性最高的蛋白之一。RT的两种主要活性是DNAPol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可交换地利用RNA和DNA作为模板且与所有已知的DNA聚合酶一祥，不能开始从头DNA合成，但需要预先存在的分子作为引物(RNA)。所有RT蛋白固有的RNA酶H活性在除去作为DNA合成继续的RNA基因组的复制早期起重要作用。它选择性地使所有RNA-DNA杂交分子的RNA降解。结构上，聚合酶和核糖核酸H占据分开的、不重叠的结构域，其中Pol覆盖Pol三分之ニ的氨基。p66催化亚单位折叠成5个不同的亚结构域。它们的氨基末端23具有RT活性部分。这些的羧基末端是RNA酶H结构域。WO 03/025003 描述了编码 HIV-lpl7/24 Gag、Nef 和 RT 的 DNA 构建体，其中该 DNA序列可被密码子优化，从而类似高水平表达的人类基因。这些构建体用于DNA疫苗中。含多种HIV抗原的融合蛋白已被建议作为HIV的疫苗候选者，例如WO 99/16884中描述的Nef-Tat融合体。然而，融合蛋白不会直接产生；表达它们有困难是因为它们与天然蛋白不相应。在转录水平、或其它下游可能有困难。且，它们不能被直接配制成药学上可接受的组合物。特别是，包括融合在一起的多种抗原的绝大多数HIV疫苗形式是DNA或活的载体形式，而不是多肽融合蛋白。

发明内容
本发明提供用于HIV感染和AIDS的预防和治疗的疫苗中的新的构建体。一方面，本发明提供ー种多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当pl7和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少ー个HIV抗原或免疫原性片段。在此处所述本发明的构建体和组合物中，Nef优选是全长Nef。在本发明的构建体中，pl7 Gag和p24 Gag优选分别是全长pl7和p24。在其中一个实施方案中，该多肽同时包含pl7和p24 Gag或其免疫原性片段。在这类构建体中，p24 Gag组分和pl7 Gag组分被至少ー个其它HIV抗原或免疫原性片段，如Nef和/或RT或其免疫原性片段或衍生物分开。可选择性地，pl7或p24 Gag可分开提供。因此，本发明还提供一种组合物，它包括(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物；或(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)pl7 Gag或其免疫原性片段或衍生物。在另ー实施方案中，本发明的多肽构建体还包括Pol或Pol的衍生物如RT或其免疫原性片段或衍生物。适用于本发明的RT的特定片段是其中RT在C末端被截短，优选使得它们缺少羧基末端RNA酶H结构域的片段。ー个缺少羧基末端RNA酶H结构域的这类片段是此处所述P51片段。优选，此处所述融合蛋白中的RT或免疫原性片段是p66 RT或p51 RT。本发明融合蛋白或组合物的RT组分任选在第592位包括突变，或在除了 HXB2的株中包括等同突变，这样一来甲硫氨酸通过突变成另ー残基，例如赖氨酸而被除去。该突变的目的是除去起原核生物表达系统中内部起始位点作用的位点。RT组分还，或可选择性地，包括突变以除去酶活性(逆转录酶)。因此K231可以代替W存在。在本发明包含p24和RT的融合蛋白中，可优选在该构建体中p24在RT之前，这是因为当抗原在大肠杆菌中单独表达时，观察到P24的表达较之RT的表达更好。本发明的优选构建体包括下列I. p24-RT-Nef-pl7 2. p24-RT*-Nef-pl73. p24-p51RT-Nef-pl74. p24-p51RT*-Nef-pl7
5. pl7-p51RT-Nef6. pl7-p51RT*-Nef7. Nef-pl78.具有接头的Nef_pl7
9. pl7-Nef10.具有接头的 pl7_Nef*代表RT甲硫氨酸592突变成赖氨酸上面所列构建体中包括的接头可以是任意较短的氨基酸序列，用于降低与它连接在一起的两个融合配偶体之间潜在的相互作用。该接头可以是例如4-10个氨基酸长。例如，它可以是6个氨基酸的序列，如此处实施例所述GSGGGP序列。另ー方面，本发明提供ー种HIV抗原的融合蛋白，它包括至少4种HIV抗原或免疫原性片段，其中这4种抗原或片段是或来自Nef、Pol和Gag。优选Gag作为两个分开的组分存在，其被融合体中的至少ー个其它抗原分开。优选，Nef是全长Nef。优选Pol是p66或P51RT。优选，Gag是pl7和p24Gag。本发明这一方面中融合体的抗原组分的其它优选特征和性质在此处描述。本发明这一方面的优选实施方案是上面已经列出的4种组分的融合体I. p24-RT-Nef-pl72. p24-RT*-Nef-pl73. p24-p51RT-Nef-pl74. p24-p51RT*-Nef-pl7包括在本发明中的与HIV抗原有关的术语“来源干”或“衍生物”是指与天然对应物相比，抗原已经以有限的方式被改变。这包括点突变，其可改变蛋白的性质，例如通过提高在原核系统中表达或除去不希望的活性包括不希望的酶活性。此处对于RT所描述的点突变被设计用于实现这些情况。然而，该抗原必须保持与天然抗原足够相似，这样它们可保留疫苗中所希望的抗原性质且因此它们保持能够引起对天然抗原的免疫反应。具体的衍生物是否引起这类免疫反应可通过适宜的免疫学測定法如ELISA(对于抗体反应)或使用细胞标记和细胞因子的适宜染色的流式细胞术(对于细胞反应)測量。本发明HIV抗原的多肽构建体能够在体外系统包括原核生物系统如大肠杆菌中表达。有利地，它们可通过常规纯化方法纯化。当在所选择的表达系统中表达时，此处所述融合体优选可溶，就是它们大量存在于表达系统粗提物的上清液中。粗提物中融合蛋白的存在可通过常规方法測量，如在SDS凝胶上电泳、考马斯染色和通过密度測量而检查适宜的帯。本发明的融合蛋白优选至少50 %可溶，更优选至少70 %可溶，且最优选90 %或更多可溶，这是通过实施例中所述技术测量的。提高重组表达蛋白溶解度的技术是已知的，例如，在原核生物表达系统中，溶解度通过降低诱导基因表达时的温度而提高。可纯化此处所述融合蛋白。具体而言，当保持可溶或显著可溶时可纯化它们。此处所述免疫原性片段将含有该抗原的至少ー个表位并显示出HIV抗原性，且当以适宜构建体存在时，能够提高免疫反应，例如当与其它HIV抗原融合或在载体上存在吋，免疫反应针对天然抗原。通常，免疫原性片段含有至少20、优选50、更优选100个来自HIV抗原的连续氨基酸。本发明另一方面提供编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用作多核苷酸疫苗。该多核苷酸可存在于本领域普通技术人员已知的任意递送系统内，包括核酸表达系统如质粒DNA、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术都是本领域熟知的，如 Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198，1998和其中引用的參考文献描述的那些。适宜的核酸表达系统含有在患者中表达的必需DNA序列(如适宜的启动子和終止信号)。当表达系统是重组活微生物，如病毒或细菌吋，目标基因可被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。使用该活的载体进行接种和体内感染将导致抗原的体内表达和免疫反应的诱导。用于该目的的病毒和细菌是，例如痘病毒(例如牛痘、禽痘、金丝雀痘、修饰痘病毒,例如修饰的病毒Ankara(MVA))、甲病 毒(新培斯病毒、Semliki Forest病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘帯状疱疹病毒等)、麻疹病毒(例如，麻疹)、李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是有毒的，或以各种方式减毒以获得活疫苗。这种活疫苗形成本发明的一部分。用作本发明活载体的优选麻疹载体是施瓦茨氏株或从其衍生的株系。用作活载体的优选腺病毒是低血清阳性率人腺病毒如Ad5或Ad35或非人来源的腺病毒如非人灵长类动物腺病毒如猿腺病毒。这种低血清阳性率人腺病毒或类似的腺病毒在人群中具有低于60，通常低于50%的血清阳性率。优选，载体是复制缺陷的。通常，这些病毒含有El缺失且可在用El基因转化的细胞系上生长。优选的猿腺病毒是从黑猩猩中分离出来的病毒。具体而言，C68(也称作Pan 9)(见美国专利No6083 716)和Pan 5、6和Pan7 (W0 03/046124)优选用于本发明中。这些载体可被操纵插入本发明的异源多核苷酸，这样一来就可表达本发明的多肽。这类重组腺病毒载体的应用、配制和制造在WO 03/046142中详细描述。因此，本发明优选疫苗的Nef、pl7和p24 Gag和RT可以编码所需多肽的多核苷酸形式提供。本发明的多核苷酸可用于在所选择表达系统中表达编码的多肽。至少ー个HIV抗原，例如，RT，可被多核苷酸中的密码子优化序列编码，也就是说该序列已被优化以便在所选择的重组表达系统如大肠杆菌中表达。另ー方面，本发明提供ー种p51RT多肽或其衍生物或编码它的多核苷酸,优选为在适宜的表达系统，特别是原核生物系统如大肠杆菌中表达而被密码子优化。p51RT多肽或多核苷酸可单独使用，或与本发明的多肽或多核苷酸构建体组合使用。因此，另一方面，本发明提供一种组合物，它包括(i)含有Nef或含Nef表位的片段和pl7 Gag和/或p24 Gag的多肽，其中当pl7和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少ー个HIV抗原或免疫原性片段，和(ii)p51 RT多肽。本发明还提供编码这些的多核苷酸。根据该实施方案，⑴可选自，例如I. Nef-p172.具有接头的Nef_pl73. pl7-Nef
4.具有接头的pl7_Nef优选Nef是全长Nef。优选pl7是全长pl7。本发明的多肽和多核苷酸可与其它抗原或编码其它抗原的多核苷酸组合。具体而言，这可包括HIV env蛋白或其片段或衍生物。env的优选形式是gpl20、gpl40和gpl60。env可以是，例如，WO 00/07631中描述的包膜蛋白，其来源于被称作R2的HIV-I进化枝B包膜克隆，或其片段或衍生物。因此，本发明还提供一种组合物，它包含本发明的任意多肽或多肽组合物，以及HIV env蛋白或其片段或衍生物。类似地，本发明提供一种组合物，它包含编码本发明多肽的多核苷酸和编码HIV env蛋白或其片段或衍生物的多核苷酸。本发明还提供制备此处所述多肽的方法，该方法包括在适宜的表达系统，特别是原核生物系统如大肠杆菌中表达编码多肽的多核苷酸，并回收表达的多肽。优选在低温，即 低于37°的温度下诱导表达，从而促进多肽的溶解。本发明还提供一种纯化此处所述多肽的方法，该方法包括i).提供含未纯化多肽的组合物；ii).使该组合物经过至少两个色谱步骤；iii).任选地使该多肽羧基酰胺化；iv)进行缓冲液更换步骤以提供用于药物制剂的适宜缓冲液中的蛋白。羧基酰胺化可在两个色谱步骤之间进行。羧基酰胺化步骤可使用碘こ酰亚胺进行。在其中一个实施例中，本发明方法使用至多两个色谱步骤。本发明还提供含本发明多肽和多核苷酸以及药学上可接受的佐剂或载体的药物组合物和免疫原性组合物和疫苗。本发明的疫苗可用于HIV的预防或治疗性免疫。本发明还提供此处所述多肽和多肽组合物以及多核苷酸和多核苷酸组合物在制备用于HIV的预防或治疗性免疫的疫苗中的应用。本发明的疫苗含有免疫保护或免疫治疗量的多肽和/或多核苷酸抗原且可通过常规技术制备。疫苗的制备通常在New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人编辑，University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978 中描述。在脂质体内的包囊化由Fullerton, U. S. Patent 4，235，877描述。蛋白与大分子的缀合由Likhite,U. S. Patent 4，372，945 和 Armor 等人，美国专利 4，474，757 公开。疫苗剂量中蛋白的量可选择为在一般疫苗接种者中诱导免疫保护反应，而没有显著的不利副作用的量。这种用量将根据所用具体的免疫原和所选择的接种方案而变化。通常，预期各剂含有1-1000 μ g每种蛋白，优选2-200 μ g，最优选4-40 μ g多肽融合体。具体疫苗的最佳用量可通过标准研究确定，包括受治疗者中抗体滴度和其它免疫反应的观察。最初接种后，受治疗者可在约4周内接受加强免疫，和随后弟_■次加强免疫。本发明的蛋白优选与佐剂一起用于本发明的疫苗制剂中。佐剂一般在VaccineDesign-the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, PlenumPress, New York, 1995 中描述。适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝或磷酸铝，但还可以是钙、铁或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖的不溶性混悬液，阳离子或阴离子衍生的多糖，或含聚磷腈。在本发明的制剂中，优选佐剂组合物诱导优先的Thl反应。然而，应了解其它反应，包括其它体液反应也不排除。通过抗原与免疫系统细胞的相互作用，对抗原产生免 疫反应。所得免疫反应可广义区别为两个极端的种类，即体液或细胞介导的免疫反应(常规分别由保护的抗体和细胞效应机制鉴别)。这些类的反应被称作Thl-型反应(细胞-介导的反应)，和Th2-型免疫反应(体液反应)。极端的Thl-型免疫反应可通过抗原特异性的、单倍型限制的细胞毒性T淋巴细胞、和天然杀伤细胞反应的产生鉴别。在小鼠中，Thl-型反应常常通过IgG2a亚型抗体的产生鉴别，而在人类中，这些相当于IgGl型抗体。Th2-型免疫反应的特征在于较宽范围免疫球蛋白同种型，包括小鼠中IgGl、IgA和IgM。可认为这两种类型免疫反应发展背后的驱动カ是细胞因子，即许多已经确定的蛋白信使，其可帮助免疫系统的细胞并引导最后的免疫反应向着Thl或Th2反应的方向。因此，高水平的Thl-型细胞因子倾向有利于对已知抗原诱导细胞介导的免疫反应，而高水平的Th2-型细胞因子倾向有利于对抗原诱导体液免疫反应。重要的是应记住Thl和Th2_型免疫反应的区别不是绝对的。事实上，个体将支持免疫反应，其被描述为占优的Thl或占优的Th2。然而，常常方便地认为是Mosmann和Coffman在鼠⑶4+ve T细胞克隆中描述的细胞因子家族(Mosmann, T. R.和Coffman,R. L. (1989)THland TH2 cells !different patterns of lymphokine secretion lead todifferent functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173)。通常，Thl-型反应与T-淋巴细胞所致INF-Y和IL-2细胞因子的产生有夫。常常直接与Thl-型免疫反应的诱导有关的其它细胞因子不是由T-细胞，如IL-12。相反，Th2-型反应与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-β (TNF-β)的分泌有夫。已知特定的疫苗佐剂特别适合于Thl或Th2_型细胞因子反应的刺激。通常，接种或感染后，免疫反应的Thl Th2平衡的最佳指示剂包括測量使用抗原再次刺激之后，T淋巴细胞体外所致Thl或Th2细胞因子的产生，和/或測量抗原特异性抗体反应的IgGl IgG2a 比。因此，Thl-型佐剂是当体外使用抗原再次刺激时，刺激分离的T-细胞群产生高水平Thi-型细胞因子，并诱导与Thl-型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的佐剂。可配制生产适用于本发明的佐剂的优选Thl-型免疫刺激剂包括且不限于下列。单磷酰脂A，特别是3-脱氧-酰化单磷酰脂A(3D_MPL)是用于本发明的优选Thl-型免疫刺激剂。3D-MPL是由Ribi Immunochem, Montana制造的熟知佐剂。化学上，常常以3-脱氧-酰化单磷酰脂A与4，5，或6酰化链混合物的形式提供。它可通过GB2122204B中教导的方法纯化并制备，该文献还公开了ニ磷酰脂A，及其3_0_脱酰化变体的制备。已经描述过其它纯化且合成的脂多糖(US 6，005，099和EP O 729473 BI ；Hilgers等人，1986, Int. Arch. Allergy. Tmmunol.，79 (4) :392-6 ；Hilgers 等人，1987, Immunology,60 (I) :141-6 ;和EP 0549074B1)。3D-MPL的优选形式是具有直径小于O. 2 μ m的较小粒度的颗粒制剂形式，且其制备方法在EP O 689 454中公开。皂苷也是本发明的优选Thl免疫刺激剂。皂苷是熟知的佐剂且在Lacai Ile-Dubois, M 和 Wagner H. (1996.A review of the biological andpharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2pp 363-386)中教导。例如，Quil A(来源于南美树木Quillaja Saponaria Molina的树皮)及其级分在 US 5，057，540 和“Saponins as vaccine adjuvants，，，KensiI, C. R. , Crit Rev TherDrug Carrier Syst, 1996,12(1-2) :1-55;和 EP 0 362279 BI 中描述。溶血皂苷 QS21 和QS17(Quil A的HPLC纯化的级分)已被 描述为有效的系统佐剂，且它们的生产方法在USPatent No. 5，057，540和EP O 362 279 BI中公开。在这些文献中还描述了 QS7 (Quil-A的非-溶血级分)的用途，其可作为系统疫苗的有效佐剂。QS21的用途在Kensil等人(1991.J. Immunology vol 146,431-437)中进ー步描述。QS21和吐温或环糊精的组合也是已知的(W0 99/10008)。包含QuilA级分，如QS21和QS7的颗粒佐剂系统在WO 96/33739和WO96/11711中描述。其中一个这类系统被称作Iscorn且可含有ー种或多种皂苷。另ー优选的免疫刺激剂是含未甲基化的CpG 二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的縮写词。当通过全身和粘膜途径给药时，CpG在本领域中已知可作为佐剂(W0 96/02555，EP 468520，Davis等人，J. Tmmunol,1998,160(2) :870-876 ；McCluskie 和 Davis, J. Immunol. ,1998,161(9)4463-6)。历史上，观察到BCG的DNA级分可发挥抗-肿瘤作用。在进ー步的研究中，来源于BCG基因序列的合成寡核苷酸显示出能够诱导免疫刺激作用(不论体外还是体内)。这些研究的作者推断出特定的回文序列，包括中心的CG基序，具有该活性。CG基序在免疫刺激中的重要作用随后在Krieg，Nature 374，p546 1995的出版物中说明。详细分析显示CG基序必须位于特定的序列背景中，且这类序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中却是稀有的。免疫刺激序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序没有甲基化；但其它未甲基化的CpG序列已知是免疫刺激性的且可用于本发明中。在六个核苷酸的特定组合中，存在回文序列。一些这样的基序，或者作为其中ー个基序的重复单位，或者作为不同基序的组合，可存在于同一寡核苷酸中。一个或多个这些含寡核苷酸的免疫刺激序列的存在可激活各种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素Y并具有细胞溶解活性)和巨噬细胞(Wooldrige等人，Vol 89 (no. 8)，1977)。其它不含该共有序列、含未甲基化CpG的序列现也显示出是免疫调节的。当配制成疫苗时，CpG通常以游离溶液连同游离抗原(W096/02555 ；McCluskieand Davis, supra)或与抗原共价缀合(W098/16247)或使用载体如氢氧化招配制的形式给药((Hepatitis surface antigen)Davis 等人 supra ;Brazolot_Millan 等人，Proc. Natl.Acad. Sci.，USA,1998,95(26)，15553-8)。可将上述这类免疫刺激剂连同载体一起配制，如脂质体、水包油乳液，和/或金属盐，包括铝盐(如氢氧化铝)。例如，3D-MPL可使用氢氧化铝(EP O 689 454)或水包油乳液(W0 95/17210)配制；QS21可有利地使用含胆固醇的脂质体(W0 96/33739)、水包油乳液(W) 95/17210)或明矾(W) 98/15287)配制；CpG可使用明矾(Davis等人，supra ；Brazolot-Millan supra)或其它阳离子载体配制。免疫刺激剂的组合也是优选的，特别是单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合(W094/00153 ；W0 95/17210 ；W0 96/33739 ；W0 98/56414 ；W0 99/12565 ；W0 99/11241)，更特别是TO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合。可选择性地，CpG加皂苷如QS21的组合也可形成用于本发明的有效佐剂。可选择性地，可在脂质体或Iscorn中配制皂苷并与免疫刺激性寡核苷酸组合。因此，适宜的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂A，优选3D-MPL，连同铝盐的组合。增强的系统包括单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或W096/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中QS21在含胆固醇的脂质体(DQ)中被猝灭。此外，该组合还含有免疫刺激性寡核苷酸。水包油乳液形式的、含QS21，3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂在WO95/17210中描述，且是用于本发明的另ー优选制剂。另ー优选制剂包含単独的CpG寡核苷酸或连同铝盐。 本发明又一方面提供一种制备此处所述疫苗制剂的方法，其中该方法包括将本发明的多肽与适宜佐剂混合。用于本发明制剂的特别优选的佐剂组合如下i)3D_MPL+QS21，在脂质体中ii)Alum+3D-MPLiii)Alum+QS21，在脂质体中 +3D-MPLiV) Alum+CpGV)3D_MPL+QS21+水包油乳液Vi) CpG药物组合物的给药可采用ー个或超过ー个的単独给药形式，例如含有相同多肽组合物的重复给药，或异质性“激发-加強”接种方案。异质性激发-加强方案在激发和加强时，使用不同形式疫苗的给药，其各自本身可包括两次或多次给药。激发组合物和加强组合物将共有至少ー个抗原，虽然无需相同形式的抗原，它可以是不同形式的相同抗原。本发明的激发加强免疫可使用蛋白和基于DNA的制剂的组合进行。这种策略被认为可有效诱导广泛的免疫反应。含佐剂的蛋白疫苗主要包括抗体和T辅助细胞免疫反应，而DNA作为质粒或活载体的递送可诱导较强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。因此，蛋白和DNA接种的组合可提供广泛的免疫反应。这在HIV背景下是特别合适的，因为同时中和抗体和CTL被认为对HIV的免疫防御很重要。根据本发明，接种方案可包括多肽抗原和编码该多肽的DNA的顺序(“激发_加強”)或同时给药。该DNA可以裸DNA如质粒DNA或重组活载体，如痘病毒载体、腺病毒载体、麻疹病毒载体或任何其它适宜活载体的形式递送。蛋白抗原可注射一次或若干次，接着是一次或多次DNA给药，或可首先一次或多次给予DNA，接着进行一次或多次蛋白免疫。本发明激发-加强免疫的具体例子包括使用重组活载体形式的DNA，如修饰的痘病毒载体，例如修饰的病毒Ankara(MVA)或甲病毒，例如委内瑞拉马脑亚病毒载体，或腺病毒载体或麻疹病毒载体激发，接着使用蛋白，优选配有佐剂的蛋白加强。因此，本发明还提供一种药物试剂盒，它包含a) 一种组合物，包括含Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽连同药学上可接受的赋形剂，其中当P17和p24Gag同时存在吋，它们之间有至少ー个HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和b) 一种组合物，包括多核苷酸连同药学上可接受的赋形剂，该多核苷酸编码Nef和Gag中的ー个或多个或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。优选a)的多肽还含有RT或其免疫原性片段或衍生物如p51RT。在可选择的实施方案中，该药物试剂盒包含a) 一种组合物，它包括多核苷酸连同药学上可接受的赋型剂，所述多核苷酸编码 多肽，该多肽含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当P17和p24 Gag同时存在吋，它们之间有至少ー个HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和b) 一种组合物，它包含多肽连同药学上可接受的赋形剂，其中该多肽含有Nef和Gag中的ー个或多个或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。优选，a)的多核苷酸编码多肽，其进ー步包含RT或其免疫原性片段或衍生物如P51RT。用于本发明激发/加强试剂盒中的优选多肽和多核苷酸是此处所述的多肽和多核苷酸。因此，蛋白/DNA型激发加强方法的蛋白组分可以是此处所述任何优选的融合蛋白。同样，DNA组分可以是编码任何优选蛋白的多核苷酸。因此，例如，此处所述p24-RT-Nef_pl7，p24_RT *-Nef-p 17，p24-p51RT_Nef-pl7，p24-p51RT * -Nef-p 17, pl7_p51RT_Nef 或 pl7_p51RT * -Nef 融合体或任何 pl7_Nef 融合体可在激发加强试剂盒中提供，其中激发组合物包含融合蛋白而加强组合物包含编码该融合蛋白的多核苷酸，或激发组合物包含多核苷酸而加强组合物包含融合蛋白。激发组合物和加强组合物均可以超过ー剂的形式递送。此外，初始的激发和加强给药之后，可进ー步给药，其可交替得到，例如DNA质粒激发/蛋白加强/进ー步DNA质粒给药/进ー步蛋白给药。密码子优化是指多核苷酸序列被优化从而类似所需表达系统，例如原核生物系统如大肠杆菌中基因的密码子选择。具体而言，序列中的密码子选择被优化，从而类似高水平表达的大肠杆菌基因。为在本发明重组系统中表达而优化密码子的目的有两重提高重组产物的表达水平并使表达产物更均匀(获得更均匀的表达模式)。均匀性提高意味着无关的表达产物如截短物更少。适于大肠杆菌表达的密码子选择还可消除推断的“移码”序列以及过早終止和/或内部起始位点。DNA代码有4个字母(A，T，C和G)且使用这些拼成三个字母的“密码子”，其代表生物基因中编码的蛋白的氨基酸。沿着DNA分子的密码子线性序列被翻译成由那些基因编码的蛋白中的氨基酸线性序列。代码是高度简并的，61个密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表“終止”信号。因此，绝大多数氨基酸由不止ー个密码子编码-事实上许多由4个或更多不同的密码子编码。当使用不止ー个密码子编码已知氨基酸时，观察到生物的密码子选择模式是高度非随机的。不同物种显示它们密码子选择的不同偏好且，此外，密码子的利用在单一物种的以高水平和低水平表达的基因之间显著不同。这种偏好在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中是不同的，且某些物种显示出较之其它物种，远离随机密码子选择的更强偏好。例如，人和其它哺乳动物与某些细菌或病毒相比，偏好不太強。由于这些原因，源于在大肠杆菌中表达的哺乳动物病毒的病毒基因，或在哺乳动物细胞中表达的外源或重组基因对于有效表达具有不适当的密码子分布存在显著可能性。据信在密码子簇异源DNA序列中的存在或密码子的富足，很少在存在表达的宿主中观察到，它是该宿主中较低异源表达水平的预兆。在本发明的多核苷酸中，密码子选择模式因此可根据典型的人免疫缺陷病毒而改变，从而更接近代表靶生物，例如大肠杆菌的密码子偏好。用于密码子优化的可公开得到的程序有很多，例如，"CalcGene" (Hale andThompson, Protein Expression and Purification 12:185-189(1998)。


图IA和IB是F4p24-RT_Nef-P17的考马斯染色的凝胶(上图)和蛋白质印迹(下 图)的图像(其中使用还原的10% SDS-PAGE)。图2是密码子优化的F4的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。I/未诱导2/B834 (DE3) /F4 (天然基因)3/BLR(DE3) /F4 (天然基因)4/BLR(DE3) /F4 (密码子优化的基因)图3是FT蛋白的比对。 弓丨入点突变以除去酶活性粗体和下划线不同于RT/HXB2的氨基酸强调区RNA酶H结构域粗体整合酶的第一个氨基酸方括号p51的末端图4是P51 RT(密码子优化的)的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。图5是说明RT/P51和RT/p66的溶解度的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。图6是显示Nef_pl7和pl7_Nef融合体的表达的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。图7是说明Nef-pl7、pl7-Nef和Nef蛋白的溶解度的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。图8是显示F4融合蛋白的表达的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。其中在22°C下诱导19小时。
1/F4
2/P4*3/F4 (Q琼脂糖洗脱液样品)2.5yg4/F4 (Q琼脂糖洗脱液样品)250ng
a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000α ρ24 :合并物 3 Mabs (JC 13. I, JC 16. I, IG 8. I. I) 1/5000α RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—:由甲硫氨酸内部“起始”位点产生的带图9是显示F3融合蛋白的表达的考马斯染色的凝胶(上图)和蛋白质印迹(下图)的图像。图10是显示F3*融合蛋白的表达的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。I/阴性对照(B834(DE3>:|>ET29 >
2/F33/FS*a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000a RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—由甲硫氨酸内部“起始”位点产生的带图11是显示F4(p51)的表达的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。图12是显示F4(p51)和F4(p51)*融合蛋白的表达的考马斯染色的凝胶(左图)和蛋白质印迹(右图)的图像。其中在22°C下诱导19小时。I/阴性对照(B834(DE3>:pET29 0
2/F4
3/F4*
4/F4(pS1)
5/F4(p51)*a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000a RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—由甲硫氨酸内部“起始”位点产生的带图13A和13B是显示F4融合蛋白的纯化的考马斯染色的凝胶(A)和蛋白质印迹(B)图像。A :考马斯亮蓝染色的4-20 % SDS-凝胶，5yg蛋白/道；B:抗-p24/抗Nef-Tat蛋白质印迹，O. 5 μ g蛋白/道，第I道，MW标准品；第2道，匀浆；第3道，澄清的匀浆；第4道，重混悬的AS沉淀；第5道，S03洗脱液；第6道，辛基琼脂糖洗脱液；第7道，Q琼脂糖洗脱液 ’第8道，Superdex 200洗脱液。图14A和14B是显示F4(p51)*的纯化的考马斯染色的凝胶(A)和蛋白质印迹(B)图像。A :考马斯亮蓝染色的4-20 % SDS-凝胶，5 μ g蛋白/道；B :抗-p24/抗Nef-Tat蛋白质印迹，OJyg蛋白/道，第I道，匀浆F4;第2道，匀浆F4(p51)* ;第3道，澄清的匀浆；第4道，匀浆沉淀；第5道，AS沉淀上清液；第6道，重混悬的AS沉淀；第7道，S03洗脱液；第8道，辛基琼脂糖洗脱液；第9道，Q琼脂糖选脱液；第10道Superdex 200洗脱液；第11道，Q洗脱液F4 ;第12道，Superdex 200洗脱液F4。图15A和15B是显示F4*融合蛋白的纯化的考马斯染色的凝胶(A)和蛋白质印迹(B)图像。A :考马斯亮蓝染色的4-20 % SDS-凝胶，5 μ g蛋白/道；B :抗-p24/抗Nef-Tat蛋白质印迹，O. 5 μ g蛋白/道，第I道，勻浆；第2道，澄清的匀浆；第3道，重混悬的AS沉淀；第4道，S03洗脱液；第5道，辛基琼脂糖洗脱液；第6道，Q洗脱液；第7道，浓缩/透析的Q琼脂糖洗脱液；第8道,Superdex 200洗脱液;第9道，从Superdex 200洗脱液弃去的级分。图16A和16B是显示F4、F4*和F4(p51)*融合蛋白之间的纯度比较的考马斯染色的凝胶㈧和蛋白质印迹⑶图像。
A :Q洗脱液，B :S200洗脱液。将5μ g蛋白上样到4_12% SDS-凝胶上进行考马斯亮蓝染色(左侧)并将O. 5 μ g上样进行抗-p24/抗-Nef-Tat蛋白质印迹(右侧)。图17是在F4co纯化和羧基酰胺化的F4co纯化后的考马斯染色的凝胶图像。在4-12% SDS凝胶上分离在F4co或F4coca纯化过程中收集的5 μ g各级分。将凝胶考马斯亮蓝染色1 :匀浆；2 CM hyperZ洗脱液；3 :Q琼脂糖洗脱液；4 :纯化级分。图18是F4、F4co和F4coca纯化后的考马斯染色的凝胶图像。在还原条件(左侧)或非还原条件(右侧)下，在4-12% SDS凝胶上分离5 μ g各蛋白。将凝胶考马斯亮蓝染色1 :方法II-F4co ；2 :方法II-F4coca ；3 :方法I-F4coca ；4 方法I-F4 ;5 :方法I-F4羧基酰胺化。图19是ー系列柱状图，显示小鼠中的免疫原性。图20是两个柱状图，显示小鼠中的免疫原性。图21是纯化方法I的纯化流程图。 IPA-过程中的分析如果没有特别说明，所有缓冲液均含有ImM DTT。图22是纯化方法11的纯化流程图。
具体实施例方式实施例实施例I :HIV-1 p24-RT-Nef-pl7融合体F4和密码子优化的(co)F4的构建和表达I.未密码子优化的F4HIV-I gag p24(衣壳蛋白)和pl7(基质蛋白)、逆转录酶和Nef蛋白在嗜菌体T7启动子(PET表达系统)的控制下，在大肠杆菌B834株(Β834ΦΕ3)是BL21(DE3)的甲硫氨酸营养缺陷型亲代)中表达。它们表达为含有4种蛋白的完整序列的单ー融合蛋白。成熟的p24编码序列来自HIV-I BHlO分子克隆，成熟的pl7序列和RT基因来自HXB2且Nef基因来自BRU分离物。诱导后，重组细胞表达占总蛋白10%的显著水平的p24-RT-Nef_pl7融合体。
当细胞在22°C下生长并诱导时，p24-RT-Nef-pl7融合蛋白主要被限制到细菌裂
解产物的可溶性级分(甚至冻/融之后)。当在30°C下生长时，约30%的重组蛋白与不溶
性级分有夫。融合蛋白p24-RT-Nef-pl7由1136个氨基酸组成，分子量约为129kDa。全长蛋白
在SDS凝胶上迁移约130kDa。该蛋白基于其氨基酸序列具有7. 96的理论等电点(pi)，这
是通过2D-凝胶电泳加以证实的。重组质粒的详细描述名称pRITl5436(或实验室名称 pET28b/p24-RT_Nef-pl7)宿主载体pET28b复制子colEl选择卡那霉素启动子T7插入p24-RT-Nef-pl7融合基因重组蛋白的详细描述p24-RT-Nef-pl7 融合蛋白1136 个氨基酸N-末端-p24 232a. a.-铰链区2a. a. -RT :562a. a.-铰链区2a. a. -Nef :206a.
a. —P17 132a. a. —C-末端核苷酸和氨基酸序列核苷酸序列
atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact
ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg
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ttagaRtRRaRRtttRacaRCCRCCtaRcatttcatcacRtRRCCCRaRaRCtRcatccRRaRtacttcaaRaactRc jaggcct) atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa [SEQ ID NO :1]p24序列以粗体表示Nef序列加了下划线方框通过基因构建引入的核苷酸
氨基酸序列
MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMPSALSEGATP5 O
QDLNmLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAOPIAPeQMREP100
ROSDIAGTTSTLOEgiGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMySPTS150
ILDIRCGPKEPPRDYVDRPYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK200TILKALGPAATLEEMMTACQQVGGPGHKARVI GPISPIETVSVKLKPG 2S0MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450TPDKKHQKEPPFL § MGYELHPDKffTVQPIVLEKDSffTVDIQKLVGKLN 500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV 600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE 650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV 画MGGK 800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000NC ■ MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100TKEALDKI EEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO :2]P24序列氨基酸1-232 (粗体)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136方框通过基因构建引入的氨基酸K(赖氨酸)代替色氨酸(W).引入突变除去酶活性重组蛋白的表达在pET质粒中，靶基因(p24-RT-Nef-pl7)受到强嗜菌体T7启动子的控制。该启动子不能由大肠杆菌RNA聚合酶识别且依赖于宿主细胞中T7 RNA聚合酶的来源。B834(DE3)宿主细胞含有在lacUV5控制之下的T7 RNA聚合酶的染色体拷贝且表达通过向细菌培养物中加入IPTG而诱导使预培养物在37 °C下，在摇瓶中生长至中-対数期(A620 :0. 6)然后在4 °C下过夜(以避免静止期培养物)贮存。使培养物在补充了 1%葡萄糖和50 μ g/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。将葡萄糖加入到生长培养基中具有減少基础重组蛋白表达(避免cAMP介导的lacUV5启动子的脱抑制)的优点。4°C过夜贮存的IOml培养物用于接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在30°C和22°C下生长且当0.0.62。达到O. 6时，加入IPTG(lmM终浓度)。使培养物再培养3、5和18小时(过夜)。在3、5和18小时诱导之前和之后采集样品。提取物制备如下将细胞沉淀混悬于断裂缓冲液* (理论O. D.为10)中并通过在弗氏压碎器(20. OOOpsi或1250巴)中传代4次而破裂。20. OOOg离心粗提物(T) 30分钟，分离可溶性
(S)和不溶性⑵级分。*断裂缓冲液50mM Tris-HCL pH 8. O, ImM EDTA, ImM DTT+蛋白酶抑制剂鸡尾酒(しomplete/Boerhinger)SDS-PAGE和蛋白质印迹分析与不溶性沉淀⑵、上清液⑶和粗提物⑴相应的级分在10%还原SDS-PAGE上电泳。p24-RT-Nef-pl7重组体是通过考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹(WB)检测的。考马斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白显现为其中一个带在±130kDa(使用计算的丽拟合)MW理论值128. 970道尔顿MW 近似值130kDa蛋白质印迹分析试剂=RT的单克隆抗体(p66/p51)购自ABI (Advanced Biotechnologies)稀释1/5000-碱性磷酸酶缀合的抗-小鼠抗体稀释1/7500表达水平22°C下诱导20小时后，非常强的p24-RT-Nef_pl7特异性带，占总蛋白的最多10% (见图1A)重组蛋白“溶解度”“新鲜的”细胞提取物(T，S，P级分)22°C /20h生长/诱导，在细胞提取物的可溶性级分中回收到几乎所有的p24-RT-Nef-pl7融合蛋白(图1A)。30°C /20h生长/诱导，约30%的p24-RT-Nef-pl7蛋白与不溶性级分有关(图1A)“冻 / 融”(S2，P2 级分) -20°C保存可溶性(SI)级分(22°C诱导20h)。融化并20. 000g/30分钟离心S2和P2(重混悬于l/10vol中)含DTT的断裂缓冲液几乎所有p24-RT-Nef-pl7融合蛋白仍然可溶(仅1_5%沉淀)(见图1B)不含DTT的断裂缓冲液85-90%的p24-RT_Nef-pl7仍然可溶(图1B)图图IA-考马斯染色和蛋白质印迹图lB-p24-RT-Nef_pl7 溶解度测定法
F4蛋白使用实施例7中的方法I纯化。除非指定了其它条件(例如，温度、断裂缓冲液组成)，下面实施例的细胞生长和
诱导条件及细胞提取物的制备如实施例I中所述。2.密码子-优化的F4下列多核苷酸序列被密码子优化，这样密码子选择类似在大肠杆菌中高水平表达
的基因的密码子选择。氨基酸序列与上面未密码子优化的F4所给出的相同。F4co的核苷酸序列
atggtcattgttcagaacatacagggccaaatggtccaccaggcaattagtccgcgaact cttaatgcatgggtgaaggtcgtggaggaaaaggcattctccccggaggtcattccaatg ttttctgcgctatctgagggcgcaacgccgcaagaccttaataccatgcttaacacggta ggcaggcaccaagccgctatgcaaatgctaaaagagactataaacgaagaggccgccgaa tgggatcgagtgcacccggtgcacgccggcccaattgcaccaggccagatgcgcgagccg cgcgggtcfcgatattgcaggaactacgtctacccttcaggagcagattgggtggatgact aacaatocaccaatcccggtcggagagatctataagaggtggatcatactgggactaaac aagatagtccgcatgtattctccgacttctatactggatatacgccaaggcccaaaggag ccgttcagggactatgtcgaccg^ttctataagacccttcgcgcagagcaggcatcccag gaggtcaaaaattggatgacagaaactcttttggtgcagaatgcgaatccggattgtaaa acaattttaaaggctctaggaccggccgcaacgctagaagagatgatgacggcttgtcagggagtcggtggaccggggcataaagcocgcgfcctta|cacatcj{ ggcccgatatctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaaaaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaacaatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctccggcgatatttcagagctgtatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagct
ttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgccgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaaggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgcacttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcattattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagcttataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaatgagcaagtggacaagctagtcagcgctgggattcgcaaggttctt Igcqatgl gggggta
agtggtctaagtctagcgtagtcggctggccgacagtccgcgagcgcatgcgacgcgccgaaccagccgcagatggcgtgggggcagcgtctagggatctggagaagcacggggctataacttccagtaacacggcggcgacgaacgccgcatgcgcatggttagaagcccaagaagaggaagaagtagggtttccggtaactccccaggtgccgttaaggccgatgacctataaggcagcggtggatctttctcacttccttaaggagaaaggggggctggagggcttaattcacagccagaggcgacaggatattcttgatctgtggatttaccatacccaggggtactttccggactggcagaattacaccccggggccaggcgtgcgctatcccctgactttcgggtggtgctacaaactagtcccagtggaacccgacaaggtcgaagaggctaataagggcgagaacacttctcttcttcacccggtaagcctgcacgggatggatgacccagaacgagaggttctagaatggaggttcgactctcgacttgcgttccatcacgtagcacgcgagctgcatccaRaatatttcaagaactgc [cgccca| atgggcgccagggccagtgtacttagtggcggagaactagatcgatgggaaaagatacgcctacgcccggggggcaagaagaagtacaagcttaagcacattgtgtgggcctctcgcgaacttgagcgattcgcagtgaatccaggcctgcttgagacgagtgaaggctgtaggcaaattctggggcagctacagccgagcctacagactggcagcgaggagcttcgtagtctttataataccgtcgcgactctctactgcgttcatcaacgaattgaaataaaggatactaaagaggcccttgataaaattgaggaggaacagaataagtcgaaaaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccgggcacagcaaccaggtgtcccaaaactactaa[SEQ ID NO :3]p24序列以粗体表示Nef序列加了下划线方框通过基因构建引入的核苷酸将未密码子优化的F4所用的过程用于密码子优化的序列。重组质粒的详细描述名称pRITl55l3(实验室名称pET28b/p24-RT-Nef_pl7)宿主载体pET28b复制子colEl选择卡那霉素启动子T7插入片段p24-RT-Nef-pl7融合基因，密码子-优化的F4密码子-优化的基因在大肠杆菌BLR (DE3)细胞，即B834 (DE3)株的recA—衍生物中表达。RecA突变防止λ嗜菌体的推断产生。
预培养物在37°C摇瓶中生长至中-対数期(A62tl :0. 6)，然后4°C (以避免静止期培养物)过夜贮存。培养物在补充了 I % 葡萄糖和50 μ g/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。将葡萄糖加入到生长培养基中具有减少基础重组蛋白表达(避免cAMP介导的lacUV5启动子的脱抑制)的优点。4°C过夜贮存的IOml培养物用于接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在37 °C下生长且当O. 0.62(|达到O. 6时，加入IPTG(lmM终浓度)。使培养物22°C再培养19小时(过夜)。在19小时诱导之前和之后采集样品。提取物制备如下:将细胞沉淀重混悬于样品缓冲液(理论O. D.为10)中，煮沸并直接在SDS-PAGE上样。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析使粗提物在10%还原SDS-PAGE上电泳。p24-RT-Nef-pl7重组蛋白是通过考马斯亮蓝染色(图2)和蛋白质印迹检测的。考马斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白显现为其中一个带在± 130kDa(使用计算的丽拟合)MW理论值128. 967道尔顿MW 近似值130kDa蛋白质印迹分析试剂=-兔多克隆抗RT (兔P03L16)稀释1/10.000-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)稀释1/10. 000-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体·稀释1/750022°C诱导19小时后，重组BLR(DE3)细胞以占总蛋白10_15%的非常高的水平表达
F4融合体。与源于天然基因的F4相比，源于密码子-优化基因的F4重组产物分布稍稍简化。60kDa处的主要F4-相关带，以及下面的次要带没有显现(见图2)。与表达F4的B834(DE3)重组株相比，产生F4co的BLR(DE3)株具有下列优点产生较高水平的F4全长蛋白，重组产物的复合带模式较少。实施例2 P51 RT (截短的、密码子-优化的RT)的构建和表达氨基酸428-448之间的RT/p66区对大肠杆菌蛋白酶敏感。P51构建体终止于Leu427，导致RNA酶H结构域除去(见图3中的RT序列比对)。还除去了 RT天然基因序列中鉴定的推断大肠杆菌“移码”序列(通过p51基因的密码子优化)。p51合成基因的设计/构建体根据大肠杆菌密码子选择设计合成p51基因的序列。因此，它被密码子优化，这样一来密码子选择类似大肠杆菌中高水平表达基因的密码子选择。合成基因如下构建以ー步PCR组装32个寡核苷酸。在第二步PCR中，使用末端引物扩增全长组装体，且所得PCR产物克隆到PGEM-T中间质粒中。校正在基因合成过程中引入的点误差后，p51合成基因克隆到pET29a表达质粒中。该重组质粒用于转化Β834ΦΕ3)细胞。重组蛋白特征P51 RT核甘酸序列atg agtact ggtccgatctctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatg 60gatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag120atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac180aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat240tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat300ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt360agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaac420aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtct480ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg540gatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg600cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact660cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg720gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat780attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc840cgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacg900gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg960gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa1020tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc1080atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact1140actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa1200acatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaattt1260gtcaacacgccgccgctggtaaaactg [aqcfcctqctaqc| taa 1302[SEQ ID NO :4]方框通过基因构建引入的氨基酸氨基酸序列M st GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPY 60NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYF120SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSgMTKILEPFRKQNP180DIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFL k MGYELHP 240DKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLT300EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR 360MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEF420VNTPPLVKL RPAS433
[SEQ ID NO :5]方框通过基因构建引入的氨基酸K(赖氨酸)代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性长度、分子量、等电点(IP)433AA, MW 50. 3kDa,，IP :9. 08p51 在 B834(DE3)细胞中的表达与RT/p66生产株平行评价P51表达水平和重组蛋白溶解度。p51表达水平
诱导条件5小时内，37°C下细朐牛长/诱导(+ImM IPTG)断裂缓冲液50mMTris/HCl, DH :7. 5，ImM EDTA, +/-ImM DTT.蛋白质印迹分析试剂兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀释=1/10,000)-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释1/7500)使与粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相应的细胞级分在10%还原SDS-PAGE上电泳。正如在考马斯染色的凝胶和蛋白质印迹(图4)说明的，观察到非常高表达水平的P51(占总蛋白的15-20% )，高于对P66所观察到的。p51和p66蛋白(37°C诱导5小时后)，在细胞提取物的可溶级分(SI)中回收到80%重组产物(见图4)。当在30°C下表达时，99%重组蛋白与可溶级分有关(没有给出数据)。p51蛋白质印迹模式为多带，但较之相对P66观察到的，复杂程度较低。溶解度测定法溶解度测定法在还原(含DTT的断裂缓冲液)和非-还原条件下制备的可溶
(SI)级分的冻/融(5h诱导，37°C)。融化后，20. 000g/30分钟离心SI样品，产生S2和P2 (p2再次混悬于1/10νο1·)。在还原以及非-还原条件下制备的可溶级分(SI)冻/融后，在可溶(S2)部分中仍然回收到99%的p51和ρ66。在沉淀(Ρ2)中仅发现1%。这在图5中示出。实施例3 :有或没有接头的pl7_Nef和Nef_pl7的构建和表达使用或不使用接头构建双融合蛋白。接头目的在于降低两个融合配偶体之间潜在的相互作用且如下所示Nef- ^SGGGP] ~P17 和 pl7_ IGSGGGP| -Nef重组质粒的构建· pET29a/Nef-pl7 表达载体通过PCR从F4重组质粒扩增Nef-pl7融合基因。将PCR产物克隆到中间pGEM_T克隆载体中，并随后克隆到pET29a表达载体中。· pET28b/pl7-Nef 表达载体通过PCR从F4重组质粒扩增Nef基因。将PCR产物克隆到中间pGEM_T克隆载体中，随后克隆到pET28b/pl7表达载体中，作为与P17基因框内融合的C-末端。· pET29a/Nef-接头-pl7 和 pET28b/pl7_ 接头-Nef 表达载体通过定点诱变(使用"GeneTailorSite-Directed Mutagenesis System",Invitrogen)将编码六肽接头(GSGGGP)的18bp DNA片段插入到Nef和pl7融合配偶体之间。
重组蛋白特征 长度、分子量、等电点(IP)Nef-p 17 (称作 NP) 340AA, MW :38. 5kDa, IP :7. 48Nef- IGSGGGP] -P17 (称作 NLP) 346AA, MW :38. 9kDa, IP :7. 48pl7-Nef (称作 PN) 342AA, MW :38. 7kDa, IP :7. 19pl7- ^SGGGP] -Nef (称作 PLN) 348AA, MW :39. IkDa, IP :7. 19 氨基酸序列和多核苷酸序列Nef-p 17核苷酸序列 Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg 60Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat 120Ijgagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca 180しaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact 240i'acaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta 300Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac 360rtccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga 420Iggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag 480Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg 540rtagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg 600bagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa 660i'tagat cgatgggaaaaaatt cggt taaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa 720しatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa 780Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca 840baagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata 900bagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag 960Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac 1020Taa1023[SEQ ID NO :6]Nef-pl7(NP)
MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDliEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA 60QBEEEVGPPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHPIiKEKGGLEGLIHSQRRQDIIiDLWiyHTQGY 120FPDWQNYTPGPGVRYPliTFGWCYKLVPVBPOKVBEANKGENTSI.LHPVSLHQMDDPEREV 180LEWRPDSRLAFHHVARELHPEYPKNCgl MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKKKYKLK 240HIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI 300EIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY340[SEQ ID NO :7]方框通过基因构建引入的氨基酸Nef序列以粗体表示P17_Nef核苷酸序列
Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct300Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct360Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctatgggtggcaag420Tggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgag480Ccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcaca540Agtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag600Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagct660Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa720Cgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg780Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag840Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg900Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg960Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag1020Aactgctaa 1029[SEQ ID NO :8]P17-Nef (PN)
MOARASVLSGeELDRWBKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAWPOLLBTSEGCROI60
LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVKQRIEIKDTK￡^LDKIEEEQNKSKKKAQQAAA120DTOHSNQVSQlTXppMGGKffSKSSffGffPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAIT 180SSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ240RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSL300LHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC342[SEQ ID NO :9]方框通过基因构建引入的氨基酸pl7序列以粗体表示Nef-接头-P 17核苷酸序列Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg60Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat120Ijgagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca180しaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact240i'acaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta300Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac360rtccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga420 Iggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag480
Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg540Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg600Gagtacttcaagaactgcaggcctggatccggtggcggccctatgggtgcgagagcgtca660
Gtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaag720Aaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt780Aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaacca840Tcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctat900Tgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaa960 Gagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaat1020Caggtcagccaaaattactaa1041[SEQ ID NO :10]Nef-接头-pl7 (NLP)MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA60QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY120FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV180LEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC GSGGGPMGARASVLSGGELDRWEKIKLRPGGK 240KKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLY300CVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY346[SEQ ID NO :11]六肽接头方框通过基因构建引入的氨基酸P17-接头-Nef核苷酸序列Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60i'taaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180しtgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct300i'tagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct360bacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctggatccggtggc420bgtcctatgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaa480Agaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaa540Aaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggcta600baagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagacca660Atgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaa720bggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaa780ijgctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacc840i'ttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaa900bgagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagaga960baagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctg1020
Catccggagtacttcaagaactgctaa1047[SEQ ID NO :12]P17-接头-Nef (PLN)MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQI 60
LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAA 120DTGHSNQVSQNY EdrpI GSGGGPMGGKffSKSgVYGffPTVRERMRRAEPAADGYGAASRDLE 180KHGAITSSNTAATNAAcAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLE 240GLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANK 300GENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC348[SEQ ID NO :13]六肽接头方框通过基因构建引入的氨基酸 有或没有接头的Nef-p 17，pl7_Nef融合体的比较表达与F4和Nef产生株平行，30°C诱导4种重组株3小吋。制备粗提物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。蛋白质印迹分析试剂兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀释=1/10,000)-碱性磷酸酶缀合的-抗-兔抗体(稀释1/7500)如图6中举例说明的，有或没有接头的Nef_pl7和pl7_Nef融合体以高水平(占总蛋白10% )表达。在蛋白质印迹中四个双融合构建体呈现多带模式，但较之相对F4观察到的，复杂性较低。当单独表达时，Nef和pl7蛋白呈现单带模式。进ー步分析(溶解度测定法，见下文)表达Nef-p 17 (NP)和pl7_Nef(PN)融合体、没有接头肽的株。Nef-p 17和pl7_Nef溶解度测定法与F4和Nef产生株平行，诱导Nef-pl7和pl7_Nef蛋白。诱导条件3小时内，30°C下细胞牛长/诱导(+ImM IPTG)断裂缓冲液50mMTris/HCl pH 8,50mM NaCl, ImM EDTA新鲜的细胞提取物制备细胞提取物(在非还原条件下)并按照考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析与粗提物(T)、不溶沉淀(P)、和上清液(SI)相对应的部分。如图7中考马斯染色凝胶和蛋白质印迹举例说明的，在细胞提取物的可溶级分
(S)中回收到几乎所有Nef-pl7、pl7-Nef以及Nef蛋白。对于F4构建体在沉淀级分中已经回收了 5-10%的重组蛋白。结论所试验的所有双融合构建体均高水平表达(> 10%总蛋白)。P17_Nef和Nef_pl7融合蛋白较之F4更易溶解。两者均呈现复杂性较低的WB模式。实施例4 p24-RT * -Nef-p17 (F4 * )的构建和表达F4 *是F4(p24-RT/p66-Nef-pl7)融合体的突变形式，其中592位的甲硫氨酸被赖氨酸取代。该甲硫氨酸是推断的内部转录“起始”位点，如在F4纯化实验的Q琼脂糖洗脱物样品上进行的N-末端测序所支持的。实际上，Q洗脱物样品中存在的62kDa的主要F4-相关小带在592位的甲硫氨酸处开始。甲硫氨酸被赖氨酸取代RMR — RSR。RSR基序天然存在于分化枝A RT序列中。评价该突变对⑶4-⑶8表位的影响-其中ー个HLA-A3CTL表位(A* 3002)丢失，但另外9个HLA-A3表位存在于RT序列中。-在该区中没有鉴定到辅助表位。重组蛋白特性
N-末端-|p24: 232a.a.l -/ 较链区:2a.a] - jRT: 562a.J 链区:2a.a.j -Nef:206a.a.l- ^17:132a.a.l - C-末端 长度、分子量、等电点(IP):1136AA, 129kDa, IP :8. 07 核苷酸序列
atggttateotacagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact
ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg
ttttcagcattatcaoaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg
gggggacatcaagcagccatgcaaatgtfcaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa
tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca
aSTdggaAgtgacatagCieggftdC t&ct&gtsicccttc&gg 在攻在 ca
aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagettggataatcctgggattaaat
aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa
ccttttagagactafcgtagaceggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag
gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag
actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcafcgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttgicatatj ggccccattagccctattgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc
tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta pctatcjj; RgtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgaRccaRcaRcaRatRRRRtRRRaRcaRcatctcRaRacctRRaaaaacatRRaRcaatcaCaaRtaRcaatacaRcaRctaccaatRctRcttRtRcctRRctaRaaRcacaaRaRRaRRaRRaRRtRRRttttccaRtcacacctcaRRtacctttaaRacccaatRacttacaaRRcaRctRtaRatcttaRccactttttaaaaRaaaaRRRRRRactRRaaRRRctaattcactcccaacRaaRacaaRatatccttRatctRtRRatctaccacacacaaRRctacttccctRattaRcaRaactacacaccaRRRccaRRRRtcaRatatccactRacctttaRatRRtRctacaaRctaRtaccaRttRaRccaRataaRRtaRaaRaRRccaataaaRRaRaRaacaccaRcttRttacaccctRtRaRcctRcatRRaatRRatRaccctRaRaRaRaaRtRttagaRtRRaRRtttRacaRCCRCCtaRcatttcatcacRtRRCCCRaRaRCtRcatccRRaRtacttcaaRaactRc laggcctj atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa[SEQ ID NO :14] p24序列以粗体表示Nef序列加了下划线方框通过基因构建引入的核苷酸
氨基酸序列
MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPBVIPMPSALSEGATP5 O
QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETエNEEAAEWDRVHPVKAGPIAPGQMREP100
RGSDIAGTTSTLOEOIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS150
ILDIROGPKEPFRDYVDRPyKTLRABCASOBVKimMrrBTLIiVCNAWPDCK200TILKALGPAATLEEMMTACQGVGOPGHKARVI^i GPISPIETVSVKLKPG250MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK300 KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSIMNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT400KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT450TPDKKHQKEPPFL | MGYELHPDKffTVQPIVLPEKDSffTVNDIQKLVGKLN500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR | RGAHTNDV600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES750ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV @MGGK800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK1000NC ^(MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKKKYKLKHIVffASRELERFAV1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO :15]P24序列氨基酸1-232 (粗体)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136方框通过基因构建体引入的氨基酸K(赖氨酸代替甲硫氨酸(内部“起始”密码子)K(赖氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性F4*在B834(DE3)细胞中的表达与F4未突变构建体平行，18小时内22°C诱导F4 *重组株。制备粗提物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。如图8所示，F4*高水平表达(10%总蛋白)，稍高于F4且小62kDa带消失。蛋白质印迹分析:试剂_合并 3 种 Mabs 抗 p24(JC13. 1，JC16. 1，IG8. I. I)(稀释 1/5000)-兔多克隆抗 RT (兔 P03L16)(稀释1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀释 1/10000)-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释1/7500)-碱性磷酸酶缀合的抗-小鼠抗体(稀释1/7500)
实施例5 F3和F3 * (突变F3)的构建和表达F3(pl7-p51_Nef)和F3 * (pl7_p51 *-Nef)，其中推断的内部甲硫氨酸起始位点被赖氨酸取代。F3和F3 I虫合体可与p24组合使用。重组质粒的构建F3 -J人pET29a/p51表达质粒切下编码p51的序列(Seal和StuI DNA片段)并在StuI位点处(位于pl7和Nef基因之间)连接到pET28b/pl7_Nef质粒中，作为与pl7和Nef序列的框内融合体。所得融合构建体pl7-p51-Nef被称作F3。F3 * :使用“Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis system，，(Invitrogen)获得推断的内部甲硫氨酸起始位点的突变，产生F3 *构建体。F3和F3 *质粒用于转化B834(DE3)细胞。重组蛋白特性
N-末端 p!7: 134a.a.-铰链区:2a.a. - |ρ51/ρ51*: 426a.a.j -铰链区2a.a.|-Nef: 206a.a] C-末端 长度、分子量、等电点(IP)770AA, 88. 5kDa, IP 8. 58 核苷酸序列(F3*)
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60
ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120
cfcagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180
ctgggacagctacaaccatcocttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240
acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaagaaagct300
tcagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaa^gcacaaaaagcaacacict3$0gacacaggaGaoageaateaggtcagccaaaattacctcgaclaggactli GGTCCGATCTCT 420CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG480TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG540GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA600AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA660ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG720AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC780TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC840TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT900
ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 960ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1020GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1080GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG I140ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAALCTAGTCGGCAAG 1200CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1260AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCT TGAGCTG 1320GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1380GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA 1440GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1500GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1560
GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1620GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1680AAACTG IEi cctt ATgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgta 1740agggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagac 1800ctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcc 1860tggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtaccttta 1920agaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga 1980ctggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccac 2040acacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatcca 2100ctgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggcc 2160aataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccct 2220gagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccga 2280gagctgcatccggagtacttcaagaactgctaa2213[SEQ ID NO :16]P17 以粗体表示的序列P51 :以大与字母表不的序列
Nef 以小写字母表示的序列方框通过基因构建引入的核苷酸 氨基酸序列(F3)
UGAIlASVLSGOELDRWEKIRliRPOGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPOIiLETSKOCRQI 60LOQliQP SItOXGSEELRSLYNTVATLYCVKgRIBIKDTKEMiDKIEEEgKKSKKKAOOAAA 120DTGHSNQVSQN^I^ GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEK 180EGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKK 240KSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSS 300MTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQK 360EPPFL | MGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLL 420RGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQ 480
EPFKNLKTGKYAR gRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIffGKTPKFKLPIQKETffETffffT 540EYffQATffI PEffEFVNTPPLVKL MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRD 600LEKHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGG 660LEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEA 720NKGENTSLLHPVSDHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC770[SEQ ID NO :17]P17序列氨基酸1-134 (粗体)P51 序列氨基酸 137-562Nef 序列氨基酸 565-770方框通过基因构建引入的氨基酸F3 *构建体中494位的甲硫氨酸被赖氨酸取代K(赖氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性F3在B834 (DE3)细胞中的表达与F4(p24-p66-Nef_pl7)和pl7_Nef(F2)生产株平行，评价F3表达水平和重组蛋白溶解度。诱导条件3小时内，细朐37°C下牛长/30°C下诱导(+ImM IPTG)断裂缓冲液—F450mMTris/HCl pH :8. O. 50mM NaCl，ImM EDTA, +/-ImM DTTF2 50mMTris/HCl pH 8. 0,50mM NaCl, ImM EDTA，不含 DTTF3 50mMTris/HCl pH :7.5,50mM NaCl，ImM EDTA, +/-ImM DTT蛋白质印迹分析:试剂-兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀释1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀释 1/10000)-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释1/7500)“新鲜的”细胞提取物在10%还原SDS-PAGE上分析与粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相对应的细胞级分。如图9所示，F3融合蛋白以高水平表达(10%总蛋白)。在细胞提取物的可溶级分(S)回收到几乎全部F3，虽然5-10%的F4产物已经与沉淀级分有夫。与F4相比，WB模式被简化。F3*在Β834ΦΕ3)细胞中的表达37°C诱导F3 *重组株3小吋，与F3未突变构建体平行。制备粗细胞提取物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。如图10所示，F3*融合蛋白以高水平(10-20%总蛋白)表达。与F3相比，WB模式简化；+/_32kDa(仅在WB上检测到)处非常弱的带消失。实施例6 F4 (p51)和F4(p51) *的构建和表达RT/p51用于F4融合构建体(代替RT/p66)中。F4(p51) = p24-p51_Nef-pl7F4(p51) * = p24_p51 *-Nef-pl7_突变的F4 (p51):推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT部分中)被赖氨酸取代，从而进一步简化了抗原模式。 重组质粒的构建F4(p51):通过PCR从pET29a/p51表达质粒扩增编码p51的序列。将限制位点掺入到PCR引物中(NdeI和StuI位于编码序列的5'末端，AvrII位于编码序列的3'末端)。将PCR产物克隆到pGem-T中间质粒中并测序。pGem_T/p51中间质粒被NdeI和AvrII限制且P51片段连接到由NdeI和NheI限制的pET28b/p24-RT/p66-Nef-pl7表达质粒中(导致RT/p66序列的切除)。连接是在有T4DNA连接酶存在的条件下，通过适宜浓度下的组合消化反应进行的。连接产物用于转化DH5a大肠杆菌细胞。p51向正确翻译读框中的插入(代替f4融合体中的RT/p66)是通过DNA测序加以证实的。所得融合构建体p24_RT/p51-Nef-pl7 被称作 F4 (p51)。F4(p51) %推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT/p51中)的突变使用^GeneTailor Site-Directed Mutagenesis system”(Invitrogen)实现，产生 F4(p51) *构建体。F4(p51)和F4(p51) *表达质粒用于转化B834 (DE3)细胞。重组蛋白特性
N-末端闷232a.^- 链区:4a.a.卜 551/51*: 426a.a]■链区:3a.aJ ·丙ef: 206a.a.| g链区:2a.a. ]· [p!7: 132a.aj - C-末端 长度、分子量、等电点(IP)1005 AA, 114. 5kDa, IP :8. 47 核苷酸序列(F4(p51) *)
Atggttatcgtacagsiacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact 60 Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg 120 Ttttcagcattatcagaaagaaccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg 180 Oggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa 240 Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca 300 Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca 360 Aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataateetgggattaaat 420
Aaaatagtaagaatgtatagccctdccagcattctggacataagacaagg^ccaaaagaa 4Θ0 Ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag 540 Gaggtaaaaaattggatgacagaa^ccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag 600 Actabtttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag 660Gaaataggaagacccggccahaaggcaagragfcttt^^TATGaggcctl GGTCCGATCTCT 720CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG 780TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG 840GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA 900AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA 960ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG 1020AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC 1080TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC 1140
TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT 1200ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 1260ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1320GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1380GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG 1440
ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG 1500CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1560AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG 1620GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1680GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA I740GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1800GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1860GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1920GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1980AAACTG jqccctaGCij ATGggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctact 2040Gtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcga 2100Gacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt 2160Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct 2220Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg 2280Ggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctac 2340Cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat 2400Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag 2460
Gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac 2520Cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc 2580Cgagagctgcatccggagtacttcaagaactgc IAGGCC1It ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTA 2640TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA 2700AAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT 2760CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC 2820CTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT 2880GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG 2940CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAG 3000GTCAGCCAAAATTACtaa 3018[SEQ ID NO :18]P24:以粗体表示的序列P51 :以大与字母表不的序列
Nef :以小与子母表不的序列P17 :加下划线的序列方框通过基因构建引入的核苷酸 氨基酸序列(F4(p51) *)
MVIVQNIQGQMVHQAI SPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV 60GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMT 120NNPPIPVGEIYKRffIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQ 180EVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL 画画 GPIS 240PIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAI 300KKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDED 360
FRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY 420MDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFL J MGYELHPDKffTVQP 480IVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELEL 540AENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR | RGAHTN 600DVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffEFVNTPPLV 660KL ^MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAAC 720AWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY 780HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDD 840PEREVLEffRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKK 900KYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYC 960VHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1005「SEQ ID NO :191P24 :氨基酸 1-232P51 :氨基酸 237-662Nef :氨基酸 666-871P17 :氨基酸 874-1005K(赖氨酸)代替甲硫氨酸(内部"起始"密码子)K(赖氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性F4(p51)在 B834(DE3)细胞中的表达与F4表达株平行，评价F4(p51)表达水平和重组蛋白溶解度。诱导条件19小时内，细胞在37C下牛长/22C下诱导(+ImM IPTG)断裂缓冲液50mMTris/HClDH :7. 5，ImM EDTA, ImM DTT_3]蛋白质印迹分析:试剂-兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀释1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀释 1/10000)-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释1/7500)在10%还原SDS-PAGE上分析与粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相对应的细胞级分。如图11所示，F4(p51)以高水平(10%总蛋白)表达，类似F4。在细胞提取物的可溶级分(S)中回收到几乎所有的F4(p51)。用抗-Nef-tat试剂检测后，F4(p51)WB模式显示被简化(+/_60kDa以下的截短产物減少)。F4(p51) *在 B834(DE3)细胞中的表达与F4(p51)未突变构建体F4和F4*平行，22°C诱导F4(p51) *重组株18小时。制备粗细胞提取物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。如图12所示，观察到F4(p51)和F4(p51) *融合体的高水平表达，占至少10%的总蛋白。WB模式低于+/-60kDa的截短产物減少。此外，就F4(p51) I勾建体而言，47kDa带(由于内部起始位点)消失。实施例7 :F4、F4(p51) *和F4 *的纯化-纯化方法I含4HIV抗原p24-RT-Nef-pl7的融合蛋白F4是按照纯化方法I从大肠杆菌细胞匀浆纯化的，该方法包括下列主要步骤· F4的硫酸铵沉淀· S03 Fractogel阳离子-交换色谱(正电模式)
·辛基琼脂糖疏水相互作用色谱(正电模式)· Q琼脂糖FF阴离子-交换色谱(正电模式)·有SDS存在条件下的Superdex 200凝胶过滤色谱·透析和浓缩此外，F4(p51) *融合蛋白(RT被携带附加突变Met592Lys的、密码子优化的p51取代)和F4 *蛋白(携带附加Met592Lys突变的F4)是用同一纯化方法I纯化的。蛋白定量 使用Lowry測定法测定总蛋白。測量蛋白浓度之前，针对PBS，O. 1% SDS透析所有样品过夜，从而除去干扰物质(脲，DTT)。BSA(Pieree)用作标准品。SDS-PAGE和蛋白质印迹·在还原或非还原SDS-PAGE样品缓冲液(+/_ β -巯基こ醇)中制备样品并95°C加热5分钟。· 200V下,在4-20% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,使用Imm厚的预制Novex Tris-甘氨酸凝胶或Criterion凝胶(Bio-Rad),分离蛋白75分钟。·使用考马斯亮蓝R250目测观察蛋白。·进行蛋白质印迹(WB)吋，4°C IOOV下将蛋白从SDS-凝胶转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上共I. 5小时或30V下过夜。· F4是使用不同抗原的单克隆抗体,抗_p24、抗-Nef-Tat、抗-RT检测的(有时，抗-p24和抗Nef-Tat的混合物用于检测最大数目的蛋白帯)。 碱性-磷酸酶缀合的杭-小鼠或抗-兔抗体与第一抗体结合，并使用BCIP和NBT作为底物观察蛋白帯。抗-大肠杆菌蛋白质印迹·通过SDS-PAGE分离5 μ g蛋白(Lowry)并转移到上述硝酸纤维素膜上。·使用多克隆抗-大肠杆菌抗体检测残余的宿主细胞蛋白。使用上述碱性-磷酸酶反应观察蛋白带。纯化方法I方法I包括利用硫酸铵沉淀和4个色谱步骤·在含 IOmM DTTUmM PMSFUmM EDTA 的 pH 8. 050mM Tris 缓冲液中，在 0D50(约360ml)对大肠杆菌细胞进行匀浆。1000巴下进行2次Rannie传代。· 14400 Xg离心20分钟除去细胞碎片和不溶物质。·将硫酸铵(AS)从3. 8M原液加入到澄清的上清液中至I. 2M终浓度。使蛋白室温(RT)沉淀约2小时并通过离心(lOmin，14400Xg)沉淀。将沉淀重混悬于溶解了 8M脲、IOmM DTT的pH 7. O的IOmM磷酸盐缓冲液。·在有溶解了 8M脲和IOmM DTT的pH 7. O的磷酸盐缓冲液存在条件下，在S03Fractogel柱(Merck)上捕获抗原。洗涤柱子，从而洗脱下未结合的蛋白，接着通过使用170mM NaCl进行预洗脱步骤而除去结合的宿主细胞蛋白(HCP)。然后用溶解了 460mMNaCl、8M IIUOmM DTT的pH 7. O的磷酸盐缓冲液洗脱F4。·使用pH 7的IOmM磷酸盐缓冲液2倍稀释S03洗脱液，并在有溶解了 4M脲、ImMDTT、230mM NaCl的pH 7. O的磷酸盐缓冲液存在的条件下，上样到辛基琼脂糖柱(AmershamBiosciences)。洗涤步骤(平衡缓冲液)之后，用溶解了 8M脲、ImMDTT的pH 8. O的25mMTris缓冲液洗脱结合的F4。 稀释辛基洗脱液并调节至pH 9. O，然后在有pH 9. O的8M脲(25mM Tris)存在的条件下，F4 与 Q 琼脂糖柱(Amersham Bioscience)结合。洗掉(8M 脲、25mM Tris, pH 9. O)未结合的蛋白并通过预洗脱步骤(90mM NaCl，溶于8M脲、25mM Tris中，pH 9.0)除去HCP和F4-降解产物。使用溶解了 200mM NaCl、8M脲的pH 9. O的Tris缓冲液使F4从柱子上解吸。 将I % SDS加入Q洗脱液的等分试样并针对含O. I % SDS和ImMDTT的PBS缓冲液透析，从而在将样品注射到凝胶过滤柱上之前除去脲(制备级Superdex 200，成行连接的两个16X60cm柱)。过程中的SDS-PAGE分析之后合并相关级分。· RT下，在透析膜(12_14kDa截留分子量)中，针对11 O. 5M精氨酸、IOmM Tris、5mM谷胱甘肽，pH 8. 5过夜透析样品两次。连续纯化步骤在图21中表示。F4纯化结果纯化过程后的SDS-PAGE/蛋白质印迹图13表示在F4纯化过程中含F4级分的SDS凝胶和抗_p24/抗-Nef-Tat蛋白质印迹。大肠杆菌匀浆在图13第2道中表示，据估计F4占总蛋白的约10% (考马斯蓝染色的SDS-凝胶的密度扫描)。离心后，在澄清的上清液中回收到F4的可溶级分(第3道)。硫酸铵沉淀步骤除去了许多杂质(第4道)并减少了随后色谱步骤的蛋白电荷。此外，SM脲用于重混悬含HCP的F4的解离复合物沉淀，并通过从S03树脂定量洗脱而完全捕获F4。第5道中所示S03洗脱液被认为富含于F4中，但不均一模式大部分保持未变。疏水性辛基琼脂糖柱主要除去低分子量(LMW) HCP和F4-降解产物(第6道)，由此简化F4模式。Q琼脂糖色谱可进一步简化F4模式并除去许多杂质(第7道)。大肠杆菌杂质的最終纯化是在该步骤之后获得的。事实上，通过抗-大肠杆菌蛋白质印迹分析，在Q洗脱液中没有检测到宿主细胞蛋白。由此产生的纯化的F4被称作F4Q。Superdex 200柱可将LMW F4-降解产物从全长F4中分离出来，提高Superdex 200洗脱液中F4的均匀性(第8道)。术语F4S可用于指代按照方法I的完整流程纯化的F4。对在F4纯化过程中收集的相同级分进行抗-大肠杆菌蛋白质印迹。在抗-大肠杆 菌蛋白质印迹上没有可见带，这表示Q洗脱液和Superdex洗脱液中的HCP污染低于I %。F4和蛋白回收通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评价纯化过程各步骤的F4回收。为了通过SDS-凝胶评价F4回收，上样到SDS-凝胶上的样品体积与纯化过程中收集的不同级分的体积相对应。表I表示含F4级分中的蛋白回收表I :纯化过程中收集的F4-阳性级分的蛋白回收(360ml勻衆)。使用Lowry测定法測定蛋白浓度。
权利要求
1.一种多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当P17和p24Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段。
2.根据权利要求I所述的多肽，进一步包含Pol或RT或其免疫原性片段或衍生物。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的多肽，其中RT或免疫原性片段是其中RT在C末端被截短，使得它缺少羧基末端RNA酶H结构域的片段。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中RT片段是p51片段。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的多肽，其中RT在第592位包含突变，使得由另一个残基，例如赖氨酸取代甲硫氨酸。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的多肽，其中Nef是全长Nef。
7.一种选自下列之一的多肽1.p24-RT-Nef-pl72.p24-RT*-Nef-pl73.p24-p51RT-Nef-pl74.p24-p51RT*-Nef-pl75.pl7-p51RT-Nef6.pl7-p51RT*-Nef7.Nef-pl7 8.具有接头的Nef-p179.pl7-Nef 10.具有接头的pl7-Nef *代表RT甲硫氨酸592突变成赖氨酸。
8.一种用于纯化权利要求1-7任意一项所述的多肽的方法，该方法包括 i).提供含未纯化多肽的组合物； ii).使该组合物经过至少两个色谱步骤； iii).任选地使该多肽羧基酰胺化； iv)进行缓冲液更换步骤以提供用于药物制剂的适宜缓冲液中的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中有至多两个色谱步骤。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中羧基酰胺化在两个色谱步骤之间进行。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗HIV感染的疫苗。具体地，本发明涉及用于免疫原性组合物和疫苗中的Gag、Pol和Nef的HIV多肽和多核苷酸融合体。本发明具体涉及包含Nef或其免疫原性片段，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段的多肽，其中当p17和p24Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段。该多肽还可包含Pol或RT或其免疫原性片段。
文档编号A61P31/18GK102633866SQ20111040626
公开日2012年8月15日 申请日期2005年8月3日 优先权日2004年8月5日
发明者G·H·沃斯, H·阿布勒希特, M·德尔钱布尔, M·马尚, N·L·马蒂, P·J·G·G·佩尔曼纳 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司