专利名称：一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及使用方法
技术领域：
本发明涉及爱德华氏菌疫苗免疫防治技术，具体是一种可以增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法。
背景技术：
爱德华氏菌(Edwardsiella sp.)，是当前水产养殖中的主要病原菌之一，目前包含迟缓爱德华氏菌(E. tarda)、鮰鱼爱德华氏菌(E.1ctaluri)和保科爱德华氏菌(E.hoshinae)三个种，其宿主范围十分广泛，鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及包括人类的哺乳类都有感染报道，且呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大 利亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区。从1962年首次报道至今，该病原对多种鱼类养殖业造成了巨大损失。采用抗生素和化学药物等方法进行预防或治疗，往往带来诸如病原的耐药性、药物残留以及水环境的污染等弊端，也引起了食品安全及环境污染等相关问题。当前在水生动物疾病防控方面，以疫苗免疫技术为基础的综合防控技术体系是被国际上普遍认可、接受并积极推广的病害控制技术，具有良好的开发应用前景。目前，国内处对爱德华氏菌疫苗有了较为广泛的研究，并取得了一系列的研究成果。其中传统疫苗(包括灭活疫苗、细胞提取物、佐剂疫苗)因具有制作简单，成本低、安全性高等优点成为各种疫苗形式的首选，但研究表明，爱德华氏菌与其他病原菌不同，常规灭活疫苗所产生的免疫保护效果不尽理想。Gutierrez和Miyazaki (1994)研究中福尔马林灭活的爱德华氏菌注射免疫日本鳗的相对保护率(RPS)仅为12. 5—25% ;Sun等(2011)报道用爱德华氏菌的单价灭活疫苗免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus)的RPS只有33. 3% ;我们前期实验采用常规技术制作的E. tarda灭活疫苗的相对保护率(RPS)也不到40%。近期,Hossain和Kawai (2009)和Hossain等(2011)报道了米用高压灭活(600psi,5min)的方式制备的爱德华氏菌灭活疫苗具有较好的免疫效果，腹腔注射日本鳗(Anguillajaponica)后，其RPS在80% — 85%范围内。但高压的方法存在技术局限性，例如设备代价非常高，技术难度大，难以对大批量细菌进行生产性的操作。近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，爱德华氏菌新型疫苗不断涌现，并在水生动物实验中显示出良好的应用前景，例如DNA疫苗(Jiao等(2009)、亚单位疫苗(Liu等(2005)，Jiao等(2009)、菌蜕疫苗(Kwon等(2007)、减毒活疫苗(Mo等，2007 ；Xiao等，2011)等也有较多报道，，但出于应用安全性、研制周期及成本等因素考虑，这些新型疫苗仍然得不到商品化的应用。总体来说，爱德华氏菌疫苗的免疫效果不尽理想，近年来，人们已开始重视佐剂在其免疫技术中的应用，并取得了一定的成果。佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原混合使用可以增强机体免疫应答或改变免疫应答类型。Castro等(2008)研究结果用灭活爱德华氏菌疫苗与商业佐剂MontanideISA 763 AVG (Seppic, France)联合使用，I次注射接种免疫大菱鲆，其RPS在6个月后仍然超过90%，而此时单一注射免疫灭活组的RPS只有20% ;上述的Sun等(2011)的报道中，当灭活的爱德华氏菌与鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等另三种菌联合使用时,其RPS可达到70. 9%，该结果中鳗弧菌等其他三种菌灭活疫苗起到了爱德华氏菌灭活疫苗免疫佐剂的作用。目前在水产养殖中疫苗佐剂种类较少，且应用效果各有差异，其中应用于爱德华氏菌疫苗的佐剂报道甚少，因此开发其新型高效佐剂对于该病原的免疫防控具有重要意义。￠-1, 3-葡聚糖是一种多糖，主要来源于包括谷物、酵母、部分真菌和海藻中。研究证实葡聚糖自身具有特殊的分子结构使其易被免疫系统识别及接受，可有效激活巨噬细胞、嗜中性白血球等，刺激释放细胞因子及特异性抗体的生成，并诱导机体的体液与细胞免疫应答，提高机体的免疫功能。3 -葡聚糖还具有清除游离基、抗辐射、抗肿瘤、溶解胆固醇，预防高脂血症作用，对滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染也具有一定的抵抗作用，目前在医药、食品、化妆品等行业已有着较广泛应用。葡聚糖在水产养殖中的应用主要是作为非特异性免疫增强剂使用，例如常见添加到虾饲料中用于提高对虾的非特异性抗病力，也有作为鱼类饲料添加剂用以非特异性地提高鱼的抗病力，葡聚糖的添加具有增强水生动物对病原的抵抗力，促进生长，并可提高动物的生产性能及饲料利用率，但目前没有将葡聚糖作为爱德华氏菌疫苗的佐剂的研究报道、专利或应用
发明内容
本发明的目的是提供一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法，以提高爱德华氏菌疫苗抗原接种后的免疫效果。本发明所述的一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂，为从谷物、酵母、真菌或海藻中获得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增强免疫接种效果的，对上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品进行人工改造、合成的产物。上述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的该制品的￠-1, 3-葡聚糖，或具有增强疫苗接种效果的3 -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成产物。本发明的增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂的使用方法，包括如下三种方式I)与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用；2)制成不包含疫苗抗原的佐剂制剂，在免疫接种前与疫苗抗原混合后同时使用；3)与疫苗抗原不同时使用。对于第I种方式，加入到包含疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中，上述佐剂有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1，其免疫接种途径可以为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他将佐剂有效成分和疫苗抗原导入到水生动物体内的任何免疫接种途径。对于第2种方式，含有上述佐剂有效成分的制剂在疫苗抗原对水生动物进行免疫接种前临时添加到含有疫苗抗原的制剂中并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。对于第3种方式，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分与饲料或浸浴水体重量比为1/100000—1/100，添加时间为疫苗制剂对待免疫水生动物进行注射、创伤、浸浴或口服免疫接种前3日至接种后30日以内，实施I一5日的投喂或浸浴等免疫增强操作。以上免疫应用方式使佐剂有效成分P -1, 3-葡聚糖在爱德华氏菌疫苗抗原与水生动物免疫系统作用时达到一定的浓度，从而让免疫细胞在递呈、加工、识别疫苗抗原的过程中受到葡聚糖的刺激，使免疫细胞的活性得以进一步提高，从而更好地活化免疫系统对疫苗抗原的应答，有效增强疫苗抗原的免疫效果。本发明发现佐剂有效成分的剂量对疫苗免疫效果有重要影响，在佐剂安全浓度范围以内，两者具有一定的相关性。当佐剂有效成分的使用剂量超过安全剂量范围时，会对水生动物有致死作用，因此有必要针对待免疫水生动物种类及具体的免疫方式条件下进行佐剂的给药方式测试或查明给药后2— 4周内不会导致水生动物死亡的最高剂量，以此确定上述佐剂有效成分在水生动物中使用时的安全剂量。本发明证实上述佐剂的有效成分在水生动物体内的剂量达到安全剂量的1/100 — 4/5时可增强疫苗的免疫效果。本发明的爱德华氏菌疫苗佐剂可应用于鱼类、两栖类和爬行类的疫苗免疫接种，包括海水养殖鱼类(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河飩等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼等)、淡水养殖鱼类(如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈等)、观赏鱼(如金鱼、锦鲤等)、两栖类(如牛蛙、大鲵等)和爬行类(如鳖、龟、蛇等)的疫苗接种。不同的水生动物的安 全剂量和有效剂量不同，对于特定水生动物的具体应用剂量，应该进行单独测试。本发明的积极效果在于所涉及佐剂可以提高爱德华氏菌疫苗抗原免疫接种后的特异性和非特异性免疫保护力。对于爱德华氏菌这种胞内感染或具有免疫逃避能力的病原的疫苗，本发明佐剂可有效的增强免疫保护作用，使用方法安全，对操作人员和环境无害，因而具有良好的应用前景和市场推广价值。
具体实施例方式鉴于佐剂有效成分的剂量对疫苗抗原免疫效果有着重要影响，佐剂有效成分的使用剂量过低往往达不到增强免疫的效果，而过高的使用剂量往往会对水生动物产生不利或致死作用。因此上述佐剂在使用中应首先针对具体的水生动物种类、年龄和接种方法等通过疫苗保护实验确定上述佐剂有效成分在具体疫苗产品中的安全剂量范围及最佳使用浓度。在爱德华氏菌疫苗制剂中佐剂有效成分的浓度为lmg/g — 20mg/g(佐剂有效成分重量/疫苗制剂重量)，水生动物饲料中佐剂有效成分的浓度为0. lg/kg — 5g/kg(佐剂有效成分重量/饲料重量)，在给药后水生动物体内佐剂有效成分的浓度达到1. OX 10_3mg/g — 5. Omg/g(佐剂有效成分重量/水生动物体重)。爱德华氏菌疫苗制剂中的抗原成分可以源自于迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌或保科爱德华氏菌等爱德华氏菌属的细菌的一种或一种以上的的病原的抗原或能在水生动物体内产生相应的抗原，也可以是包含源自爱德华氏菌的抗原和其他病原菌或病毒的抗原制成的联合疫苗制剂。疫苗抗原的类型可以为灭活菌体、菌蜕成分、弱毒株、减毒株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因的表达载体的任何一种或一种以上，上述抗原在疫苗制剂中可是单一种或一种以上以联合、整合或多价方式存在，制成的爱德华氏菌疫苗制剂除了抗原或能产生抗原的表达载体以外，还可包含其它的佐剂、保护剂、防腐剂、稀释齐U、溶剂等多种成分。本发明佐剂在应用中可以与疫苗抗原混合使用，也可以制成单一制剂与疫苗抗原混合后同时使用，还可以与疫苗抗原不同时使用。应用中的免疫接种方式可以为注射免疫、创伤免疫、浸泡免疫或口服免疫。
本发明证明酵母提取物中的￠-1, 3-葡聚糖能有效起到爱德华氏菌疫苗佐剂的作用，应用中与爱德华氏菌灭活疫苗协同使用时，能显著提高爱德华氏菌灭活疫苗的免疫保护率。所述的￠-1, 3-葡聚糖是从谷物、酵母、真菌或海藻中提取的，本发明证实了^ -1, 3-葡聚糖具有增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的功效，因此本发明的有效成分的功效包含3-1，3-葡聚糖的天然产物、人工改造产物或人工合成产物。天然的3-1，3-葡聚糖可提取自谷物、酵母、部分真菌和海藻等，对于不改变3 -1, 3-葡聚糖核心分子结构的人工改造产物或人工合成及仿制的产物可能增强或减弱本发明所涉及的功效，只要这种功效依然保留，就仍属于本专利的保护范围之内。本发明的使用方法如下(I)佐剂安全剂量的确定制备包含P -葡聚糖的0. 1%—10%的PBS (pH7. 2)溶 液，经0. 22 y m的滤膜过滤除菌，再用不同浓度的上述佐剂接种待免疫水生动物，接种方式可以是注射免疫、创伤免疫、浸泡免疫或口服免疫。免疫水生动物观察2周，根据实验结果来确定该佐剂安全剂量。(2)爱德华氏菌疫苗制剂制备及使用灭活疫苗制备中，向爱德华氏菌悬液中加入甲醛(36. 5—38%, w/v)，调节其终浓度为0. 3%—l%，4°C过夜，用PBS (pH7. 2)清洗3次后，制备一定浓度的灭活疫苗。将安全剂量范围内的佐剂与灭活疫苗按一定的比例混合后对待免疫水生动物进行免疫接种，再将水生动物进行正常养殖管理即可。使用减毒活疫苗时，则无需进行灭活处理。(3)疫苗产品中佐剂最佳剂量的确定疫苗制剂的使用方法可以有以下三种方式1)与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用；或者2)制成单一制剂与疫苗抗原混合后同时使用；或者3)与疫苗抗原不同时使用。对于第I种方式，加入到包含爱德华氏菌疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中上述佐剂有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。对于第2种方式，上述佐剂有效成分在爱德华氏菌疫苗制剂对水生动物进行免疫接种前临时添加并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的1/10—1000/1，其免疫接种方式可以为注射、创伤、浸浴或口服免疫。对于第3种方式，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分与饲料或浸浴水体重量比为1/100000—1/100，添加时间为爱德华氏菌疫苗制剂对待免疫水生动物进行注射、创伤、浸浴或口服免疫接种前3日至接种后15日以内，实施I一5日的投喂或浸浴等免疫增强操作。待免疫水生动物经上述疫苗制剂接种后，30— 60天后进行人工感染实验，通过14—60天后的相关生理生化指标(如增重率、抗体效价等)及相对保护率(RPS)等免疫指标的分析，以确定佐剂的最佳使用剂量。实施例1:0-1，3-葡聚糖对大菱鲆(Scophthatmus maximus)注射安全剂量的确
定选用健康大菱鲆(11. 4±1. 8) g，试验前在水泥池中暂养2周后，置于圆形玻璃钢桶(盛水0. 7米3)中，流水养殖，水温为18±2°C，盐度28%。±2%。，24小时连续充气。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料，日投喂3次，每日换水并清污2次。注射前对大菱鲆用MS222(I 9000 )进行浸泡麻醉处理。分别用浓度为2、5、8、10和20 mg/mL的P _1，3-葡聚糖腹腔注射20尾大菱鲆，注射剂量为100 u L/尾，观察14天。各实验组大菱鲆14天中死亡情况见表1，由结果确定P -1, 3-葡聚糖对大菱鲆的最大安全腹腔注射剂量为1000 u g/尾，即87. 7 u g/g (葡聚糖/鱼体重)。表1. 0 -1, 3-葡聚糖对大菱鲆注射安全剂量试验
权利要求
1.一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂，其特征是上述佐剂为从谷物、酵母、真菌或海藻中获得的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品；以及及具有增强免疫接种效果的，对上述的葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品进行人工改造、合成的产物。
2.如权利要求1所述的增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品的有效成分为β -1,3-葡聚糖。
3.如权利要求1所述的增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂，其特征在于所述葡聚糖提取物或含葡聚糖成分的制品为β -1, 3-葡聚糖，或具有增强疫苗接种效果的β -1, 3-葡聚糖的人工改造、合成产物。
4.权利要求1所述的增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂的应用，是与爱德华氏菌疫苗抗原联用免疫接种水生动物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述佐剂联用免疫接种的疫苗抗原包含源自于迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌或保科爱德华氏菌等爱德华氏菌属的细菌的一种或一种以上的疫苗抗原；疫苗抗原类型包括灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述佐剂与疫苗抗原联用免疫接种水生动物的应用包含以下三种方式上述佐剂与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用，或者制成不含疫苗抗原的佐剂制剂但与疫苗抗原同时使用，或者与疫苗抗原不同时使用。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述佐剂的三种应用方式是 (1)与疫苗抗原混合制成疫苗制剂使用时，加入到包含爱德华氏菌疫苗抗原的针剂、浸浴剂或口服剂中上述佐剂的有效成分与疫苗抗原重量比为1/10—1000/1 ； (2)制成不含疫苗抗原的佐剂制剂但与疫苗抗原同时使用时，上述佐剂的有效成分在疫苗制剂对水生动物进行免疫接种前临时添加并充分混匀，添加量为疫苗抗原重量的1/10—1000/1 ； (3)与疫苗抗原不同时使用时，加入到水生动物饲料或浸浴水体中的上述佐剂的有效成分按饲料或浸浴水体重量的1/100000—1/100进行添加，添加时间为疫苗制剂对待免疫水生动物进行免疫接种前3日至接种后30日以内，可以给药I次或多次。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述水生动物进行免疫接种时，可以采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫、口服免疫或其他将佐剂有效成分和疫苗抗原导入到水生动物体内的任何免疫接种途径。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述佐剂在应用前，针对上述佐剂的不同应用方式，查明在免疫条件下给药后14日内有效成分对水生动物体的安全剂量范围，确定上述佐剂的实际用量，使给药后有效成分在水生动物体内的含量为上述安全剂量的1/100—4/5。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述佐剂及共同应用的疫苗免疫接种的水生动物对象包括海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类、淡水养殖鱼类、观赏鱼类和淡水养殖的两栖类和爬行类。
全文摘要
本发明涉及一种增强爱德华氏菌疫苗免疫接种效果的佐剂及其应用方法。其特征是上述的佐剂提取自谷物、酵母、部分真菌或海藻等原料，其有效成分为包含β-1，3-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖的天然、人工改造或人工合成产物。该佐剂的应用可增强爱德华氏菌的灭活菌体、菌蜕成分、弱毒菌株、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上的爱德华氏菌疫苗抗原接种后的特异性免疫保护率；应用中可以与疫苗抗原混合使用，也可以制成单一制剂但与疫苗抗原同时使用，还可以与疫苗抗原不同时使用。
文档编号A61P37/02GK102988981SQ201210539588
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者黄倢, 谢国驷, 隋虎辰, 王秀华, 边慧慧, 史成银, 刘莉 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所