专利名称：尖吻蝮蛇凝血酶及其分离方法
技术领域：
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体而言，本发明涉及尖吻蝮蛇凝血酶的分离方法以及其分离的尖吻蝮蛇凝血酶。
背景技术：
尖吻蝮蛇的凝血酶是我国自主开发的一种蛇毒类凝血酶，通常由A、B两个亚基构成，能够激活体内的凝血因子而用于止血，从而可以在临床上代替进口药物“立止血”(Reptilase)0目前国内已经有一系列尖吻蝮蛇凝血酶及其分离提取方法被报道。例如，中国专利99116406公开了从尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，其依次用葡聚糖凝胶G-75柱、DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱、CM-葡聚糖凝胶C-50柱以及SuperdeX-75PG柱纯化，最终获得 的凝血酶的等电点为4. 5-5. O。中国专利01108029公开了从尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，其依次用DEAE层析柱、Mono Q层析柱以及RESOURCE RPC柱纯化，最终获得的凝血酶的分子量为30298Da，另外确定了部分氨基酸序列。中国专利01115567公开了从尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，经过两次阴离子交换层析和脱盐步骤得到，并确定了其全部氨基酸序列。中国专利01115570公开了一种从尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，经过两次阴离子交换层析和脱盐步骤得到，并确定了其全部氨基酸序列。中国专利03140154公开了从尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，不清楚其具体纯化过程，最终获得的凝血酶的分子量为29076Da，另外仅仅确定了部分氨基酸序列。中国专利01115570公开了一种从尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，依次经过两次DEAE-Sepharose FF层析和S印hadex G_25脱盐步骤得到，最终获得的凝血酶的分子量为29. 3^29. 5kDa，并确定了其部分氨基酸序列。中国专利200910214396公开了一种从尖吻蝮蛇中提取的凝血酶，然而该凝血酶
是单链凝血酶。本发明人经过长期艰苦研究，摸索了一种新的从尖吻蝮蛇中提取凝血酶的方法，能够高效、低成本地提取高纯度的凝血酶，更令人意外地发现了新的尖吻蝮蛇凝血酶，其凝血酶活性较高。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的提纯尖吻蝮蛇凝血酶的方法以及其所提纯得到的新的凝血酶。具体而言，在第一方面，本发明提供了制备尖吻蝮蛇凝血酶的方法，其包括
(I)将尖吻蝮蛇蛇毒溶液上样于分子筛凝胶层析柱，用PH6. 5^7. 8的缓冲液洗脱，收集具有最强凝血酶活性的峰的洗脱液；(2)将步骤(I)获得的洗脱液上样于阴离子交换层析柱，以含0-0.IM NaCl的pH
7.2-8. 2的缓冲液洗脱，收集具有最强凝血酶活性的峰的洗脱液；和
(3)将步骤(2)获得的洗脱液上样于分子筛凝胶层析柱，用水洗脱，收集具有最大峰面积的峰的洗脱液，任选将其进一步冷冻干燥。由于阴离子交换层析柱更为昂贵，而本发明的方法的步骤中仅有一个步骤使用了阴离子交换层析柱，而且不包含透析等耗时的步骤，因此能够高效、低成本地提取尖吻蝮蛇凝血酶，而且提取的纯度达到药用纯度标准。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)获得的洗脱液(或冷冻干燥的冻干粉)中的尖吻蝮蛇凝血酶的纯度大于95%，优选大于96，％，更优选大于97%，如大于97. 5%。尽管采用的制备步骤组合完全不同于现有技术，然而每一步骤中所使用的层析柱以及试剂可以采用本领域技术人员能够获得的技术，包括市售的产品。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(I)中，分子筛凝胶层析柱是S印hadex G-75层析柱。也优选步骤(I) 中，缓冲液的PH值是7. (Γ7. 5，优选是7. 2。还优选步骤(I)中，缓冲液是PBS缓冲液。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(2)中，阴离子交换层析柱是DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱。也优选步骤(2)中，缓冲液的pH值是7. 5 8. O,优选是7. 8。还优选步骤(2)中，缓冲液是PBS缓冲液。另外优选在本发明第一方面的方法中，步骤(3)中，分子筛凝胶层析柱是SephadexG-75层析柱。尽管步骤(I)和(3)可以使用相同的层析柱，然而用于洗脱的试剂不同，本发明人研究发现，对于特定的洗脱液体系，步骤(I)中慢速洗脱会有更高的分辨率，而步骤(3)则洗脱速度没有显著的影响。因此，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(I)中洗脱的流速慢于步骤(3)中洗脱的流速,例如,步骤(I)中洗脱的流速为l 3mL/min,优选为2mL/min ；而步骤(3)中洗脱的流速为4 8mL/min,优选为6mL/min。本发明人还发现了一种新的尖吻蝮蛇凝血酶，其甚至在低剂量下比市售的“立止血”(R印tilase)的止血功效还显著。优选在本发明第一方面的方法中，尖吻蝮蛇凝血酶包含氨基酸序列分别如SEQ ID No :1和2所示的两个亚基，更优选其由两个亚基组成，这两个亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID No :1和2所示。在第二方面，本发明提供了尖吻蝮蛇凝血酶，其包含两个亚基，这两个亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID No :1和2所示。该酶可以是通过本发明第一方面的方法制备的，也可以是通过DNA重组技术制备的。优选本发明第二个方面的尖吻蝮蛇凝血酶由两个亚基组成，这两个亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID No :1和2所示。在第三方面，本发明提供了编码本发明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶的基因。该基因可以是DNA，也可以是RNA。根据DNA重组技术，根据已知的氨基酸序列可以容易地设计出基因，导入合适的宿主细胞表达，即可获得该尖吻蝮蛇凝血酶。在第四方面，本发明提供了包含本发明第三方面所述的基因的载体，优选是表达载体，尤其是动物细胞表达载体，最优选是蛇细胞表达载体。当前已经有许多载体商品化了，可通过转化、转染或者其他基因重组手段可以将本发明第三方面所述的基因导入载体中。在
在第五方面，本发明提供了转化或转染了本发明第四方面所述的载体的宿主细胞，优选是动物细胞，最优选是蛇细胞。该宿主细胞可用于表达本发明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶。在第六方面，本发明提供了用于止血的药物组合物，其包括本发明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶和药学上可接受的载体。在本文中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释设形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂和乳液剂、消毒的住射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。在第七方面，本发明提供了本发明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶在制备用于止血的药物中的应用。本发明的药物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优 选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，本发明的药物的剂量，以本发明第二方面所述的尖吻蝮蛇凝血酶计，每kg成人(一般为60kg)体重可以是lng-lg,优选是IOng-IOmg,更优选是IOOng-IO μ g,例如是200ng_5 μ g。本发明具有以下有益效果本发明的制备方法方便有效，成本较低而且耗时较短，提取的尖吻蝮蛇凝血酶纯度达到甚至超过药用要求；本发明的尖吻蝮蛇凝血酶活性高，在μg级水平即可产生显著的止血作用。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。实施例I尖吻蝮蛇凝血酶的提纯
取IOg尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉(可购自南宁市绿化古潭养蛇场)，溶解于50mL IOmM PBS缓冲液(pH7. 2)中，3500rpm离心IOmin后上样于Sephadex G-75层析柱(可购自Pharmacia公司)，用IOmM PBS缓冲液(pH7. 2)以2mL/min的流速缓慢洗脱，依次分别收集各个洗脱峰并测定凝血酶活性，发现洗脱的第5个峰具有最强的活性，因此保留该峰的洗脱液，即为提取液I。将提取液I上样于DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(可购自GE Healthcare公司)，以含0-0. IM NaCl的IOmM PBS缓冲液(ρΗ7· 8)进行梯度洗脱，依次分别收集各NaCl浓度的洗脱峰并测定凝血酶活性，发现O. 08Μ NaCl洗脱的峰具有最强的活性，因此保留该峰的洗脱液，即为提取液2。将提取液2上样于Sephadex G-75层析柱(可购自Pharmacia公司),用去离子水以6mL/min的流速洗脱，收集其中最大的洗脱峰，其具有凝血酶活性，即为本发明的尖吻蝮蛇凝血酶，可进一步了冷冻干燥。实施例2新的尖吻蝮蛇凝血酶的鉴定
将实施例I获得的尖吻蝮蛇凝血酶分别进行1) SDS-PAGE检测，发现其由分子量分别为约15kDa和14kDa，面积归一化法测量的纯度为97. 8%，达到药用纯度标准；2)进行飞行时间质谱测定，发现分子量为29109Da，表明这可能是一种新的尖吻蝮蛇凝血酶；3)对凝血酶进行糖测定，发现该酶含有2. 17% (W/W)的中性己糖，表明这是在一种糖蛋白，其中非糖蛋白的分子量约为28. 5kDa，预计发现了新的蛋白质一级结构。我们通过商业途径委托上海生工生物技术有限公司对实施例I获得的尖吻蝮蛇 凝血酶的冻干粉进行氨基酸序列分析，发现两个亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID No:l和2所示，经检索，证实了是新的尖吻蝮蛇凝血酶。实施例3新的尖吻蝮蛇凝血酶的活性测定
取实施例I获得的尖吻蝮蛇凝血酶的冻干粉，以市售的“立止血”(Iteptilase)为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，对小鼠分别静脉给药后30min，在距离小鼠尾部尖端O. 5cm处剪断，观测各药物对小鼠减尾出血时间的降低作用。其结果如表I所示，本发明的尖吻蝮蛇凝血酶和“立止血”均对阴性对照有显著的抑制出血作用，可以有效降低减尾出血时间，本发明的尖吻蝮蛇凝血酶的作用呈现出一定的量效相关性，尤其有效的是，低剂量的本发明的尖吻蝮蛇凝血酶的即可具有与市售产品相当的止血作用。表I各药物对小鼠减尾出血时间的降低作用
分·I给药剂量出■时间(.s>
本发明低剂量組 I
本发明申剂貴IfiWfirkgW.3±U+"
__13 .61.*
_性对靜.續I-JO. 5±2 6
阳性对 MIV5.V:1;214 2+19,l
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**表示相对于阴性对照组，P〈0.01。
权利要求
1.制备尖吻蝮蛇凝血酶的方法，其包括 (1)将尖吻蝮蛇蛇毒溶液上样于分子筛凝胶层析柱，用PH6.5^7. 8的缓冲液洗脱，收集具有最强凝血酶活性的峰的洗脱液；(2)将步骤(I)获得的洗脱液上样于阴离子交换层析柱，以含0-0.IM NaCl的pH7.2-8. 2的缓冲液洗脱，收集具有最强凝血酶活性的峰的洗脱液；和 (3)将步骤(2)获得的洗脱液上样于分子筛凝胶层析柱，用水洗脱，收集具有最大峰面积的峰的洗脱液，任选将其进一步冷冻干燥。
2.权利要求I所述的方法，其中步骤(I)中，分子筛凝胶层析柱是SephadexG_75层析柱；缓冲液的PH值是7. (Γ7. 5，优选是7. 2 ;和/或，缓冲液是PBS缓冲液。
3.权利要求I所述的方法，其中步骤(2)中，阴离子交换层析柱是DEAE-SepharoseFast Flow层析柱；缓冲液的pH值是7. 5 8. 0，优选是7. 8 ;和/或，缓冲液是PBS缓冲液。
4.权利要求I所述的方法，其中步骤(3)中，分子筛凝胶层析柱是SephadexG_75层析柱。
5.权利要求I所述的方法，其中步骤(I)中洗脱的流速慢于步骤(3)中洗脱的流速。
6.权利要求I所述的方法,其中尖吻蝮蛇凝血酶的纯度大于95%，优选大于96，％，更优选大于97%，如大于97. 5%。
7.权利要求I所述的方法，其中尖吻蝮蛇凝血酶包含氨基酸序列分别如SEQID No 1和2所不的两个亚基。
8.尖吻蝮蛇凝血酶，其包含氨基酸序列分别如SEQID No :1和2所示的两个亚基，优选其是由权利要求Γ7所述的方法制备的。
9.用于止血的药物组合物，其包括权利要求8所述的尖吻蝮蛇凝血酶和药学上可接受的载体。
10.权利要求8所述的尖吻蝮蛇凝血酶在制备用于止血的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法以及其分离的尖吻蝮蛇凝血酶。所述制备方法依次包括分子筛凝胶层析柱、阴离子交换层析柱和分子筛凝胶层析柱纯化。所得的尖吻蝮蛇凝血酶纯度高，止血效果好。另外，本发明还提供了该尖吻蝮蛇凝血酶的药物组合物及止血用途等。
文档编号A61P7/04GK102757948SQ201210167568
公开日2012年10月31日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者徐丹 申请人:广东瑞昇药业有限公司