专利名称：鬼针草总黄酮的提取方法及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鬼针草总黄酮的提取方法及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种不明病因的临床综合征，以慢性多关节炎症为主要表现，目前认为属于系统性自身免疫性疾病。主要特征为慢性、全身性、侵蚀性外周关节滑膜炎，主要侵犯滑膜组织，继而引起关节软骨、周围韧带及骨质的破坏。本病呈全球性分布，我国的患病率为0. 32% 0. 36%，低于欧美国家白人的1%，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一。目前RA的治疗主要是①控制关节及其他组织炎症，缓解症状；②保持关节功能和防止畸形；③修复受损关节以减轻疼痛和恢复功能， 尚缺乏根治RA的方案以及预防RA的措施。到目前为止尚无特异性治疗药物，临床上常采用的是控制炎症和抑制机体免疫应答的药物，如泼尼松、氨甲喋呤等，但是，它们在抑制机体免疫应答引起的炎症反应和组织损伤的同时，也抑制了免疫系统的抗感染能力，将由此而产生一系列不良反应。RA是一种以关节滑膜及关节软骨损害为特征的全身性免疫性疾病，主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎。一旦发病，往往终身罹患，严重影响患者的生活质量。但类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，抗炎和免疫疗法是治疗RA的主要手段，但主要是激素和抗代谢等不良反应较多的药物。因此寻找有效的具有免疫调节作用且副作用小的药物，对于类风湿性关节炎的治疗具有重要的意义。在此背景下，人们的目光转向了中医中药。中医药防治类风湿性关节炎的长期临床实践积累给抗类风湿性关节炎的中药研究奠定了坚实的基础，特别是前人对类风湿性关节炎(中医痹症范畴)治疗的理论总结和处方用药经验，为当今中药抗类风湿性关节炎研究提供了线索和捷径。寻找价格便宜和疗效好的中药及其有效成分治疗RA，日渐成为研究的热点。迄今报道对类风湿性关节炎中药有效成分有多糖类、黄酮类、苷类、生物碱类、内酯类、挥发油类及其他。具有疗效确切、安全、副作用少、价格便宜等特点。《中药大辞典》载鬼针草有清热解毒、祛风除湿、散瘀消肿之功效。我们从鬼针草中提取了活性成分TFB，研究其在治疗类风湿性关节炎中的作用和作用机制。鬼针草(Bidens bipinnata L.)系菊科鬼针草属一年生草本植物,在我国大多数省区均有分布。鬼针草药用历史悠久，味苦、性平而无毒，具有清热解毒，散瘀消肿等功效。其主要成分有黄酮苷、皂苷、生物碱、挥发油等，民间用于治疗痢疾、腹泻、肝炎、胃痛、关节痛等，现代研究发现鬼针草富含黄酮类化合物，为将其开发成对类风湿性关节炎有治疗作用的有效药物提供非常珍贵的依据。我们提取其有效部位，通过动物实验证实其有显著的抗类风湿性关节炎的作用。经检索，尚未见关于鬼针草总黄酮治疗类风湿性关节炎的文献报道。

发明内容
本发明的目的在于提供鬼针草总黄酮(total flavones of Bidens pilosa L,TFB)的提取方法及其在治疗类风湿性关节炎药物中的应用。按照本发明提供的技术方案，鬼针草总黄酮的提取方法，其提取工艺步骤为取鬼针草，用1(T14倍鬼针草重量的、质量浓度为709^90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附树脂HPDlO吸附提取液；提取液上样浓度为f I. 5mg mL'以f 3BV 的吸附速率进行吸附，上样量以溶质总黄酮计为3飞mg mL—1大孔吸附树脂；吸附后先以3飞BV的水水洗去杂质，再用3飞BV质量浓度为70% 90%的乙醇以3飞BV .h—1的速率进行洗脱；在此条件下进行吸附、洗脱，大孔吸附树脂能够重复使用3飞次；经大孔吸附树脂吸附，质量浓度为709^90%的乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮的含量和得率。所述总黄酮百分含量为60% 80%，得率为3% 6%。
所述鬼针草总黄酮溶液在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。所述鬼针草总黄酮溶液制备成治疗类风湿性关节炎药物，即片剂、胶囊剂、冲剂和颗粒。鬼针草总黄酮的临床推荐剂量为IOOlOOmg/天，口服，一日三次。(8(Tl60mg/kg是大鼠的用药剂量)将所制备得到的鬼针草总黄酮溶液进行动物实验，结果如下鬼针草总黄酮(TFB160mg/kg)于用药后第4天开始明显减轻AA大鼠的足肿胀度(与AA模型组比较，p〈0. 05)，用药第12天(d21)开始TFB40，80mg/kg均可显著减轻AA大鼠的足肿胀度(TFB40mg/kg组与AA模型组比较，p<0. 05 ；TFB80mg/kg组与模型组比较，p〈0.01);同时TFB (80、160mg/kg)在d21、d24显著降低了 AA大鼠全身多发性关节炎指数(表2);TFB160mg/kg能明显降低AA大鼠血清IL-6水平(与模型组比较，P〈0. 05)，而TNF- a水平在TFB各剂量组中均明显降低。病理组织学检查结果提示TFB (40，80，160mg/kg)可明显减少炎性细胞浸润，明显改善关节受损程度。本发明的有益效果本发明发掘了 TFB新的药用前景，开拓了一个新的药用领域；制备的鬼针草总黄酮采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害。鬼针草总黄酮的原药资源非常丰富，具有良好的社会和经济效益；对类风湿性关节炎的疗效确切，为将鬼针草进一步开发为新药提供了强有力的依据。


图I大鼠AA关节炎模型诱导(A :正常组、B :模型组)图2 AA大鼠膝关节肉眼形态。图3 AA大鼠膝关节病理特点。
具体实施例方式实施例I鬼针草总黄酮的提取采用正交实验法对鬼针草总黄酮乙醇提取工艺进行优化，确定乙醇提取的生产工艺为用鬼针草12倍重量、质量浓度为80%的乙醇溶液提取2次，每次I小时。并从总黄酮静态吸附-解吸量、动态吸附-解吸量、静态吸附动力学过程等方面，对国产七种大孔吸附树脂进行研究，选择出了一种最适合于制备鬼针草总黄酮的大孔吸附树脂HPD100。并对HPD100纯化总黄酮的工艺参数进行考查，确定其工艺条件提取液上样浓度为ri. 5mg mL'以2BV IT1的吸附速率进行吸附，最大上样量以总黄酮计为4. 99mg mL—1大孔吸附树脂。吸附后先以4BV水洗去杂质，再用4BV的质量浓度为70%的乙醇溶液以的速率进行洗脱。在此条件下进行吸附、洗脱，树脂可重复使用5次。经大孔树脂吸附、乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮含量为72. 1%，得率为4. 7%0质量控制是中药研制工作的重点。利用化学鉴别法和薄层层析法对TFB进行定性鉴别；采用NaNO2-Al (NO3)-NaOH显色系统，用紫外分光光度法测定了鬼针草总黄酮提取物中黄酮的含量。TFB的含量为73. 3%，平均回收率为96. 51%，RSD为2. 61 %。该法简便、快速、重现性好，可用于TFB的质控方法。
实施例2提取步骤为取鬼针草，用10倍鬼针草重量的、质量浓度为70%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附树脂HPD100吸附；提取液上样浓度为Img mL'以IBV h-1的吸附速率进行吸附，上样量以溶质总黄酮计为3mg mL-1大孔吸附树脂；吸附后先以3BV水洗去杂质，再用3BV质量浓度为70%乙醇以3BV 的速率进行洗脱；在此条件下进行吸附、洗脱，大孔吸附树脂能够重复使用3次；经大孔吸附树脂吸附，质量浓度为70%的乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮的含量和得率。所述鬼针草总黄酮溶液中总黄酮百分含量为75%，得率为3. 8%。实施例3提取步骤为取鬼针草，用14倍鬼针草重量的、质量浓度为90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附树脂HPD100吸附；提取液上样浓度为I. Smg.mL-1,以3BV h-1的吸附速率进行吸附，上样量以溶质总黄酮计为5mg mL-1大孔吸附树脂；吸附后先以5BV水洗去杂质，再用5BV质量浓度为90%乙醇以5BV IT1的速率进行洗脱；在此条件下进行吸附、洗脱，大孔吸附树脂能够重复使用5次；经大孔吸附树脂吸附，质量浓度为709^90%的乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮的含量和得率。所述鬼针草总黄酮溶液中总黄酮百分含量为62. 8%，得率为6%。实施例4鬼针草总黄酮动物性实验动物实验的对象是选取弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant, CFA)诱导的佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis, AA)大鼠模型。实验包括 I、AA大鼠模型的诱导 Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌雄不限，体重160g±20g,由江苏省血吸虫病防治研究所实验动物中心提供。除正常组外，所有大鼠左侧后足跖皮内注射CFA (即为卡介苗80°C、lh灭活后与高压灭菌的液体石腊充分碾磨混勻配成IOmg ml/1的乳剂)0. ImL致炎，造成AA大鼠模型。2、动物分组及给药方案将AA大鼠随机分为5组模型组；TFB (40、80、160mg kg—1)组和雷公藤多苷片(Glucoside Tripterygium Total, GTT) IOmg kg-1 对照组。AA 大鼠于致炎后第 10 24 天分别灌胃给药(ImL IOOg-1);正常组与模型组给予等容量的无菌注射用水。3、关节肿胀度测定分别于致炎前(d0)、致炎后第10天(dlO)、第13天(dl3)、第17天(dl7)、第21天(d21)、第24天(d24)测定右侧(继发侧)足容积，并计算其肿胀度(A mL=致炎后容积-致炎前容积)，以观察AA大鼠继发侧炎症的变化情况。4、多发性关节炎指数(polyarthritis indes,PI)评分 致炎后dlO、dl3、dl7、d21、d24观察并记录全身关节病变程度，按5级评分法评价，计算出PI :0=无红肿；1 =趾关节红肿；2=趾关节和足趾肿胀；3=踝关节以下的足爪肿胀；4=包括踝关节在内的全部足爪肿胀。根据未注射CFA的其余3个关节的病变程度累计积分，即为每只大鼠的PI。5、关节滑膜组织病理组织学检查致炎后d24引颈处死大鼠，取膝关节滑膜及其周围组织，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，作病理组织学检查。采用随机双盲法镜下观察各组大鼠关节组织中炎症细胞浸润、骨侵蚀以及新生血管生成情况并评分0=正常；1=轻度；2=中度；3=严重。病理学评分为3者之和。6、血清IL-6和TNF-a的测定股动脉取血，室温静置过夜，使其充分凝固，然后置于4°C冰箱过夜。以1500rpm离心30min，吸取上部清亮的血清，分装于小瓶中，-20°C冰箱保存待放免法检测。检测方法，严格按照E2、P放免试剂盒说明书提供的步骤进行操作。实验结果如下I、AA大鼠模型的成功制备大鼠左后足趾皮下注射CFA dlO后继发侧(右侧)关节炎出现，以后逐渐表现为以多发性关节炎为特征的慢性、全身性炎症反应。大鼠足爪肿胀明显(如图1B)，实验中见大鼠倦怠、摄食减少、消瘦、多发性关节肿胀及关节触痛，活动障碍等与RA相似的症状。2、TFB对AA模型大鼠继发侧足肿胀度的影响大鼠致炎后第1(T24天继发侧足肿胀度与正常组相比明显增加；与模型组相比，TFB (160mg/kg)于用药后第4天明显减轻AA大鼠的足肿胀度；TFB (40、80mg/kg)自d21开始可显著减轻AA大鼠的足肿胀度；GTT (10mg/kg)自第17天起对AA大鼠的足肿胀度有显著抑制作用(表I)。表I TFB对AA大鼠继发侧关节肿胀度的影响(n=8, x±s )
权利要求
1.鬼针草总黄酮的提取方法，其特征是提取步骤为取鬼针草，用1(T14倍鬼针草重量的、质量浓度为70% 90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附树脂HPDlO吸附提取液；提取液上样浓度为f I. 5mg mL—1，以f 3BV IT1的吸附速率进行吸附，上样量以溶质总黄酮计为:T5 mg 大孔吸附树脂；吸附后先以:T5 BV的水水洗去杂质，再用3 5 BV质量浓度为709^90%的乙醇以3 5 BV 的速率进行洗脱；在此条件下进行吸附、洗脱，大孔吸附树脂能够重复使用3飞次；经大孔吸附树脂吸附，质量浓度为709^90%的乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮的含量和得率。
2.如权利要求I所述鬼针草总黄酮的提取方法，其特征是所述鬼针草总黄酮溶液中总黄酮百分含量为60% 80%，得率为3% 6%。
3.鬼针草总黄酮在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征是所述鬼针草总黄酮溶液在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及鬼针草总黄酮的提取方法及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。鬼针草总黄酮的提取步骤为取鬼针草，用乙醇溶解提取；收集提取液，用大孔吸附树脂吸附；吸附后先以水洗去杂质，再用乙醇进行洗脱；在此条件下进行吸附、洗脱，大孔吸附树脂能够重复使用；经大孔吸附树脂吸附，用乙醇解吸后为鬼针草总黄酮溶液，采用比色法测定鬼针草总黄酮溶液中总黄酮的含量和得率。所述鬼针草总黄酮溶液用于治疗类风湿性关节炎。所述鬼针草总黄酮溶液用于治疗类风湿性关节炎时的用量为80~160mg/kg。本发明发掘了TFB新的药用前景，鬼针草总黄酮对类风湿性关节炎的疗效确切；制备的鬼针草总黄酮采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害。
文档编号A61P19/02GK102716166SQ20121023867
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者李成万, 李霞, 袁凤来, 贺春晖, 赵懿清 申请人:无锡市第三人民医院