专利名称：阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阿魏酸的新用途，具体涉及一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的新用途。
背景技术：
药流后异常子宫出血严重损害患者身心健康，一定程度上影响了药流的接受性，影响了计划生育国策的顺利实施。现有的药流后异常子宫出血治疗方法主要包括清宫术和米非司酮剂量优化，但清宫术具有宫腔操作导致感染、穿孔、疼痛等多种并发症的风险，而现有的米非司酮剂量优化方案存在疗效不稳定等缺点。因此，寻找有疗效确切且副作用小的减轻药流后子宫出血方法和药物将具有重要的临床价值及社会意义。随着生殖免疫学不断发展，免疫因素在妊娠及妊娠相关疾病中的作用日益受到关注。从免疫学角度，正常妊娠类似于成功的半同种异体移植；母体对携带父方组织相容性抗原的胚胎不仅不排斥，而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎免疫耐受微环境，允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩。免疫细胞在母-胎免疫耐受的诱导与维持中扮演了重要角色，T淋巴细胞在其中发挥着重要作用。初始T细胞遇抗原刺激后在特异性核转录因子作用下，分化Thl/Th2/Thl7/Treg亚群，产生不同的细胞因子，在抗感染、维持机体内环境稳定及诱导母-胎免疫耐受中发挥着不同作用。Thl亚群产生IFN Y等细胞因子介导细胞免疫，在机体抗感染中发挥着重要作用，但其过度表达能够诱导母胎免疫排斥，导致流产；Th2亚群产生IL-4等细胞因子，能降低巨噬细胞、自然杀伤细胞活性和淋巴毒素作用，使胚胎逃逸母体免疫排斥，有利于妊娠。正常妊娠存在Th2型免疫偏移，而Thl类细胞因子的优势表达可导致流产的发生。Thl7细胞能分泌大量的IL-17A、IL-17F等细胞因子，在清除胞外病原体、抗真菌中发挥重要作用，同时在组织炎症和自身免疫性疾病发生的过程中起着重要作用，研究发现复发性流产模型动物及患者Thl7亚群比例较正常妊娠升高。Treg通过产生TGF- ^等细胞因子参与维持外周T细胞内环境稳定及在移植耐受的形成，在母-胎免疫耐受中亦发挥关键作用，其功能障碍参与了流产的发生。Thl7细胞与Treg细胞起源于共同的前体细胞，在不同的免疫微环境中向着不同方向分化。正常妊娠时Thl7/Treg向Treg偏移，复发性流产患者则存在Thl7偏移现象。Thl/Th2/Thl7/Treg亚群共同形成复杂精细的免疫调控网络，维持母-胎免疫耐受微环境的稳定，其亚群失衡则打破维持母-胎免疫耐受状态而导致流产发生。研究证实，米非司酮药流妇女血清及蜕膜组织中Thl类细胞因子表达升高、Th2类细胞因子表达降低；动物实验发现米非司酮诱导妊娠小鼠Thl7特征性细胞因子IL-17表达，抑制Treg特征性细胞因子IL_10、TGF_ ^表达，提示T细胞亚群偏移在米非司酮药流中扮演了重要角色。阿魏酸的化学名称为4-羟-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羟基-3-甲氧苯基)_2_丙烯酸，是植物界普遍存在的一种酚酸，在植物中主要与细胞壁多糖和木质素交联构成细胞壁的一部分，是当归、川芎、阿魏等中药的有效成分之一。阿魏酸具有许多功能，如抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突变、防癌等，广泛应用于食品、药品、化妆品等领域，但目前还未见阿魏酸有减轻流产后子宫出血的作用。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的新用途。阿魏酸通过诱导药物流产小鼠母胎界面T细胞亚群(Thl/Th2/Thl7/Treg)向Thl、Thl7亚群偏移，促进母胎免疫排斥，进而减少流产小鼠子宫出血量。为了进一步的说明本发明的实质，下面用阿魏酸的药理实验来说明阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的新用途。药理实验 药物
米非司酮由浙江仙琚制药股份有限公司生产(国药准字H20000648，批号091102)。本发明有效单体成分阿魏酸(CltlHltlNO4),购自中国药品生物制品检定所。小鼠分组与处理
清洁级Balb/C小鼠，由山东大学实验动物中心提供，鼠龄10周，体重(22±2) g，雌性小鼠未交配过，雄性小鼠证明有生育能力。置于室温24 °C,相对湿度60% 65%的超净动物饲养柜内，给予12 h光照，12 h暗室，自由饮水摄食。雌雄小鼠按2:1比例于每日下午5 :00合笼，次日清晨观察小鼠阴栓，发现阴栓日为妊娠第I天。将孕鼠随机分为米非司酮对照组、米非司酮+阿魏酸组(大、中、小剂量)，各10只。米非司酮对照组自小鼠妊娠第6天起，灌胃米非司酮(I. 5 mg O双蒸水，连续灌胃3天；米非司酮+阿魏酸组大、中、小剂量组分别灌胃米非司酮(I. 5 mg - kg-1 .d-1)+大、中、小剂量阿魏酸(20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)连续灌胃3天。 标本收集与检测
(I)自药物处理第I天起，小鼠阴道内置入20 g定量棉球，每日更换，置于密闭EP管内，4°C保存，改良碱性正铁血红素法检测小鼠子宫出血量。(2)流式细胞术包内外双染色法检测母胎界面Thl/Th2/Thl7/Treg亚群比例分离子宫组织，剪至ImmX Imm大小，200目铜网研磨过滤，I XPBS冲洗，Ficoll密度梯度离心法分离子宫组织单个核细胞，调整子宫组织单个核细胞浓度为I X IO6个/mL，加入佛波酯30 ng/mL、离子霉素I y g/mL、莫能霉素I. 7 ng/mL, 37 °C, 5% CO2孵育4 h。收集细胞，I XPBS洗2遍，去上清，加入大鼠血清，室温避光孵育30 min。将外标抗体(FITC-⑶4、PC5-⑶25)按说明书分别加入到细胞悬液中，4 1避光孵育30 min;lXPBS洗2次，去上清；BD固定穿膜试剂盒固定穿膜(按说明书操作)，加入内标抗体(PE-IFN-y，PE-IL-4，PE-IL17A，PE-Foxp3)，4 1避光孵育30 min ;穿膜缓冲液洗2次，去上清，I XPBS重悬细胞，转管，上机检测。Winmidi 2. 9 分析 Thl 亚群(CD4+ IFN-Y+)、Th2 亚群(CD4+IL_4+)、Thl7 亚群(CD4+IL-17A+)及 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)比例，计算 Thl/Th2 比值及 Thl7/Treg 比值。(3) Western blot法检测子宫组织T细胞亚群分化特异性核转录因子蛋白表达分离子宫组织，剪至ImmX Imm大小，200目铜网研磨过滤，I XPBS冲洗，Ficoll密度梯度离心法分离子宫组织单个核细胞，调整子宫组织单个核细胞浓度为IX IO6个/mL，加入蛋白裂解液100微升，冰浴混匀，冰浴静置30分钟，4°C 12000rpm / min，离心30min，取上清，10%SDS-PAGE电泳并转膜，封闭、加入兔抗小鼠T-bet、GATA3、R0R Y t、Foxp3抗体(按说明书操作)，4°C孵育过夜；洗涤后加入山羊抗兔辣根过氧化酶标记二抗，37°C孵育I. 5h ;充分洗涤后与增强化学发光试剂反应，增强化学发光法曝光显色(LAS-4000mini化学发光图像分析仪)，以GAPDH为内参照，计算目的蛋白与同步GAPDH灰度值比值作为相对表达量。统计学分析
采用方差分析，计量资料以;± s表示，采用One Way-ANOVA方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls法检验〈O. 05为差异有统计学意义。结果
(I)阿魏酸有效减少药流小鼠子宫出血量 表I各组药流后小鼠子宫出血量对照表
权利要求
1.阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种阿魏酸的新用途，具体涉及一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的新用途，阿魏酸能优势诱导米非司酮药流小鼠母胎界面Th1、Th17亚群特异性核转录因子蛋白表达啊，降低Th2、Treg亚群特异性核转录因子蛋白表达，进而诱导T细胞向Th1、Th17亚群偏移，促进母胎免疫排斥，从而减轻药流小鼠子宫出血量。
文档编号A61P15/00GK102961370SQ201210497129
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者李霞, 王彬, 姚成芳, 王丽, 周宪宾, 郭钰琪, 赵向忠, 张巧凤, 姜国胜 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所