专利名称：一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法
一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法技术领域
本发明属于动物生物制品免疫佐剂制备工艺技术领域，具体涉及一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法。
背景技术：
佐剂最初是由Gaston Ramon作为与特异性抗原联合应用的一种物质而进行叙述的，而与佐剂联合应用的特异性抗原此时所产生的免疫应答比其单独应用时要高得多。一般而言，佐剂本身并不提供免疫，只有在与免疫原组成一种制剂时，它们才能够改善由疫苗诱导产生的免疫应答的广度和效力。
目前临床上应用的疫苗用免疫佐剂多为白油佐剂、氢氧化铝佐剂、类脂佐剂和蜂胶佐剂等。白油佐剂免疫原性好，但是毒副作用大；氢氧化铝胶佐剂免疫原性好，副作用小， 但不能诱导细胞免疫；类脂佐剂和蜂胶佐剂免疫原性好，可诱导体液免疫和细胞免疫，免疫持续时间长，但原材料价格昂贵。因此近年来，各国科研工作者应用不同原料和采用不同方法研制了一系列新型免疫佐剂，但均因为效果不理想或者毒力太大，没有一种得到得到广泛应用。发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法，该方法制备出缓释作用更强的纳米级动物疫苗佐剂，所得的产物粒径分布均匀、纯度高，吸附力强，无副作用，应用效果好。
本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的
(1)配制明矾溶液将固体明矾投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，调节明矾溶液浓度至 25%-28%，使明矾溶液温度保持在60 65°C之间；配制纯碱溶液通入蒸汽吹沸溶解碱液，调节浓度至10-12%，使纯碱溶液温度保持在 50 55°C之间；(2)化合将调节好温度的矾碱溶液和碱液，用内径为20mm的胶管互相吻合，以相同流速通过冲击挡板流入不锈钢容器中内，边化合边用高速剪切机对混合溶液进行高速剪切， 化合完毕后继续剪切30分钟，化合后溶液温度应在49± 1°C，pH值为6-7 ；(3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，对溶液进行熟化，驱除C02，至没有大量气泡产生为止；(4)冷却向熟化胶液中加冷水使熟化胶液温降至75°C以下，搅拌均匀后测PH；(5)分装用水泵将熟化胶液送入六个帆布袋内，待熟化胶母液控干后，对剩余熟化胶进行洗涤；(6)洗涤母液控干后即可进行洗涤，洗涤水温控制在50 55°C，每次洗涤间隔2.5 3小时，洗涤时用搅棒打碎胶盐，搅拌均匀，将水放满胶袋，洗完六次，检查硫酸盐合格后，停止洗漆;(7)收胶把洗涤好的胶控干，用胶袋收起压在磅秤上，使胶脱水，至脱水后胶量位明矾投料量的2 2. 5倍时进行收胶，胶经检验合格后即可使用。
其中上述步骤(3)中对溶液进行熟化至胶态变稀、发灰、青亮时停止通入蒸汽，吹沸后PH为7. 6 7. 8。
其中上述步骤(4)中冷却后熟化胶液PH较熟化时胶液PH低或不变。
本发明所述技术方案的有益效果为本发明在常规氢氧化铝胶佐剂的基础上，设计了一种缓释作用更强的纳米级动物疫苗佐剂制备方法，制备的氢氧化铝纳米胶佐剂与普通氢氧化铝胶佐剂配置的传染性灭活疫苗相比，提供吸附力更强，抗体水平结果显示纳米级氢氧化铝胶佐剂组明显好于普通氢氧化铝胶组，高出2 8个抗体滴度；用缓释作用更缓慢的纳米级佐剂生产疫苗，能提高灭活疫苗的质量，增强疫苗的免疫效力，延长兔疫持续期，较普通铝胶组长60天左右；另外用本制备方法所得的产物粒径分布均匀、纯度高，粒径主要集中于50 IOOnm左右，在免疫佐剂方面有较好的应用前景。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合结合传染性鼻炎灭活疫苗实例对本发明作进一步说明。
一、疫苗制备1、制备抗原(O菌液培养将生产种子接种于半合成培养基封好瓶口并摇勻，置37°c温室中静止培养18小时左右，期间每个6 8小时摇晃一次。当眼观菌液呈现混浊的淡黄色时即达到生长闻峰，准备收犾，此时含囷量可以达到10亿/ml左右。
(2)制苗菌液的浓缩与灭活用浓缩机将纯检合格的菌液进行浓缩，然后再用PH 为7. 2的生理盐水制成悬浮液，使40 50亿/ml菌体，通过比浊法测定最终的含菌量。再按体积比加入2%。的甲醛溶液进行灭活，混匀后于37°C灭菌I天，于2 8°C下放置I天，经检验无菌生长作为制苗抗原。
2、制备氢氧化铝胶 (1)配制明矾溶液将固体明矾投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，调节明矾溶液浓度至 25%-28%，使明矾溶液温度保持在60 65°C之间；配制纯碱溶液通入蒸汽吹沸溶解碱液，调节浓度至10-12%，使纯碱溶液温度保持在 50 55°C之间；(2)化合将调节好温度的矾碱溶液和碱液，用内径为20mm的胶管互相吻合，以相同流速通过冲击挡板流入不锈钢容器中内，边化合边用高速剪切机对混合溶液进行高速剪切， 化合完毕后继续剪切30分钟，化合后溶液温度应在49± 1°C，pH值为6-7 ；(3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，对溶液进行熟化，驱除C02，至没有大量气泡产生、溶液进行熟化至胶态变稀、发灰、青亮时停止通入蒸汽，吹沸后PH为7. 6 7. 8 ;(4)冷却向熟化胶液中加冷水使熟化胶液温降至75°C以下，搅拌均匀后测PH；(5)分装用水泵将熟化胶液送入六个帆布袋内，待熟化胶母液控干后，对剩余熟化胶进行洗涤；(6)洗涤母液控干后即可进行洗涤，洗涤水温控制在50 55°C，每次洗涤间隔2.5 3小时，洗涤时用搅棒打碎胶盐，搅拌均匀，将水放满胶袋，洗完六次，检查硫酸盐合格后，停止洗漆;(7)收胶把洗涤好的胶控干，用胶袋收起压在磅秤上，使胶脱水，至脱水后胶量位明矾投料量的2 2. 5倍时进行收胶，胶经检验合格后即可使用。
其中上述步骤(4)中冷却后熟化胶液PH较熟化时胶液PH低或不变。
3、疫苗配置佐剂准备按照成品疫苗最终含纳米级氢氧化铝佐剂10%的量取纳米级氢氧化铝佐剂，用生理盐水溶解纳米级氢氧化铝佐剂，并进行高压灭菌。
4、乳化按照最终疫苗中抗原含量为6亿/ml，纳米级氢氧化铝胶佐剂含量为10%， 将抗原按比例加入准备好的纳米级氢氧化铝胶佐剂溶液中，按照3000rpm，乳化30分钟。乳化完毕后将疫苗降温至室温，取样检测。
二、佐剂及疫苗检测将新型复合佐剂依照国家兽药标准，验证其结果1、佐剂安全性检验用2 3月龄的SPF鸡8只，每只皮下注射本纳米级氢氧化铝佐剂疫苗1ml，连续观察 14日，均应无异常反应。
检验结果连续观察14日后8只SPF鸡均未出现异常反应。
2、佐剂配置疫苗的效力检验选用传染性鼻炎复纳米级氢氧化铝佐剂灭活疫苗，用2 3月龄的SPF鸡为试验动物， 8只/组，设置A、B组，A组每只皮下注射纳 米级氢氧化铝佐剂疫苗O. 5ml, B组每只皮下注射用普通氢氧化铝佐剂疫苗O. 5ml，C组设为对照组，8只/组，不做注射。
I个月后向每只条件相同的对照鸡8只/组及实验鸡的眶下窦内注射C-Hpg-8攻毒菌液0.2ml (50 100万活菌)，连续观察14日。
合格条件若对照鸡全部发病，免疫鸡至少保护6只，或对照鸡3只发病，免疫鸡至少保护7只为合格。
检验结果C组全发病，A组全健活，B组5只发病，3只健活。
权利要求
1.一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法，其特征在于其制备方法及步骤如下 (1)配制明矾溶液将固体明矾投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，调节明矾溶液浓度至25%-28%，使明矾溶液温度保持在60 65°C之间； 配制纯碱溶液通入蒸汽吹沸溶解碱液，调节浓度至10-12%，使纯碱溶液温度保持在50 55°C之间； (2)化合将调节好温度的矾碱溶液和碱液，用内径为20mm的胶管互相吻合，以相同流速通过冲击挡板流入不锈钢容器中内，边化合边用高速剪切机对混合溶液进行高速剪切，化合完毕后继续剪切30分钟，化合后溶液温度保持在49 土 1°C，pH值保持6-7 ； (3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，对溶液进行熟化，驱除CO2,至没有大量气泡产生为止； (4)冷却向熟化胶液中加冷水使熟化胶液温降至75°C以下，搅拌均匀后测PH； (5)分装用水泵将熟化胶液送入六个帆布袋内，待熟化胶母液控干后，对剩余熟化胶进行洗涤； (6)洗涤母液控干后即可进行洗涤，洗涤水温控制在50 55°C，每次洗涤间隔2.5 3小时，洗涤时用搅棒打碎胶盐，搅拌均匀，将水放满胶袋，洗完六次，检查硫酸盐合格后，停止洗漆; (7)收胶把洗涤好的胶控干，用胶袋收起压在磅秤上，使胶脱水，至脱水后胶量位明矾投料量的2 2. 5倍时进行收胶，胶经检验合格后即可使用。
2.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中对溶液进行熟化至胶态变稀、发灰、青亮时停止通入蒸汽，吹沸后PH为7. 6 7. 8。
3.根据权利要求1所述的一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法，其特征在于步骤(4)冷却后熟化胶液PH较熟化时胶液PH低或不变。
全文摘要
本发明涉及一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法，属于动物生物制品免疫佐剂制备工艺技术领域。该制备方法是以铝盐溶液和纯碱溶液为原料，混合过程中添加一定量的稳定剂，通过高剪切乳化机剪切，初步得到纳米级氢氧化铝溶液，经沉淀、洗涤和再沉淀等操作，最后制得纳米级氢氧化铝胶，将制备的纳米氢氧化铝配制成溶液与灭菌活的菌液经复合即可获取灭活疫苗。本发明方法制备的纳米级氢氧化铝佐剂粒径分布均匀、纯度高，吸附力强，无副作用，在免疫佐剂制备方面有较好的应用前景。
文档编号A61K39/39GK102988982SQ20121054221
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者郎景民, 马景霞, 张静 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司