专利名称：以黄皮属植物中的咔唑生物碱为抗肿瘤活性成分的药物组合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及以黄皮属植物中咔唑生物碱为活性成分的药物组合物，其制备方法，其作为肿瘤细胞生长抑制剂，其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
当今世界，肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，其死亡率仅次于心血管疾病而位居第二，成为当今人类医学界一大难题。据世界卫生组织最近发表的报告，在28个工业化国家内，男性癌症死亡率上升55%，女性上升40%，其中胃癌居首位，其他依次为食道癌、肝癌、子宫颈癌和肠癌等。随着分子肿瘤学的发展，人们发现细胞内促增殖系统成分的过度表达与抑增殖系统成分的缺失均可引起细胞增殖失控而导致癌变。随着生命科学研究的飞速 进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。目前抗肿瘤药物的来源主要包括植物、动物、微生物、矿物和海洋生物的代谢产物及其人工合成和人工修饰等产物。根据其作用机理的不同，抗肿瘤药物又可分为以下几类
(I)细胞毒类抗肿瘤药；(2)以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物；(3)肿瘤新生血管生成抑制药物；(4)肿瘤细胞诱导分化剂；(5)细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂等。植物来源的天然产物在当今抗肿瘤药物市场上扮演了重要角色，由于植物来源抗肿瘤药物的作用机制独特、抗癌疗效显著，如今在临床上已经逐步占据了主导地位，达到40%的市场份额，但其资源来源和成本问题仍然困扰着这些药物的广泛推广和使用，如临床使用的植物来源的生物碱类型的抗肿瘤药物紫杉醇化3(1；^3161)、喜树碱(0311^101116(3；[11)和长春碱(vinblastine)等均面临这些问题。目前已经报道的应用于抗肿瘤药物研究的天然产物包括多种结构类型，除上述提到的具有代表性的生物碱类化合物外，还有萜类、木脂素类和黄酮类等，但是尚未见到已经上市的咔唑生物碱类抗肿瘤药。咔唑类生物碱及其衍生物是一类重要的含氮芳杂环化合物，分子内含有较大的共轭体系和强的分子内电子转移，这种特殊的刚性稠环结构使咔唑生物碱类化合物表现出许多独特的生物活性，例如细胞毒、抗微生物、抗氧化、抗结核、抗艾滋、乙酰胆碱酯酶抑制、拓扑异构酶抑制等。目前已有一些合成出来的咔唑生物碱类药物进入临床试验，例如Cephalon公司的抗肿瘤新药CEP-9722已经进入临床二期，该药是一个合成的咔唑生物碱，以多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2为祀标，该药经临床观察无明显的毒副作用；Cephalon公司的另一个咔唑类的抗肿瘤新药CEP-11981进入临床一期，该药以Tek酪氨酸激酶受体和血管内皮生长因子受体作为靶标。另外还有一些合成的咔唑生物碱类化合物体内外都表现出了良好的研发前景，例如中国医学科学院的Hu LX合成的咔唑生物碱类化合物9-ethyl-N-(3，4，5-trimethoxyphenyl) -carbazole-3-sulfonamide 体外对肿瘤细胞株 MCF-7 的细胞毒活性IC50达到89nM，而体内试验给药100mg/kg，肿瘤抑制率达到75%，而LD5tl为500mg/kg。参见Hu LXj et al， Synthesis and structure-activity relationships of carbazolesulfonamides as a novel class of antimitotic agents against solid tumors,J. Med. Chem. , 2006，49，6273-6282。C印halon公司的另一个咔唑生物碱类化合物CEP-5214对肿瘤细胞株VEGF-R2的体外IC5。达到4nM，体内给药23. 8mg/kg，肿瘤抑制率达到70%，没有观察到明显的毒副作用。参见Gingrich DEj et al, A new class ofpotent vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors:Structure-activity relationships for a series of 9-alkoxymethyl-12-(3-hydroxypropyl)indeno[2，l_a]pyrrolo[3，4_c]carbazole-5-ones and the identification ofCEP-5214 and its dimethylglycine ester prodrug clinical candidate CEP-7055， J.Med. Chem.，2003，46，5375-5388。另外也有一些来自天然的咔唑生物碱类化合物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的先导物，但截至目前仅限于文献报道或专利申请，尚未进入临床试验阶段，例如YH Taufiq-Yap等从小叶臭黄皮中得到的咔唑生物碱类化合物 clausine-TY对肿瘤细胞株 CEM-SS 的 IC5tl 为 8. 2 ii g/mL。参见Tauf iq-Yap YH, etal, A new cytotoxic carbazole alkaloid from Clausena excavate, Nat. Prod. Res.,2007, 21, 810-813。WManeerat等人从黄皮根部分离得到咔唑生物喊mafaicheenamineE 对肿瘤细胞株 MCF-7 的 IC5tl 达到 3.1 u g/mL。参见Maneerat W，et al. Carbazolealkaloids and coumarins from Clausena lansium roots, Phytochem. Lett. , 2012,5, 26-28。T Thongthoom等从Clausena harmandiana根部分离得到的咔唑生物喊类化合物 7-methoxymukonal 对肿瘤细胞株 MCF-7 和 KB 的 IC50 分别达到 2. 21 u g/mL 和1. 74 u g/mL0参见Thongthoom T, et al. Biological activity of chemical constituents fromClausena harmandiana, Arch. Pharmacal Res. , 2010, 33, 675-680。咔唑生物喊类化合物在植物界分布广泛，尤其以芸香科黄皮属植物中最为丰富。黄皮属植物在我国南方分布广，容易生长栽培，资源丰富，从黄皮属植物中分离到的咔唑生物碱类化合物含量大、种类多、分离提取容易、抗肿瘤活性强，对咔唑生物碱进行抗肿瘤药物方面的研究有利于黄皮属植物资源的综合开发利用。本专利中申请保护的四个咔唑生物碱类化合物具有较强的细胞毒活性，目前尚未发现有文献报道。黄皮属植物中的咔唑生物碱类化合物的提取分离有一定的特点，该类天然产物主要分布于植物的根和茎，含色素，化合物极性大多数中等偏小，含量不同，另外由于该类化合物结构中含有较大的共轭体系，因此紫外吸收比较强，在分离纯化时可充分利用该特点。现有技术中，从黄皮属植物中分离咔唑生物碱类化合物已公开发表如下方法(I) 20世纪80年代，黄皮属植物Clausena harmandiana的根莖经正己烧回流提取,用TLC检测,经反复娃胶柱层析分离得到咔唑生物碱heptaphylline。参见Wangboonskul JD, et al, FiveCoumarins and a carbazole alkaloid from the root bark of Clausena harmandiana,J. Nat. Prod. , 1984，47，1058-1059。其缺点是用正己烷提取样品不充分，只利用TLC检测和硅胶柱层析进行分离得不到微量成分。(2) 20世纪90年代，黄皮属植物Clausenaanisata的茎由石油醚和乙醇分别提取，然后用氯仿和乙酸乙酯分别萃取，再经硅胶柱层析，分别以石油醚，石油醚/ 二氯甲烷1: 1，氯仿，氯仿/甲醇1:50为洗脱剂反复硅胶柱层析得到咔唑生物喊 clausenol 和 clausenine。参见Chakraborty A, et al, Clausenoland clausenine-Two carbazole alkaloids from Clausena anisata, Phytochemistry,1995，40，295-298。其缺点是只用正相硅胶，没有应用反相硅胶，容易吸附微量样品。
(3)近年来,黄皮属植物Clausena anisata的莖经干燥粉碎后分别由丙酮和甲醇进行回流提取，得到的浸膏经反复硅胶柱层析及TLC制备薄层板进行分离纯化得到咔唑生物IjlEfuranoclausamine A 和 furanoclausamine B。参见Ito C，et al. gamma-Lactonecarbazoles from Clausena anisata, J. Nat. Prod. , 2009, 72, 1202-1204。该方法的缺点是薄层制备板只适用于微量成分，且容易吸附样品。以上几种方法侧重于使用正相硅胶，反相硅胶几乎没有使用，容易损失样品；单一的TLC检测方法灵敏度不够，微量成分不容易检测，没有充分利用咔唑生物碱紫外吸收强的特点。

发明内容
针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类咔唑生物碱；提供制备该类化合物的方法，该提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产；本发明的目的还在于提供以咔唑生物碱类化合物为有效成分的药物组合物；该类化合物作为肿瘤细胞生长抑制剂，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案药物组合物，其中含有治疗有效量的如下结构式所示的黄皮属植物中的咔唑生物M clausine D (I)、6_methoxyheptaphylline (2)、mafaicheenamine C (3)和 claulansine
G (4)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。
权利要求
1.药物组合物，其中含有治疗有效量的如下结构式所示的黄皮属植物中的咔唑生物碱 clausine D (I)、6_methoxyheptaphylline (2)、mafaicheenamine C (3)、claulansine G(4)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体
2.制备权利要求1中所述咔唑生物碱的方法，取黄皮属植物的根茎，经干燥、粉碎后， 用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取；乙酸乙酯部分反复用硅胶、S^hadex LH-20、MC1、RP-18和HPLC等各种层析柱分离纯化，再结合 TLC检测方法即得到咔唑生物碱类化合物。
3.制备权利要求1中所述咔唑生物喊clausineD (I )、6_methoxyheptaphylline (2)、 mafaicheenamine C (3)和claulansine G (4)的方法，取黄皮的根莖，经干燥、粉碎后, 用甲醇回流提取3次，时间为每次4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0，95:5, 90:10的氯仿 /甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合TLC检测方法，根据咔唑生物碱极性的不同合并为七个组分Fr.1 - Fr. 7 ;以下的每一步骤都须结合TLC检测方法来进行分离纯化，Fr. 2用60目的聚酰胺拌样，以甲醇和水做流动相经中压MCI柱层析10%-100%梯度洗脱除去色素，然后娃胶柱层析，用9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离得到四个亚组分Fr. 2-1 -Fr. 2-4 ；Fr. 2-2再经硅胶柱层析以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离得到四个亚组分Fr. 2-2-1 - Fr. 2-2-4 ；Fr. 2-2-1经两次硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚 /乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱除去一部分杂质，得到的样品浓缩后再经Waters OBD制备柱60%乙腈/水等度洗脱纯化，纯化出来的样品浓缩后再以丙酮为溶剂重结晶得到化合物 6-methoxyheptaphy 11 ine (2) ；Fr. 6经娃胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/丙酮为洗脱剂梯度洗脱初步除去色素，然后再经中压MCI柱层析，以10%-60%甲醇/水为流动相梯度洗脱进一步除去色素，然后再用中压RP-18柱层析，以5%-70%甲醇/水为流动相梯度洗脱得到四个亚组分Fr. 6-1 - Fr. 6-4 ；Fr. 6-1经硅胶柱层析，以20:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱进一步分离得到三个亚组分 Fr. 6-1-1 - Fr. 6-1-3 ;Fr. 6-1-1 经 Sephadex LH-20 层析，1:1，的氯仿/甲醇为洗脱剂等度洗脱得到的样品浓缩后再经硅胶柱层析，以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物claulansine G (4) ；Fr. 6-1-2经娃胶柱层析，以20:1 氯仿/乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱分离得到含有生物碱的样品，再经Waters OBD制备柱， 以48%的乙腈/水(含O. 6%的三氟乙酸)为洗脱剂等度洗脱得到化合物mafaicheenamine C (3)；Fr. 6-3经硅胶柱层析，以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品，该样品以丙酮为溶剂重结晶得到化合物clausine D (I)。
4.以权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐为有效成分的肿瘤细胞生长抑制剂。
5.抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。
6.权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备肿瘤细胞生长抑制剂中的应用。
7.权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗抗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
8.权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备胃癌、宫颈癌、肺癌细胞生长抑制剂中的应用。
9.权利要求1中所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗胃癌、宫颈癌、 肺癌的药物中的应用。
全文摘要
以咔唑生物碱clausine D(1)、6-methoxyheptaphylline(2)、mafaicheenamine C(3)或claulansine G(4)为活性成分的药物组合物。它们的制备方法，它们在制备肿瘤细胞生长抑制剂中的应用，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
文档编号A61P11/00GK102988356SQ20131000548
公开日2013年3月27日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者谭宁华, 宋卫武, 曾广智, 彭文文 申请人:中国科学院昆明植物研究所