专利名称：：一种柴胡总皂苷的制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种从中药柴胡中提取纯化制备柴胡总皂苷的方法。技术背景柴胡为伞形科植物柴胡5wp/ewramc/z/"eraeDC.或狭叶柴胡^^/ewwm^wzo"^/b/Z画Willd.的干燥根。具有和解少阳，舒肝解郁，升举阳气等功效，用于治疗外感发热，肝郁气滞，胸胁疼痛，气虚下陷等病症，在我国中医药史上己有上千年的临床应用，疗效显著。现代药理研究证明，柴胡总皂苷、柴胡挥发油、柴胡总黄酮和柴胡多糖为其主要活性成分，而柴胡总皂苷较其它活性成分含量高、疗效明显。国内关于柴胡主要有效成分柴胡总皂苷的生物活性的报道非常多，研究发现柴胡总皂苷具有抗炎、抗病毒、抗细菌内毒素、降血脂、促酶分泌、保肝、抗肿瘤、抗惊厥等多种作用。(参见叶晓平等，柴胡皂苷药理研究进展，中草药，12(1434):35，2004和李芳等；柴胡的药理研究进展，时珍国医国药，2(120):15，2004)。然而，市场上含有柴胡的药物制剂多为解热抗炎药，主要用于治疗呼吸道感染、肺炎、感冒等发热病症，用于其他适应症的制剂很少。这主要是因为，目前柴胡的处理工艺只停留在水煎煮的提取阶段，其主要有效成分柴胡总皂苷因极性较小很难被充分提出，传统纯化工艺粗糙，制备物中杂质多，有效组分含量较低，致使临床用药量大且影响疗效和用药安全。另外，柴胡总皂苷由多种结构相似的皂苷类成分组成，各种成分难于分离纯化，《中国药典》也没有柴胡有效成分的含量测定，致使现有产品质量不高，制剂质量也难于控制。经检索目前柴胡的相关文献报道多为柴胡化学成分、提取工艺以及含量测定和药理作用研究，对于有效成分柴胡总皂苷制备方法的研究较少，这是因为柴胡所含皂苷类成分主要为齐墩果烷型双糖苷，极性较小，而且化学结构中含有氧环，化学性质不稳定。而且柴胡皂苷于药材中含量较低，很难得到转移效率高、纯度好的提取物。在目前少有的几篇关于纯化总皂苷的报道中(参见张相年等，柴胡总皂苷分离工艺的研究，华西药学杂志，5(350):17，2002和宋海妹等，柴胡皂苷的提取与鉴定，大连轻工业学院学报，1(15):24，2005)，其纯度也没有达到50%以上，而且纯化过程中有机试剂应用较多，工艺复杂，重复性差，难于实现工业化生产。专利02137936.X主要介绍了柴胡总黄酮的制备方法，并未进一步研究柴胡主要有效成分柴胡总皂苷的制备方法。专利200610099498.7主要介绍了一种柴胡提取物的制备方法，明确了采用该方法制备的柴胡提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。从目前的研究来看，将柴胡表里兼治的独特作用简单归因于柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d，显然缺乏说服力。通过我们的研究，按照专利200610099498.7中介绍的制备方法制备，提取物杂质较多难于直接适用于大孔树脂吸附柱，只有在上样量非常少的情况下可以通过大孔树脂柱，但是仍然无法得到其权利要求1、2、3提及的含量较高的柴胡皂苷提取物，而且不利于产业化。因此有必要进一步研究柴胡提取纯化工艺，提高柴胡总皂苷的纯度，为临床应用、新药研发和工业生产提供更有力的药效物质基础和生产指导。
发明内容本发明的目的在于提供一种柴胡总皂苷的新的制备方法。本发明应用乙醇溶液提取柴胡药材，在纯化工艺过程中通过控制乙醇的含量、应用大孔吸附树脂等方法，可以按要求制备得到适用于工业生产的所需不同纯度的柴胡总皂苷提取物。本发明大大提高了柴胡总皂苷的提取效率和纯度，使柴胡总皂苷的提取转移率高达80%以上，纯化转移率高达70%以上，柴胡总皂苷在制备物干燥品中重量比高达50%以上。本发明工艺可靠，重复性好，不但适用于工业生产，更为新药开发、临床应用提供了技术支持，因此具有广阔的应用前景。这种柴胡总皂苷的制备方法，其特征在于柴胡总皂苷的提取转移率不低于50%。根据原料、工艺和操作的不同，柴胡总皂苷的提取转移率可实现80%以上的结果。同时在柴胡总皂苷制备过程中，柴胡总皂苷的纯化转移率不低于50%。在此范围内，通过原料的筛选、工艺的优化，以及良好的操作控制，能够实现柴胡总皂苷的纯化转移率达到70%以上的结果。从中药柴胡中提取并纯化得到柴胡总皂苷制备物的具体工艺步骤如下-.1.取柴胡药材，切碎，用pH714的乙醇水溶液提取24次，每次提取l4小时，提取体积为515倍量。过滤，合并，浓縮滤液得到柴胡提取液。2.控制柴胡提取液中含醇的比例为10%40%，混匀，静置或离心，倾出上清液，反复数次，沉淀为柴胡总皂苷粗品。3.向柴胡总皂苷粗品中加入少量乙醇，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，静置或离心，取上清液；反复数次，合并上清液，浓縮，即为柴胡总皂苷纯化物。4.将柴胡总皂苷纯化物加水稀释，上已处理好的大孔吸附树脂柱，静置吸附15个小时。先用纯化水冲洗至无色，再用13个柱体积的30%60%乙醇洗脱杂质，再用35个柱体积的50%90%乙醇洗脱，收集50%90%乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即为柴胡总皂苷精制品。按照具体工艺步骤l、2、3、4操作步骤制备得到柴胡总皂苷精制品，其纯度不低于50%。制备纯度较低的柴胡总皂苷时，简化工艺如下可以从上述工艺步骤中减少第3项和第4项，即由第1项和第2项操作步骤制备得到柴胡总皂苷粗品，其纯度不低于15%;还可以从上述工艺歩骤中略去第4项，即由第1项、第2项和第3项操作步骤制备得到柴胡总皂苷纯化品，其纯度不低于35%。正交实验设计考察不同提取溶液(水，乙醇)、不同提取用量、不同提取时间对柴胡总皂苷提取效率和纯度的影响。发现应用40%95%的乙醇溶液提取24次，每次提取14小时，提取体积为515倍量为最佳提取方法。研究发现，不同浓度的乙醇溶液对柴胡总皂苷的提取效率和纯度影响很大，其中浓度为55%85%的乙醇溶液可以使其达到最佳效果。进一步研究发现，柴胡皂苷在pH为811的碱性提取液中较酸性、中性提取液性质更为稳定，提取效率明显提高。究其原理，具体实验过程如下称取相同重量的柴胡总皂苷，于不同pH值的70%乙醇溶液中加热回流8小时，使其充分反应。用紫外光谱法检测柴胡总皂苷质量、用高效液相色谱法测定柴胡皂苷a含量，实验数据见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注原液是指柴胡总皂苷的70%乙醇溶液，即pH值为7、未加热回流发生反应、直接用于检测，旨在作为对照溶液证实实验结果。其中使乙醇溶液pH值达到要求的碱性物质可以是氢氧化钠(钾)，氨水，碳酸钠(钾)，碳酸氢钠(钾)。在柴胡精制工艺中，所用大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂。根据柴胡总皂苷的性质，优选弱极性大孔树脂，这些树脂可以是DlOl，D201，D301，HPDIOO，HPD300，HPD400，HPD500，AB-8，X-5。柴胡总皂苷的检测方法以紫外一可见分光光度法(外标法)为主，即以0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和浓磷酸为显色剂，在536ran540nm范围内有最大吸收。同时辅以高效液相色谱法测定柴胡总皂苷中比例较大的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，为柴胡总皂苷的含量测定提供可靠保证。具体实施方式实施例1:柴胡药材1000克，加pH8的40。/。的乙醇溶液5倍量，加热回流提取2次，每次1小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为10%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的卯％乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7(TC浓縮至无醇味，加水稀释至原药材3倍量重量，上已处理好的HPD300大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用3个柱体积的30%乙醇洗脱杂质，再用7个柱体积的50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，低温浓縮至干，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为60%，纯化转移率为57%，该柴胡精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为50%。实施例2:柴胡药材1000克，加pHll的95%的乙醇溶液15倍量，加热回流提取4次，每次4小时。过滤，合并，浓缩滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为40%,混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7CTC浓縮至无醇味，加适量水稀释，上己处理好的HPD100大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用1个柱体积的60%乙醇洗脱杂质，再用3个柱体积的90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱液，低温浓縮至干，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为89%，纯化转移率为54%，该柴胡总皂苷精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为54%。柴胡药材1000克，加pH8的55%的乙醇溶液5倍量，加热回流提取2次，每次1小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为10%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7(TC浓縮至无醇味，加水稀释至原药材3倍量重量，上已处理好的D201大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用3个柱体积的30%乙醇洗脱杂质，再用5个柱体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，低温浓縮至干，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为66%，纯化转移率为60%，该柴胡总皂苷精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为52%。实施例4:柴胡药材1000克，加pHll的85%的乙醇溶液15倍量，加热回流提取4次，每次4小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为40%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶.解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7(TC浓縮至无醇味，加适量水稀释，上已处理好的HPD100大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用1个柱体积的60%乙醇洗脱杂质，再用3个柱体积的90%乙醇洗脱，收集卯％乙醇洗脱液，低温浓縮至千，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外—可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为86%，纯化转移率为55%，该柴胡总皂苷精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为57%。实施例5:柴胡药材1000克，加pH10的75%的乙醇溶液12倍量，加热回流提取3次，每次3小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为20%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的85%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，60'C浓縮至无醇味，加水稀释至原药材4倍量重量，上已处理好的DIOI大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用2个柱体积的50%乙醇洗脱杂质，再用4个柱体积的90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱液，低温浓縮至千，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为90%，纯化转移率为74%，该柴胡总皂苷精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为60%。实施例6:柴胡药材1000克，加pHll的70%的乙醇溶液10倍量，加热回流提取4次，每次2小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为25%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，6(TC浓縮至无醇味，加水稀释至原药材4倍量重量，上已处理好的HPD100大孔吸附树脂柱，充分足量吸附。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用3个柱体积的40%乙醇洗脱杂质，再用5个柱体积的85%乙醇洗脱，收集85%乙醇洗脱液，低温浓縮至干，即为柴胡总皂苷精制品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为92%，纯化转移率为76%，该柴胡总皂苷精制制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为56%。柴胡药材500克，加pH8的55。/。的乙醇溶液5倍量，加热回流提取2次，每次1小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为10%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，70。C浓縮至干，即为柴胡总皂苷纯化物。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为62%,纯化转移率为70%，该柴胡纯化制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为35%。实施例8:柴胡药材500克，加pHll的75%的乙醇溶液10倍量，加热回流提取3次，每次1小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为30%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的90%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7(TC浓縮至干，即为柴胡总皂苷纯化物。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为83%，纯化转移率为72%，该柴胡纯化制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为39%。实施例9:柴胡药材500克，加pHll的85%的乙醇溶液15倍量，加热回流提取4次，每次4小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为40%，混匀，离心，倾出上清液。向沉淀中加入适量的95%乙醇溶液，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，离心，取出并保留上清液，再重复溶解一次，合并两次离心上清液，7(TC浓縮至干，即为柴胡总皂苷纯化物。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为90%，纯化转移率为63%，该柴胡纯化制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为37%。实施例10:柴胡药材500克，加pH8的55%的乙醇溶液5倍量，加热回流提取2次，每次1小时。过滤，合并滤液，浓縮回收乙醇，控制柴胡提取液中含醇的比例为10%，混匀，离心，倾出上清液，反复2次，沉淀为柴胡总皂苷粗品。经紫外—可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为61%,纯化转移率为73%，该柴胡制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为16%。实施例11:柴胡药材500克，加pHll的85%的乙醇溶液15倍量，加热回流提取4次，每次4小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为40%，混匀，离心，倾出上清液，沉淀为柴胡总皂苷粗品。经紫外一可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为92%，纯化转移率为62%，该柴胡制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为18%。实施例12:柴胡药材500克，加pH10的75%的乙醇溶液10倍量，加热回流提取3次，每次2小时。过滤，合并，浓縮滤液，控制柴胡提取液中含醇的比例为25%，混匀，离心，倾出上清液，反复2次，沉淀为柴胡总皂苷粗品。经紫外—可见分光光度法测定，柴胡总皂苷的提取转移率为90%,纯化转移率为73%，该柴胡制备物干燥品中柴胡总皂苷含量为20%。权利要求1.一种柴胡总皂苷的制备方法，其特征在于柴胡总皂苷的提取转移率不低于50％。2.根据权利要求l所述，柴胡总皂苷的提取转移率优选不低于80%。3.根据权利要求l所述，柴胡总皂苷的纯化转移率优选不低于50%。4.根据权利要求3所述，柴胡总皂苷的纯化转移率优选不低于70%。5.根据权利要求l所述，柴胡总皂苷的制备方法如下I.取柴胡药材，切碎，用pH714的乙醇水溶液提取24次，每次提取14小时，提取体积为515倍量。过滤，合并，浓縮滤液得柴胡提取液。II.控制柴胡提取液中含醇的比例为10%40%，混匀，静置或离心，倾出上清液，反复数次，沉淀为柴胡总皂苷粗品。III.向柴胡总皂苷粗品中加入少量乙醇，搅拌使柴胡总皂苷充分溶解，静置或离心，取上清液；反复数次，合并上清液，浓縮，即为柴胡总皂苷纯化物。IV.将柴胡总皂苷纯化物加水稀释，上已处理好的大孔吸附树脂柱，静置吸附15个小时。先用纯化水冲洗至流出液无色，再用13个柱体积的30%60%乙醇洗脱杂质，再用35个柱体积的50%90%乙醇洗脱，收集50%卯％乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即为柴胡总皂苷精制品。6.根据权利要求5所述，按照I项、II项、III项和IV项操作步骤制备得到柴胡总皂苷精制品，其纯度不低于50%。7.根据权利要求5所述，制备纯度较低的柴胡总皂苷时，可以由权利要求5中I项和II项操作步骤制备得到柴胡总皂苷粗品，其纯度不低于15%。8.根据权利要求5所述，制备纯度较低的柴胡总皂苷时，可以由权利要求5中i项、n项和ni项操作步骤制备得到柴胡总皂苷纯化品，其纯度不低于35%。9.根据权利要求5所述，在步骤I中优选pH为811的乙醇溶液为柴胡提取液。10.根据权利要求5所述，在步骤I中使用的柴胡提取液为40%95%的乙醇溶液。11.根据权利要求10所述，柴胡提取液优选浓度为55%85%的乙醇溶液。12.根据权利要求5所述，在步骤I中使乙醇溶液pH值达到要求的碱性物质可以是氢氧化钠(钾)，氨水，碳酸钠(钾)，碳酸氢钠(钾)。13.根据权利要求5所述，在步骤IV中所用大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸14.根据权利要求13所述，所用大孔吸附树脂可以是D101，D201，D301，HPDIOO，HPD300，HPD400，HPD500,AB-8，X-5。全文摘要本发明公开了一种柴胡总皂苷的制备方法。本方法包括应用乙醇溶液提取柴胡药材，在纯化工艺过程中通过控制乙醇的含量、应用大孔吸附树脂纯化提取物，可以按要求最终制备得到适用于工业生产的不同纯度的柴胡总皂苷制备物。文档编号A61P29/00GK101229204SQ20071013934公开日2008年7月30日申请日期2007年9月6日优先权日2007年9月6日发明者锋牛,郭海波,霜韩申请人:石药集团恩必普药业有限公司