专利名称：长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种预防鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法。
鹦鹉幼雏病(又称长尾小鹦鹉幼雏病毒病)是由长尾小鹦鹉幼雏病毒引起的一种高死亡率的急性传染病，鹦鹉类鸟多易感。自90年代以来，在世界多个地区广泛流行，严重地阻碍着鹦鹉养殖业及各种类笼养鸟的向前发展。湖北省云梦县是全国最大的笼养鸟基地之一，94-96年间发生了前所未有的大规模鹦鹉幼雏死亡，死亡率超过80％；迅速波及其他鹦鹉养殖区及外省区域，造成了严重的经济损失。
迄今，国内外尚无对鹦鹉幼雏病采用疫苗防治的相关研究报道。目前“查新”中未见有相关鹦鹉幼雏病疫苗的资料。近几年来德国、美国进行了鹦鹉幼雏病毒分子结构的研究，对疫苗的开发具有潜在的意义。德国墨尼黑大学Müiller教授、美国的禽病学家在研究中发现BFDV-DNA对甲醛具有稳定性，对Ethylenimine(乙烯亚胺)敏感，而该试剂具有较强的致癌性；而且燃点为42℃，极不安全。
本发明的目的是提供一种长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的制备方法，采用长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，用组织细胞培养方法生产长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，疫苗接种后可有效地预防长尾小鹦鹉幼雏病毒病。对鹦鹉的免疫保护率达到99．76％左右。
本发明所涉及长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，是由强毒型的长尾小鹦鹉幼雏病毒(Budgerigar Fledgling Disease Virus，BFDV)采用连续鹦鹉胚成纤维细胞适应性培养后，再转接到鸡胚成纤维细胞培养转接30代以上得到的弱毒株，该弱毒株特有的重要生物活性是已丧失对其原宿主动物(鹦鹉)的致病力，保留了良好的免疫原性。长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，已于1999年12月8日交送保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NOV99006。
鹦鹉幼雏病毒弱毒株病毒的主要生物学特性鹦鹉幼雏病毒呈二十面体对称球形颗粒，直径约45-50纳米，无囊膜，核酸是DNA类型；此病毒对热、冻融和氯仿、乙醇、甲醛、乙醚等化学试剂具有稳定性；接种在鸡胚成纤维细胞培养可引起细胞病变，细胞体肿胀变圆、细胞核肿大并出现拉网现象。对其原宿主动物(鹦鹉)的无致病力，有良好的免疫原性。
制备长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的技术方案是将长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒按5％～10％接种于鸡胚成纤维细胞，在37℃～39．5℃培养，收集48-72小时产生细胞病变的病毒液，采用0．9％ N．S作为稀释液，按1∶10的比例稀释，得到长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，可有效的预防鹦鹉幼雏病毒病的发生。该弱毒疫苗对鹦鹉的免疫保护率99．62-100％，平均为99．76％，对鹦鹉的的免疫保护期不低于8个月；该疫苗在低温条件下有较长的保存期。
2．取长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒按5％接种鸡胚成纤维细胞(单层)，置38℃培养(37～39℃均可)；24小时细胞出现病变，见细胞体肿胀变圆、细胞核肿大并出现拉网现象；收集48-72小时的病毒液(在此时间范围内选择细胞病变明显的收集)。
3．采用免疫琼脂扩散法检测病毒液效价，以出现明显免疫沉淀线为阳性。
4．按1∶10比例稀释病毒液，即1∶0．9％N．S。
5．疫苗杂菌检验，合格后分装冷藏。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(1)免疫保护性强采用鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，0．2ml／只，接种鹦鹉，对照组用鹦鹉幼雏病毒野毒接种；将接种疫苗的鹦鹉在第14天攻毒(野毒)，观察20～100天，接种疫苗的鹦鹉表现有较强的保护性，免受鹦鹉幼雏病毒野的侵袭；而接种鹦鹉幼雏病毒野毒的鹦鹉则无保护；疫苗对鹦鹉的免疫保护率为99．76％。结果见表一表一鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗免疫保护率检测结果
结果表明鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗对鹦鹉的保护率为99．76％。
(2)安全性好采用健康鹦鹉15日龄以下幼雏，接种鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗0．2ml／只，饲养观察100天。结果见表二表二鹦鹉幼雏病毒不同代弱毒株安全性试验结果鹦鹉幼雏病毒弱毒株 只死亡 存活安全率％25代 125 8 117 93．630代 117 3 114 97．435代 156 1 155 99．040代 121 1 120 99．0*平均安全率为97．25％。
(3)免疫血清抗体测试采用长尾鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗接种15龄以下雏鹦鹉，分别在免疫后10、15、25、40、60、100天取血检测，采用免疫琼脂扩散法，血清稀释按1∶100比例稀释。结果见表三表三 鹦鹉幼雏病毒弱毒免疫血清抗体检测结果天数 只免疫沉淀线1057 +-++1538 ++2535 ++4030 +-++6028 +100 46 +*鹦鹉幼雏病毒弱毒免疫血清抗体出现高峰在第10天-25天；其维持时间较长。
(4)疫苗保存期长4批疫苗(批号980906、981020、990115、990327)在-10～4℃可保存10个月左右。
(5)预防效果好用鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗(批号980906、981020、990115、990327)先后在湖北省云梦、孝感、应城三个地区，5个鹦鹉养殖场、10余家养殖户使用。免疫免疫雏、青年和成年鹦鹉5260余对，接种后临床观察2-6个月，安全，免疫效果良好。
(6)采用本法明制备鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，生产工艺简便，成本低。
权利要求
1．一种长尾小鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法，其特征是A．采用长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，保藏编号CCTCC NOV99006，制备鸡胚成纤维细胞，采用9-10日龄鸡胚，在无菌条件下取出胚体，匀浆，加入PH7．5的5％的胰蛋白酶消化液，混匀，置37℃水浴消化，取出离心弃消化液，装在细胞培养瓶，加10％小牛血清，组织培养液，37℃培养16-18小时的细胞形成单层；B．取长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒5％接种鸡胚成纤维细胞，置38℃培养，24小时出现细胞病变；C．收集培养48-72小时有细胞病变的病毒液；D．免疫琼脂扩散法检测其效价为阳性，按1∶10比例稀释；E．杂菌检验合格后分装冷藏。
全文摘要
本发明公开了一种预防鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法。其步骤是:将长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒液5～10%接种于鸡胚成纤维细胞;在37℃～39.5℃培养温度,收集48—72小时产生细胞病变的病毒液;采用0.9%N.S作为稀释液,按1∶10的比例稀释;进行杂菌检验,合格后分装冷藏。疫苗对鹦鹉的免疫保护性强,保护率99.62—100%、安全性好、保存期长、生产工艺简便,成本低;可有效的预防鹦鹉幼雏病毒病。
文档编号A61K39/12GK1289621SQ00114489
公开日2001年4月4日 申请日期2000年4月17日 优先权日2000年4月17日
发明者李天宪, 陈绳亮, 冯峰, 夏韦, 赵林 申请人:中国科学院武汉病毒研究所