专利名称：含乳酸的18个环原子环缩肽类杀内寄生虫剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及制备含乳酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物(depsipeptides)的新方法，这些缩肽类化合物中的一些化合物是已知的。
一些含乳酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)和其作为杀内寄生虫剂(endoparasiticides)的用途已是在先专利申请(DE-OS(德国公开说明书)4317458)中的主题。
存在一系列制备含D-2-羟基-异戊酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物的化学和微生物方法(例如通过合成法，参见P.Quitt等人，Helv. Chimica Acta 46(1963)pp. 1715-1720;P.Quitt等人，Helv. Chimica Acta 47(1964)pp. 166-173 [恩镰孢菌素 A];Pl. A. Plattner等人，Helv. Chimica Acta 46 (1963)pp. 927-935 [恩镰孢菌素B];Yu. A. Ovchinnikov等人，Tetrahedron Lett. 2(1971)pp. 159-162;R. W. Roeske等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 57(1974)pp.554-561[beauvericin];例如通过发酵法，参见R. Zocher等人，J. Antibiotics 45 (1992) pp. 1273-1277[恩镰孢菌素A、B和C];A. Visconti等人，J. Agric. Food Chem. 40 (1992)pp. 1076-1082[恩镰孢菌素 B4];Hiroshi Tomoda 等人，J. Antibiotics 45(1992)pp. 1207-1215[恩镰孢菌素A、A1、B、B1、D、E和F])。
在日本专利(参见MK 1688的合成法JP 专利02 229 177A2;参见C.A.114(23)227 487k)中描述了含有D-2-羟基-仲己酸的环己缩肽的发酵。
但是，关于通过发酵方法合成含乳酸的环己缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)，还未被公开过。
本发明涉及借助于镰孢菌属的真菌菌株，或从其中分离出的酶制备物制备含乳酸的旋光的具有18个环原子的环缩肽类化合物的方法。
在根据本发明的方法中，通式(Ⅰ)的含乳酸的旋光的具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)，是通过使式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的旋光的或外消旋的氨基酸与式(Ⅴ)和(Ⅵ)的旋光的或外消旋的2-羟基-羧酸和旋光的或外消旋的乳酸，在镰孢菌属的真菌菌株存在下在适合的营养液中或在缓冲系统中在从微生物中分离出的合成酶存在下反应而制备的，且随后分离所要的含乳酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)，
其中R1、R2和R4彼此独立地代表氢、具有最多达8个碳原子的直链或支链烷基、羟烷基、巯基烷基、烷硫基烷基、烷基亚磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基甲酰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、胍基烷基、具有最多达6个碳原子的直链或支链链烯基、具有最多达8个碳原子的环烷基、和任选取代的芳基烷基或杂芳基烷基，可提及的取代基为卤素、羟基、烷氧基、烷基、硝基或氨基，R3和R5彼此独立地代表氢、具有最多达8个碳原子的直链或支链烷基、羟烷基、巯基烷基、烷硫基烷基、烷基亚磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、具有最多达6个碳原子的直链或支链链烯基、具有最多达8个碳原子的环烷基、和任选取代的芳基烷基或杂芳基烷基、可提及的取代基为卤素、羟基、烷氧基、烷基、硝基或氨基， 其中R1、R2和R4具有上述定义，
其中R3和R5具有上述定义。
通式(Ⅰ)的含乳酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)特别适合于防治内寄生虫，在医学和兽医学领域尤其如此。
通式(Ⅰ)提供了根据本发明的含乳酸的具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)的一般定义。
优选的通式(Ⅰ)化合物是下述化合物其中R1、R2和R4彼此独立地代表氢，直链或支链的C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、异己基、仲己基、庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、异辛基、仲辛基、羟基-C1-C4-烷基，特别是羟甲基、1-和2-羟基乙基，巯基-C1-C4-烷基，特别是巯基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特别是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C1-C4-烷基亚磺酰基-C1-C4-烷基，特别是甲基亚磺酰基甲基、甲基亚磺酰基乙基、C1-C4-烷基磺酰基-C1-C4-烷基，特别是甲磺酰基甲基、甲磺酰基乙基、羧基-C1-C6-烷基，特别是甲氧羰基甲基、乙氧羰基乙基、氨基甲酰基-C1-C6-烷基，特别是氨基甲酰基甲基、氨基甲酰基乙基、氨基-C1-C6烷基，特别是氨基丙基、氨基丁基、C1-C4-烷基氨基-C1-C6-烷基，特别是甲基氨基丙基、甲基氨基丁基、C1-C4-二烷基氨基-C1-C6-烷基，特别是二甲基氨基丙基、二甲基氨基丁基、胍基-C1-C6-烷基，特别是胍基丙基，C2-C6-链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环丙基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、环庚基甲基，杂芳基-C1-C4-烷基，特别是噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、吲哚-3-基-甲基、苯基-C1-C4-烷基，特别是可被下列基团任选取代的苯基甲基卤素，特别是氟、氯、溴或碘，羟基、硝基、氨基、C1-C4-烷氧基，特别是甲氧基或乙氧基和C1-C4-烷基，特别是甲基，R3和R5彼此独立地代表氢，直链或支链的C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、异己基、仲己基、庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、异辛基、仲辛基、羟基-C1-C4-烷基，特别是羟甲基、1-和2-羟基乙基，巯基-C1-C4-烷基，特别是巯基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特别是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C1-C4-烷基亚磺酰基-C1-C4-烷基，特别是甲基亚磺酰基甲基、甲基亚磺酰基乙基、C1-C4-烷基磺酰基-C1-C4-烷基，特别是甲磺酰基甲基、甲磺酰基乙基、C2-C6-链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环丙基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、环庚基甲基、杂芳基-C1-C4-烷基，特别是噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、苯基-C1-C4-烷基，特别是可被下列基团任选取代的苯基甲基卤素，特别是氟、氯、溴或碘，羟基、硝基、氨基、C1-C4-烷氧基，特别是甲氧基或乙氧基和C1-C4-烷基，特别是甲基。
特别优选的通式(Ⅰ)化合物是下述化合物，其中R1、R2和R4彼此独立地代表直链或支链C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基-丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、异己基、仲己基、庚基、异庚基、仲庚基、辛基、异辛基、仲辛基、羟基-C1-C4-烷基，特别是羟甲基、1-和2-羟基乙基，巯基-C1-C4-烷基，特别是巯基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特别是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C2-C6-链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环丙基甲基、环戊基甲基、环己基甲基或环庚基甲基，R3和R5彼此独立地代表直链或支链C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、异己基、仲己基、庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、异辛基、仲辛基，羟基-C1-C4-烷基，特别是羟甲基、1-和2-羟基乙基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特别是甲硫基甲基、C2-C6链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环丙基甲基、环戊基甲基、环己基甲基或环庚基甲基。
非常特别优选的式(Ⅰ)化合物是下述化合物，其中R1、R2和R4彼此独立地代表直链或支链C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基-丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、异己基、庚基、异庚基、仲庚基、辛基、异辛基、仲辛基，C2-C6链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环己基甲基，R3和R5彼此独立地代表直链或支链C1-C8-烷基，特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、异己基、仲己基、庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、异辛基、仲辛基，C2-C6链烯基，特别是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-环基C1-C4-烷基，特别是环己基甲基。
下面可分别地述及通式(Ⅰ)的旋光化合物环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-正缬氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-亮氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-正亮氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-2-羟基-异戊酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-缬氨酰-D-2-羟基-异戊酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-2-羟基-异戊酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-别异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-别异亮氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-别异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-2-氨基-丁酰-D-乳酰-)，环(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-别异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-2-氨基-丁酰-D-乳酰-)。
一些通式(Ⅰ)的化合物是已知的(参见，例如V.Z. Pletnev等人，Bioorg. Khim. 1(2)(1975)pp. 160-165;参见C. A. 83(13)∶114872e;DE-OS(德国公开说明书)4317458)并可通过本文中所述的化学合成方法得到。
在根据本发明制备含乳酸的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)(Ⅰ)的方法中，如果将L-缬氨酸(R1、R2和R4-异丙基)用作式(Ⅱ)到(Ⅳ)化合物且D-乳酸(R3和R5-甲基)作为式(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物，则本发明例如可通过下述方程式描述 SAMS-腺苷-L-蛋氨酸ATP三磷酸腺苷金属盐例如碱土金属盐(Mg2+盐)或Mn2+盐。
式(Ⅱ)至(Ⅳ)提供了进行本发明方法所需氨基酸起始化合物的一般定义。在这些结构式中，R1、R2和R4优选代表在描述本发明式(Ⅰ)物质时已提及的这些取代基的那些优选基团。
如果用作起始物质的天然或合成氨基酸是手性的，则它们可以D构型或L构型存在。但是，L构型的α-氨基酸是优选的。
可述及的实例为Aad，Abu，jAbu，ABz，2ABz，εAca，Ach，Acp，Adpd，Ahb，Aib， Aib，Ala， Ala，△Ala，Alg，All，Ama，Amt，Ape，Apm，Apr，Arg，Asn，Asp，Asu，Aze，Azi，Bai，Bph，Can，Cit，Cys，(Cys)2，Cyta，Daad，Dab，Dadd，Dap，Dapm，Dasu，Djen，Dpa，Dtc，Fel，Gln，Glu，Gly，Guv，hAla，hArg，hCys，hGln，hGlu，His，hIle，hLeu，hLys，hMet，hPhe，hPro，hSer，hThr，hTrp，hTyr，HyI，Hyp，3Hyp，Ile，Ise，Iva，Kyn，Lant，Lcn，Leu，Lsg，Lys， Lys，△Lys，Met，Mim，Min，nArg，Nle，Nva，Oly，Orn，Pan，Pec，Pen，Phe，Phg，Pic，Pro，△Pro，Pse，Pya，Pyr，Pza，Qin，Ros，Sar，Sec，Sem，Ser，Thi， Thi，Thr，Thy，Thx，Tia，Tle，Tly，Trp，Trta，Tyr，Val，Nal，Tbg，Npg，Chg，Thia，(参见例如，Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie[有机化学方法]，VolumesXV/1和2，Stuttgart，1974)。
式(Ⅴ)到(Ⅵ)提供了进行本发明方法所需2-羟基-羧酸起始物质的一般定义。
在这些结构式中R3和R5优选代表在描述本发明式(Ⅰ)物质时已提及的这些取代基的那些优选基团。
如果用作起始物质的2-羟基-羧酸是手性的，则它们可以D构型或L构型存在。但是，D构型的2-羟基羧酸是优选的。
下述为可提及的实例Hyac，Hyba，Hydd，Hyde，Hyic，Hyiv，Hymb，Hypp，Hypr(Lac)，Hytd，Hyud，Hyva，(参见例如，Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie[有机化学方法]，VolumesXV/1和2，Stuttgart，1974)。
适合于进行本发明方法的镰孢菌属菌株是下述的镰孢菌属菌株。
镰孢菌属(Fusarium)菌株分离自Fusarium acuminatumBBA 61 148毛羽扇豆节孢状镰孢(Fusarium arthrosporoides)BBA 64 134翦股颖属(种子)燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)BBA 64 338冬小麦(种子)BBA 62 163甘蓝Fusarium compactumBBA 65 671棉花Fusarium crookwellenseBBA 64 297小麦(茎基)Fusarium ensiformeBBA 64 683甘薯木贼镰孢(Fusarium equiseti)BBA 64 814黑麦Fusarium inflexum
BBA 63 203蚕豆Fusarium gibbosum砖红镰孢(Fusarium lateritium)BAA 65 090小麦(茎基)节状镰孢(Fusarium meresmoides)BBA 64 329黑麦(茎基)串珠镰孢(Fusarium moniliforme)尖镰孢(Fusarium oxysporum)BBA 62 057f.pisi豌豆BBA 62 060f.lycopersici番茄BBA 62 334f.lupini白羽扇豆BBA 64 952f.batatas甘薯Fusarium proliferatumBBA 63 625龙血树芳香镰孢(Fusarium redolens)BBA 62 390紫罗兰花接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)BBA 63 933小麦
BBA 62 397马铃薯NRRL-13 500马铃薯NRRL-13 503马铃薯R-583蓼R-5390马铃薯R-7570土壤R-5455谷物R-6380马铃薯R-7843石竹R-5690土壤R-2633马铃薯R-6354谷物蔗草镰孢(Fusarium scirpi)ETH 1536草地土壤半裸镰孢(Fusarium semitectum)腐皮镰孢(Fusarium solani)BBA 64 953甘薯BBA 62 420f.pisi豌豆长亚月牙镰孢(Fusarium subglutinans)三隔镰孢
(Fusarium tricinctum)BBA 62 446红三叶草Fusarium udumBBA 62 451木豆特别应提及的是Mintolyte Fusarium 菌株DSM 8938和DSM 8939，根据布达佩斯条约，将它们于1994年1月31日保藏于Brunswick Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM)(德国微生物保藏中心)。
应用从微生物中分离出的合成酶也可进行本方法。为此目的所需的恩镰孢菌素合成酶，可采用文献中已知的方法，从上述的镰孢菌属菌株中分离出(参见例如R.Pieper，H.Kleinkauf，R.Zocher，J.Antibiot.45(1993)pp.1273-1277。
镰孢菌属的真菌菌株是通过本身已知的方法，在适合的营养液存在下发酵的。这些营养液中含有真菌生长所需的盐，以及碳源和氮源。
进行根据本发明方法的适合的无机盐为所有的碱金属盐、碱土金属盐和周期表中第Ⅱ至Ⅷ副族元素的金属盐。
可述及的无机盐的实例为锂、钠、钾、铯、镁、钙、钡、锌、镉、钪、钛、锆、钒、铌、铬、钼、锰、铁、钴或镍的乙酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、亚磷酸盐、亚磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、碳酸盐或碳酸氢盐。
优选使用的物质为碱金属，特别是钠和钾的乙酸盐、卤化物、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硝酸盐;碱土金属，特别是镁和周期表中第Ⅱ、Ⅶ和Ⅷ副族金属，例如锌、锰和铁的硫酸盐。
进行本发明方法的碳源是碳水化合物类和含碳水化合物的产品。
可提及的碳源的实例为单糖类，如戊糖，特别是核糖、己糖，特别是葡萄糖和果糖;低聚糖类，如二糖类，特别是蔗糖、麦芽糖和乳糖;三糖类，特别是，棉子糖，以及四糖、五糖和多聚己糖。
优选使用单糖类，例如，己糖，特别是葡萄糖;低聚糖类，例如二糖类，特别是蔗糖。
进行本发明方法的适合的氮源为氨基酸和含氮盐类。
可提及的氮源的实例为上述已提及的天然的和合成的氨基酸，或含氮盐类如硝酸铵、亚硝酸铵，或上述已提及的金属的硝酸盐和亚硝酸盐。
优选使用上面已提及的天然氨基酸，和含氮盐类，如硝酸铵。
用于发酵方法的镰孢菌属菌种，首先通过本身已知的方法生长于由例如，糖浆/玉米浆组成的培养基中。在它们已经成熟后，通过孢子滤器分离形成的孢子。为了生产前培养物，将由碳源和无机盐组成的镰孢菌属限定的培养基(FDM)用大约109个孢子接种并再度发酵。几天后，用1ml前培养物接种可制备FDM主培养物，可按类似的方法进行发酵。
然后，在式(Ⅱ)至(Ⅳ)或(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物存在下和在旋光的或外消旋的乳酸存在下，进行实际的发酵过程。
发酵时间为1至30天。发酵在+5℃至+40℃的温度下进行，优选在+15℃至+35℃，特别优选在+25℃至+30℃的温度下进行。本方法是在灭菌条件和大气压力下进行的。
为了进行本方法，一般使用浓度为5mM至50mM，优选5mM至15mM的式(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物。
发酵结束后，将镰孢菌属培养物的菌丝体用抽吸的方式过滤出，用有机溶剂重复进行均浆提取，然后过滤。用常规的方式提取获得的培养物滤液，干燥并在真空下浓缩。
通过柱色谱法或逆流分配法等常规方法，可纯化所得到的粗恩镰孢菌素类化合物。最佳方法必须根据各种具体情况而确定(还可参考制备实施例)。
如果在分离出的合成酶存在下进行本发明的方法，则该方法是在有金属盐类、S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)和三磷酸腺苷(ATP)存在下的含水的缓冲液系统中进行的。
可述及的金属盐为锂、钠、钾、铯、镁、钙或钡的乙酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、亚磷酸盐、亚磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、碳酸盐和碳酸氢盐。
优选使用的盐是碱土金属盐类，例如，氯化镁、硫酸镁或乙酸镁。
本发明的方法是在含水的缓冲溶液中进行的。
可述及的缓冲溶液的实例为商业上可获得的缓冲溶液，例如pH1.0的缓冲溶液，特别是甘氨酸/盐酸缓冲液;pH2.0至4.0的缓冲液，特别是柠檬酸盐/盐酸缓冲液;pH5.0至6.0的缓冲液，特别是柠檬酸盐/氢氧化钠溶液的缓冲液;pH7.0的缓冲液，特别是磷酸盐缓冲液;pH8.0的缓冲液，特别是硼酸盐/盐酸缓冲液;和pH9.0至10.0的缓冲液，特别是硼酸/氯化钾/氢氧化钠溶液的缓冲液。
本方法优选在“生理范围”内，即在pH6.0至9.0操作，为此优选使用磷酸盐缓冲液，特别是磷酸氢钾/磷酸氢二钠或磷酸氢钾/磷酸氢二钾缓冲液。
为了进行本方法，对100μg至1000μg，优选200μg至600μg的体外分离的恩镰孢菌素合成酶，通常一起使用2mM至8mM，优选3mM至5mM的式(Ⅱ)至(Ⅵ)化合物、旋光的或外消旋的乳酸和S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)，3mM至9mM，优选4mM至6mM的三磷酸腺苷(ATP)，2mM至25mM，优选5mM至15mM的碱土金属盐，10mM至100mM，优选40mM至60mM的缓冲液。
体外酶催化合成的反应时间为2分钟至24小时。体外酶催化合成是在0℃至+50℃，优选+10℃至+35℃，特别优选+20℃至+30℃的温度范围内进行的。
反应在6.5至8.5，优选在7.0至8.0的pH范围内进行，整个反应过程中通过加入缓冲液使pH保持在恒定的7.3。
本方法优选在无菌反应条件下和在大气压力下进行。
通过用水稀释可停止体外酶催化合成。
为进行处理，用有机溶剂反复提取水相，并将提取液干燥并在真空下浓缩。
通过柱色谱法或逆流分配法等常规方法，可纯化所得到的粗恩镰孢菌素类化合物。应再次提及的是，理想的方法必须根据各种具体情况而确定(还可参考制备实施例)。
制备实施例实施例1环(-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-缬氨酰-D-乳酰-)的制备
D-乳酸的体内结合将浓度为10mM的D-乳酸在灭菌条件下加入到蔗草镰孢的2-天期主培养物中，再继续发酵3天。然后抽吸过滤掉镰孢菌属培养物的菌丝体，并用乙酸乙酯提取滤液三次。在研钵中用丙酮将菌丝体均化两次，并随后对匀浆进行抽滤。将培养物的滤液，每次用100ml乙酸乙酯振荡提取三次，并将合并的有机相与丙酮提取物一起蒸发至干。
另一种可选择的方式是，可用大约两倍于其体积的乙酸乙酯将全部镰孢菌属培养物提取过夜。
为了通过柱色谱法浓缩恩镰孢菌素，将溶于少量氯仿中的粗恩镰孢菌素加入到Al2O3柱(30×2cm)上并进行分阶洗脱。
体外酶催化合成在4mM L-缬氨酸、4mM D-乳酸、4mM S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)、5mM三磷酸腺苷(ATP)和10mM MgCl2存在下，将在50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.3)中的300-500μg纯化的恩镰孢菌素合成酶，在28℃，以总体积为1.5ml保温10分钟。
加入2ml的水后，用每份2ml乙酸乙酯重复提取混合物。有机相用硫酸钠干燥，然后在真空下浓缩。
通过a)或b)已获得的产物用制备性HPLC(RP18/75-80%甲醇)提纯。
1H NMR(400 MHz，CDCl3，δ)0.83;1.03(d，18H，3×-CH(CH3)2);1.45(d，9H，3×-O-CH-CH3);2.27(m，3H，3×-CH(CH3)2);3.06(s，9H，3×-N-CH3);4.43(d，3H，3×-N-CH-CO-);5.62(q，3H，3×-O-CH-CO-)ppm13C NMR(100 MHz，CDCl3，δ)16.5(3×-CH3，D-Lac);18.5;20.1(6×-CH3，MeVal);27.8(3×-CH(CH3)2，L-MeVal);32.9(3×-N-CH3，L-MeVal);63.1(3×-N-CH-CO-，L-MeVal);66.3(3×-O-CH-CO-，D-Lac);169.2(3×-C＝O，amide);169.8(3×-C＝O，酯)ppmEI MS m/z(%)555(M+，32);482(20);353(1);268(34);168(100);86(53)实施例2环(-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-异亮氨酰-D-2-羟基-异戊酰-)的制备
D-乳酸的体内结合将浓度为10mM的D-乳酸在灭菌条件下加入到接骨木镰孢的2-天期主培养物中，再继续发酵3天。然后抽吸过滤掉镰孢菌属培养物的菌丝体，并用乙酸乙酯提取滤液三次。在研钵中用丙酮将菌丝体均化两次，并随后对匀浆进行抽滤。将培养物的滤液，每次用100ml乙酸乙酯振荡提取三次，并将合并的有机相与丙酮提取物一起蒸发至干。
如实施例1所述进行恩镰孢菌素的浓缩和纯化。
13C NMR (100 MHz，CDCl3)，δ)18.4;18.0(2×-CH3，D-HyIv);16.8;15.8(2×-CH3，D-Lac);16.7;15.3;11.4;10.6;10.3;10.0(6×-CH3，L-Melle);25.0;24.9;24.4(3×-CH2-，L-Melle);34.7;34.1;32.3(3×-CH(CH3)-，L-Melle);35.6;31.6;31.2(3×-N-CH3，L-Melle);29.9(-CH(CH3)2，D-HyIv);74.0;67.5;66.1(3×-O-CH-CO-，D-HyIv);65.1;60.5;59.5;(3×-N-CH-CO-，L-Melle);169.2;169.1;169.0(3×-C＝O，酰胺);170.6;170.1;169.8(3×-C＝O，酯)ppmEI MS m/z(%)625(M+，23);552(14);409(5);296(20);182(43);100(100)类似地，可制备下表1中所列示的LDLDLD立体异构体形式的通式(Ⅰ)化合物。
表1通式(Ⅰ)化合物的实例
a)13C NMR(100 MHz，CDCl3，δ);FAB-MS或EI MS m/z(%)孢子培养物、前培养物和主培养物所讨论的镰孢菌属菌株在由糖浆/玉米浆(分别为30g和10g/1)组成的培养基中生长。
培养物在100rpm(26至28℃)条件下在500ml锥形烧瓶(100ml培养基)中生长。4至5天后，通过孢子过滤器分离已形成的孢子。这些孢子可在4℃下保存数周。
为了制备前培养物，用109个孢子接种含有200ml FDM(每升含75.0g蔗糖、12.75g NaNO3、15.0g NaCl、7.5g MgSO4-7H2O、4.0g KH2PO4-7H2O、10g ZnSO4)的烧瓶，并如上所述进行发酵。
2至3天后，每次用1ml前培养物作接种物制备FDM主培养物，并如上所述进行发酵。
生产恩镰孢菌素的体外合成制备物首先对2-至3-天期的主培养物检查其恩镰孢菌素滴度，以确保细胞的合成活性。为此，在灭菌条件下取3至5ml培养物样品，并每次用2ml乙酸乙酯重复提取。蒸发掉有机相后，直接用HPLC(RP18.80%甲醇)检定恩镰孢菌素。
在灭菌条件下用相应的羟基-或氨基酸前体处理所讨论的主培养物至最终浓度为10mM，并如实施例1所述继续发酵(全部发酵时间大约为1周)。
权利要求
1.应用镰孢菌属真菌菌株或从其中分离出的酶制备物制备含乳酸的、旋光的、具有18个环原子的环缩肽类化合物的方法。
2.从式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的旋光的或外消旋的氨基酸和式(Ⅴ)和(Ⅵ)的旋光的或外消旋的2-羟基-羧酸和旋光的或外消旋的乳酸制备通式(Ⅰ)的含乳酸的、旋光的、具有18个环原子的环缩肽类化合物(恩镰孢菌素类化合物)的方法， 其中R1、R2和R4彼此独立地代表氢、具有最多达8个碳原子的直链或支链烷基、羟烷基、巯基烷基、烷硫基烷基、烷基亚磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基甲酰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、胍基烷基、具有最多达6个碳原子的直链或支链链烯基、具有最多达8个碳原子的环烷基、和任选取代的芳基烷基或杂芳基烷基，可提及的取代基为卤素、羟基、烷氧基、烷基、硝基或氨基，R3和R5彼此独立地代表氢、具有最多达8个碳原子的直链或支链烷基、羟烷基、巯基烷基、烷硫基烷基、烷基亚磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、具有最多达6个碳原子的直链或支链链烯基、具有最多达8个碳原子的环烷基、和任选取代的芳基烷基或杂芳基烷基、可提及的取代基为卤素、羟基、烷氧基、烷基、硝基或氨基， 其中R1、R2和R4具有上述定义， 其中R3和R5具有上述定义，其特征在于，本反应是在镰孢菌属真菌菌株存在下在适合的营养液中或在从微生物中分离出的合成酶存在下在缓冲系统中进行的。
全文摘要
本发明涉及应用镰孢菌属真菌菌株或从其中分离出的酶制备物制备含乳酸的、旋光的、具有18个环原子的环缩肽类化合物的方法。
文档编号A61K38/00GK1112932SQ9510228
公开日1995年12月6日 申请日期1995年2月23日 优先权日1994年2月24日
发明者P·杰斯克, A·哈德, N·曼克, H·克莱恩考夫, R·佐赫 申请人:拜尔公司