专利名称：一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及螺旋藻深加工及生物技术领域，具体涉及ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法。
背景技术：
螺旋藻(Spirulina platensis)是ー种蓝藻，具有护肝，抗氧化，防病毒，抗癌和增强免疫力等生理功能.螺旋藻蛋白质占其干重的50-70%，是迄今发现的蛋白质含量最高的物种之一.螺旋藻蛋白质组成最接近于世界粮农组织( FAO)规定的标准，包含18种氨基酸，并具有人体必须的全部8种氨基酸，是ー种优质蛋白源.目前，螺旋藻主要以干粉和片剂形式使用。由于其溶解性有限，不利于人体直接吸收等问题，使其应用受到一定的限制。因此，从螺旋藻中分离纯化活性肽具有巨大的社会经济效益和广泛的应用前景。生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生物活性的氨基酸聚合物，又称为功能肽。其结构松散，小至由两个氨基酸大到由数百个氨基酸通过肽键连接而成。现代营养学表明，蛋白质经消化道酶作用后并不一定以完全游离氨基酸的形式吸收，且主要是低肽的形式吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为エ业化生产生物活性肽的主要手段。恶性肿瘤已经成为我国居民死亡的首要原因之一。目前对肿瘤患者的治疗方法主要是化疗和放疗手段，对人体损伤严重。几十年来，人们一直在探索对人体损伤小治疗肿瘤方法，大多从天然动植物中寻找活性高、毒副作用小的广谱抗肿瘤新药。迄今为止，发现多种生物活性肽具有抗肿瘤活性，抗肿瘤肽因其分子量小、肿瘤细胞穿透能力强、提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成等特点，已经成为肿瘤治疗研究的热点。

发明内容
为拓展螺旋藻在食品和生物医学领域的应用，本发明的目的是提供ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法。为实现本发明目的，采用如下技术方案
ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，首先采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后经超滤离心管过滤，获得螺旋藻抗肿瘤多肽。ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，具体包括如下步骤
(I)螺旋藻粉5 50 g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌10 60 min，待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷冻80 min中，再置于4で冰箱中解冻，依此反复冻融ー次以上；然后，采用超声破碎方法将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来，将样品置于冰浴中；最后，将获得的溶液于温度4 0C ,转速为5000 10000 r/min下离心10 60 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为广5% (w/v，g/mL)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解；水解后再灭酶，室温冷却后将水解液在5000r/min下离心25 min，取上清；然后，在6000 g、4で条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KDUO KD的超滤离心管过滤，即获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。上述的ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤(I)所述反复冻融次数为三次。上述的ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤(I)所述超声破碎方法为在10^300 W的超声功率下每超声5 20 s间隔:TlO s’共超声1(Γ300次将螺旋藻壁破碎。上述的ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法， 步骤(2)所述水解条件是温度3(Γ60で，pH= 4 9，酶与底物的比2% 7% (w/v，g/mL)，水解5 12 h。上述的ー种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤(2)所述灭酶为在100で水中灭酶 10 min。上述的制备方法，步骤(I广(2)得到的螺旋藻多肽具有抗肿瘤活性，例如，对人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞H印G-2体外生长具有一定的抑制作用。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进ー步的详细描述，但具体实施方式
不应理解为是对本发明保护范围的限定。实施例I
螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下
(I)螺旋藻粉25 g溶于250 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌30 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷冻80 min中，再置于4で冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在130W的超声功率下每超声10 s间隔5 S，共超声200次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 °C,转速为7000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度45 °C，pH= 6. 5，酶与底物的比1.5%.水解9 h后，在100で水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在6000 r/min下离心25 min,取上清液。然后，在6000 g、4で条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KDUO KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0_3 KD,3-5 KD、5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。(3)步骤(I) (2)所得的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒进行抗肿瘤活性检测(使用MTT检测方法).当浓度为I mg/mL时，0-3 KD, 3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽对人乳腺癌细胞MCF-7体外生长抑制率分别达到2%、12%、14%和11%。当浓度为I mg/mL时，0_3KD,3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽对肝癌细胞(HepG_2)体外生长抑制率分别达到19%、12%、13% 和 12%。实施例2
螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于200 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌20 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷冻80 min中，再置于4で冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在50 W的超声功率下每超声5 s间隔6 S，共超声200次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 °C,转速为6000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度55 °C，pH= 6，酶与底物的比5%.水解8 h后，在100で水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在5000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KDUO KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例I。实施例3 螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于400 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷冻80 min中，再置于4で冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在150 W的超声功率下每超声10 s间隔6 S，共超声120次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 0C ,转速为5000 r/min下离心40 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度50 °C，pH= 9，酶与底物的比6%.水解12h后，在100で水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在5000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KDUO KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例I。实施例4
螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下
(I)螺旋藻粉40 g溶于700 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷冻80 min中，再置于4で冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在200 W的超声功率下每超声15 s间隔8 S，共超声150次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 0C ,转速为6000 r/min下离心50 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度40 °C，pH=6，酶与底物的比6%.水解8h后，在100で水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在5000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KDUO KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例I。
权利要求
1.一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，首先采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后经超滤离心管过滤，获得螺旋藻抗肿瘤多肽。
2.根据权利要求I所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤 (1)螺旋藻粉5 50g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌10 60 min,#其全部溶解后置于-20 °C冰箱中冷冻80 min中，再置于4 °C冰箱中解冻，依此反复冻融一次以上；然后，采用超声破碎方法将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来，将样品置于冰浴中；最后，将获得的溶液于温度4 0C ,转速为5000 10000 r/min下离心10 60 min，去除沉淀获得蛋白上清液，再真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉； (2)以步骤(I)得到的螺旋藻蛋白质粉为基础，配置浓度为f5% (w/v)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解；水解后再灭酶，室温冷却后将水解液在5000 r/min下离心25 min，取上清；然后，在6000 g、4 1条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD,5 KDUO KD的超滤离心管过滤，即获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。
3.根据权利要求2所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述反复冻融次数为三次。
4.根据权利要求2所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述超声破碎方法为在1(T300 W的超声功率下每超声5 20 s间隔:TlO s,共超声1(Γ300次将螺旋藻壁破碎。
5.根据权利要求2所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水解条件是温度30 60 °C,pH= 4 9，酶与螺旋藻蛋白溶液的比2% 7%. (w/v)，水解5 12h0
6.根据权利要求2所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述灭酶为在100 1水中灭酶10 min。
全文摘要
本发明提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，主要采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,超滤离心管过滤,获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的螺旋藻多肽,并且,这样制备的螺旋藻多肽具有抗肿瘤活性,有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。
文档编号A61P35/00GK102851344SQ20121031808
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者张学武, 许平平, 张博超 申请人:华南理工大学