专利名称：具有固定的血小板结合剂的血管闭塞固相试剂的制作方法
(B)对相关申请的交叉参考不适用(C)联邦赞助不适用(D)发明背景(D1)发明领域本发明涉及通过使用血小板激活作为起始事件产生血管闭塞来产生治疗益处的组合物和方法。本发明的组合物和方法涉及将固相血小板-结合剂递送到靶位点，使血小板结合和激活从而形成局部血栓。通过局部血栓闭塞靶组织的脉管系统导致必需的氧和营养的丧失，再导致组织退化和最终组织死亡。
(D2)相关技术描述血小板在体内起在血管损伤事件中限制失血的作用。通常，血小板与血液的其它细胞组分一起在身体中循环，浸浴在各种血浆蛋白质的混合物中，所述血浆蛋白质中许多在凝固过程中起关键作用。在血管内皮下膜暴露以后，发生一系列复杂事件来限制血液从损伤的脉管丧失。与暴露的内皮下膜的组分接触的循环的血小板1)结合和粘附，2)扩散越过暴露的表面，3)激活，如由颗粒组分的释放证明，4)聚集并从血流中补充其它循环的血小板，和5)形成有效的栓塞，凝块，和/或血栓，其堵塞来自脉管的血流。
与凝固级联形成对比，凝固级联为一个部分由血纤蛋白原至血纤蛋白转化所定义的过程，血小板在损伤区域周围聚结并由与血小板表面特异受体结合的桥连分子结合在一起。血小板和内皮下膜之间的起始桥连依赖于血小板表面的糖蛋白Ib(GPIb)受体和内皮下膜中的von Willebrand因子(VWF)(即固定的VWF)之间的相互作用。该相互作用本身是独特的，因为在血液中循环的正常血小板经常与可溶性VWF接触，但不被激活，它们也不与可溶性VWF结合。体外实验已经证实将可溶性VWF固定到表面促进血小板的结合和激活。经激活血小板后，另一个受体，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)被改变，使其能够结合几种血浆蛋白质，由此促进血小板/血小板结合。除血纤蛋白原以外，可溶性VWF与活化的GPIIb/IIIa受体结合，再通过GPIb和GPIIb/IIIa变得被固定和能够结合其它血小板。
在不合适的时间活动过强的血小板可以诱导血栓形成，导致对各种器官和组织的血液供给减少。主要的实例是由血液流经供应心脏的狭窄(窄)脉管诱导的血栓形成。向心肌血流的减少导致梗塞和最终心脏病发作(心脏细胞死亡)。当栓子或血栓堵塞供给脑的血管时发生脑局部缺血(短暂性缺血发作(TIA)；中风)。
存在由血小板激活导致的其它病变，所述血小板激活是不适当的抗体介导的过程的结果。肝素诱导的血小板减少症(HIT)特征是血小板数量的显著减少和在预先存在的病理位点形成血栓。接受未分次的、作为促进血流的抗凝剂的肝素的所有患者中的1％-5％产生与肝素结合的抗体，所述肝素与血小板颗粒蛋白复合。抗体与血小板表面上的肝素/蛋白质复合体的结合诱导血小板迅速激活和局部血栓形成。这又导致被影响区域的梗塞。
血栓是充分描述的癌的后果。关于高可凝固状态是否是癌的预示存在争论。已经进行许多研究，证明与大部分瘤形成或肿瘤一起的促血栓趋势。已经提示血栓是外显恶性病患者最频繁的并发症。
开发成功的抗肿瘤剂的关键是设计将选择性杀死肿瘤细胞，而对正常组织施加相对很小的，若有的话，副作用的制剂的能力。该目标已经是难以捉摸的因为在肿瘤和正常组织之间存在很少的定性差异。因此，这些年来许多研究已经集中在鉴定可以作为化学疗法和诊断的免疫目标的肿瘤特异“标记抗原”。已经鉴定许多肿瘤特异或准肿瘤特异(肿瘤相关)的标记，其是可以被特异性抗体识别的肿瘤细胞抗原。
不幸地，通常情形是肿瘤特异抗体本身和自动将不发挥足以使它们在癌症治疗中有效的抗肿瘤作用。与它们在淋巴瘤中的功效形成对比，免疫毒素已经证明在实体瘤如癌的治疗中相对无效。关于这的主要原因是实体瘤对于抗体大小的分子通常是不渗透的每克肿瘤小于注射剂量的0.001％的比吸收值在人的研究中是常见的。另外，由于几个原因进入肿瘤块的抗体分布不均匀。首先，肿瘤细胞和纤维状肿瘤基质的紧密堆积产生对于大分子递送难以克服的物理屏障，与淋巴引流的缺少结合在肿瘤中心产生升高的间隙压力，其减少外渗和流体对流。第二，大部分肿瘤中的血管分布是无组织的和不均匀的。结果一些肿瘤细胞与毛细管大距离分开以致外渗的抗体必须在大体积范围内扩散以便到达和与遥远的肿瘤细胞结合。第三，所有进入肿瘤的抗体可能变得被最先遇到的肿瘤细胞吸收在血管周围区域，没留下任何一个到达在更远位点的肿瘤细胞。
使用抗体克服靶肿瘤的缺点的一种方法是将诱导血栓的试剂靶向肿瘤的脉管系统而不是肿瘤。
本发明人提出该方法将提供几个优于直接靶向肿瘤细胞的优势。首先，靶细胞能够直接接近脉管施用的治疗剂，允许高百分率的注射剂量的迅速局部化。第二，因为每个毛细管为在它周围肿瘤带中的数千细胞提供氧和营养，即使对肿瘤脉管系统有限的损伤也产生大量肿瘤细胞死亡。
本发明还涉及治疗异常组织生长，异常出血(在外科手术期间或之后，产后)，异位妊娠，胎盘前置(placenta previa)，胎盘粘连(placenta accrteta)和子宫肌瘤的组合物和方法。
在某些临床情形下，理想的是通过闭塞它相关的脉管系统抑制向组织的血流。实例包括出血性中风，在隐静脉旁路移植外科手术中隐静脉侧支的存在，主动脉瘤的治疗，血管畸形的矫正，和实体瘤的治疗。
已经使用包括栓塞治疗(embolotherapy)的多种技术和材料进行血管闭塞。栓塞治疗的实例包括由多种材料组成的颗粒，由胶原组成的物理栓塞(Conston等，US 5,456,693)和线圈(coil)(Mariant，US 5,639,277)的应用，所述材料包括聚乙烯醇(Boschetti，PCT WO0023054)，丙烯酰胺(Boschetti等，US 5,635,215；Boschetti等，US 5,648,100)，聚甲基丙烯酸甲酯(Lemperle，US 5,344,452)。栓塞治疗包括通过导管将这些材料递送到靶脉管系统。因为在任何给定区域的脉管系统从较大的动脉开始至小动脉至后小动脉至毛细管，每个具有渐小的脉管直径，递送的材料(栓塞)继续在流动的血液中行进直至它变得进入并固定在较小的血管中，从而阻碍血液流向依附的组织。
本发明是新颖的和通过使用包被哺乳动物来源的von Willebrand因子(VWF)的固相材料，如微粒或线圈或斯坦特固定模(stent)致力于未满足的医疗需要。这样通过将固相血小板-结合试剂递送到靶位点和引发有效的导致相关脉管系统闭塞的血栓形成来取得治疗益处。
(E)发明概述本发明涉及使用通过局部血小板激活诱导血栓形成的固相试剂用于靶组织和/或器官，和相关脉管系统的治疗方法和组合物，所述靶组织和/或器官，和相关脉管系统实质上是增生性的或肿瘤的，或具有动静脉畸形，或正在出血。组合物包含将血小板捕获在固相试剂如线圈或斯坦特固定模或颗粒上的试剂。在本发明的一些实施方案中，固相试剂不但捕捉而且激活血小板。方法利用在固相颗粒上局部化血小板集合和激活血小板来产生随后的血栓形成，由此限制向靶区域的血液供应，而未诱导全身性的或系统的前血栓形成状态。
有目的的在患者中诱导血栓形成初看起来似乎是反直觉的，因为众所周知血栓形成显著有助于患者的发病率和死亡率。本发明固相血小板介导的闭塞是基于利用身体响应固定的von Willebrand因子(VWF)或其它局部作用的血小板激活剂产生血栓的天然能力而位点特异性诱导血栓形成。尽管VWF以可溶性形式在血流中循环，直至分子作为内皮下膜的一部分被暴露或与暴露的来自内皮下膜的胶原结合它才能够捕获血小板和诱导血小板激活。
固相血小板-结合剂与来自患者的血液(体外)或血流中的血液(体内)接触诱导血小板结合和局部激活，导致固相试剂周围的血小板增加，其导致血栓形成和向由闭塞的血管供应的组织的血流的中断。细胞，包括肿瘤细胞或增生组织，由于局部血流的丧失而减小或死亡。该方法避免全身的血小板激活和血栓形成；依赖于固定的VWF(但不是可溶性VWF)与循环的血小板结合并将其激活的事实。因此，本发明的方法和组合物是间接的治疗病理疾病如癌，增生性细胞，大出血或动静脉(AV)畸形的方法。
本发明在现有的用于治疗实体瘤，增生组织，大出血和AV-畸形和其中血小板(静止的和/或活化的)可能起治疗作用的其它任何疾病或状况的方法上改善。
以类似于现有病理状况(即肝素诱导的血小板减少症[HIT])的方式，通过将人Fc片段包括或结合到固相试剂上的Fc-介导的方法，或通过将选择抗体导向靶区域可以增强局部的血小板激活。在HIT综合症中的血小板激活导致局部的血栓形成和向受侵袭区域的血流的中断。这导致受侵袭组织的死亡。
位点特异性的血栓形成的范围或程度可以以各种方法控制。通过使用抗血小板试剂(例如GPIIb/IIIa抑制剂，阿斯匹林，潘生丁等)抑制血小板激活以确定的、可滴定的方式减小了诱导血栓的趋势。改变局部血流，血压和组织温度还可以作为控制局部血小板激活至刺激的方法。
典型的血管化肿瘤是实体瘤，特别是癌，其需要丰富的脉管血液供应。本发明涉及的典型实体瘤包括，但不限于肺，乳房，卵巢，胃，胰，喉，食管，睾丸，肝，腮腺，胆道，结肠，直肠，子宫颈，子宫，子宫内膜，肾，膀胱，前列腺，甲状腺，头和颈的原发恶性肿瘤，黑素瘤，神经胶质瘤，成神经细胞瘤，神经内分泌肿瘤等。本发明涉及的其它病症包括但不限于上述肿瘤类型的继发性(转移)瘤，癌性疼痛，AV-畸形，子宫肌瘤，骨盆充血，经痛，精索静脉曲张，咯血，动脉瘤，内脏动脉动脉瘤，假动脉瘤和内漏(endoleak)。
本发明优选方法包括制备包被重组或哺乳动物来源的VWF的线圈或斯坦特固定模和将VWF-包被的试剂导入动物如人类患者，动物患者，或试验动物的血流中；然后将VWF递送或汇集在期望的靶位点。线圈或斯坦特固定模可以由任何适当的材料构造，该材料能够将VWF保持在线圈或斯坦特固定模内部或在线圈或斯坦特固定模的表面上不定的或变化长度的时间。
针对实体瘤无限制生长的问题的解决方案是攻击肿瘤中的血管。该方法提供几个优于直接靶向肿瘤细胞的方法的优势。首先，肿瘤脉管能够直接接近脉管施用的治疗剂，因此允许高百分率的注射剂量的迅速局部化，第二，因为每个毛细管为在它周围肿瘤带中的数千细胞提供氧和营养，即使对肿瘤脉管系统有限的损伤也可产生大量肿瘤细胞死亡。最后，血管在不同肿瘤中是类似的，使开发治疗多种类型的癌的单一试剂是可行的。
(F)附图
描述不适用(G)发明详述本发明提供用于将血小板捕获在预定位点，激活血小板，和利用血小板的天然功能来取得有益的治疗结果的组合物和方法。按照本发明，血小板可以是循环的血小板或者可以是从外源获得的血小板。按照本发明，可以将血小板靶向特异性位点，然后可以利用血小板诱导血栓形成的天然能力来阻止，中断，或减少该位点的血流。减少的血流伴随着减少对疾病或病症体(condition agent)如肿瘤的营养供应，因此疾病体(disease agent)的尺寸减小。减小肿瘤大小是明显的治疗益处，这一点是清楚的。在一些情形中减少对靶区域的血液供应减轻疼痛。
本发明还包括使用能够结合和激活血小板的固相试剂将血小板靶向能够被选择性靶向的预定组织，例如增生组织。在本发明的这些实施方案中，靶向是指包含与预定位点或组织特异性结合的靶向部分例如配体等的固相。在本发明的其它实施方案中，靶向可以包括例如通过导管，斯坦特固定模，或线圈将本发明的组合物递送到或接近肿瘤位点。在预选的位点激活血小板通过减少对组织或位点的营养供应导致治疗益处。
本发明提供通过将血小板捕获在固相试剂上诱导血栓形成，诱导血小板激活，和使血栓形成的组合物和方法。靶脉管系统的血栓形成减少对下游组织的血液供应。通过将血小板捕获在包含VWF的固相(例如包被的颗粒)上，本发明的组合物和方法可以用于治疗癌，增生，子宫肌瘤，骨盆充血，经痛，AV-畸形，神经栓塞，精索静脉曲张，咯血，内脏动脉动脉瘤，动脉动脉瘤，内漏等。另外，本发明的组合物和方法为组合物的受者提供治疗益处。
在本发明的优选实施方案中，VWF是哺乳动物来源。在本发明最优选实施方案中，VWF是人源的。在本发明另一最优选实施方案中，VWF是猪源的。
VWF可以是天然的，合成的，重组的，或符合VWF生物活性部分的肽序列。在本发明的另一最优选实施方案中，VWF是重组来源。
本发明还提供将血小板结合剂(例如VWF)与固相直接或通过间隔物间接结合的组合物，只要血小板结合剂结合血小板的能力不受损害。间隔物在本文中是指在物理上将血小板结合剂从固相试剂的表面分开的一组惰性或活性分子。例举的间隔物在下面描述。直接结合可以共价或非共价地发生。间接结合可以通过间隔物发生，所述间隔物包括但不限于肽间隔臂，抗体间隔物，抗体片段间隔物，融合蛋白间隔物或糖间隔物。这些间隔物通常只作为颗粒和VWF之间的桥；然而，间隔物还可以用于改变血小板激活的程度。例如，Fc组分可以用作间隔物，由此在固相试剂上和周围实现增强的血小板激活。使用本领域技术人员已知的方法可以发生VWF与固相试剂的偶联。偶联剂的实例包括但不限于戊二醛和碳二亚胺。
在本发明的优选实施方案中，不含活性靶向试剂的组合物在哺乳动物脉管系统中的定位将通过在通过高度选择性微型导管递送后定向定位的血流选择。
按照本发明的组合物还可以包括能够与靶抗原或在脉管内皮或靶组织上的位点结合的靶向试剂或部分，由此使固相试剂能够定位在所选位点。例举的靶向试剂或部分对于本领域的技术人员是众所周知的，包括但不限于抗体，配体，受体，激素，植物血凝素，和钙粘着蛋白，或其部分或片段。
在本发明的优选实施方案中，靶向试剂将包括具有生物素，生物素模拟物(mimetic)和/或肽组分的抗体或抗体样分子。在本发明另一优选实施方案中，抗体或抗体样分子将指向生长因子/受体复合体。
按照本发明的组合物还可以包括下列的一种或多种一种或多种血小板结合调制剂(例如抑制剂或增强剂)，一种或多种血栓形成控制剂或一种或多种补体级联组分。
按照本发明的方法还可以包括施用能够在预定位点结合血小板的固相试剂；还可包括诱导捕捉的血小板的激活；施用具有抗原决定簇和血小板结合位点的双功能结合剂；通过改变本发明一种或多种组合物的温度，或通过改变预选位点处的温度控制血栓产生。
按照本发明的方法可以另外包括以下的一项或多项施用一种或多种血小板结合调制剂，施用一种或多种血栓形成调制剂；施用一种或多种补体级联组分；施用一种或多种配体和/或抗-配体，其用于将固相结合到预定位点，和/或用于将血小板结合部分或组分与固相结合。
本发明还包括试剂盒，其可以包含但不限于任何或所有的以下组分，组分包括用于将血小板靶向内皮膜元件的固相试剂用于结合血小板的结合剂；用于结合内皮膜元件的配体；配体偶联物；用于结合配体或配体偶联物的抗配体；血小板结合调制剂(增强剂和/或抑制剂)；血栓形成调制剂；补体级联组分；补体级联组分诱导物；和包括抗配体的用于结合血小板的结合剂。试剂盒可以包括双功能结合剂，和/或结合剂-配体偶联物，和/或血小板结合剂-抗配体偶联物。
本发明的组合物和方法包括将组合物递送到预选位点的任何机理，所述递送包括但不限于全身地，局部地，口服地，或表面地(topically)。
按照本发明的一些实施方案，将结合剂用于在预定位点捕捉血小板。定义在本文中，固相试剂是指适合用于结合，包含，或保留血小板结合剂的任何固体材料。血小板结合剂可以被吸附到固相试剂以使血小板结合活性被保留，例如在靶位点或在靶位点内部。固相试剂可以是线圈，斯坦特固定模，或颗粒，例如珠或类似物，所有这些对于本领域技术人员是众所周知的。
在本文中，颗粒是指能够包含或保留血小板结合剂的固相材料的分离部分或一部分。本发明的优选方法包括制备包被重组或哺乳动物来源的VWF的颗粒和将包被VWF的颗粒导入动物如人类患者，动物患者，或试验动物的血流中。在本文中，术语“颗粒”是指能够直接或间接(例如通过配体)结合血小板的任何固相材料。关于尺寸，颗粒可以是均匀或不均匀的。具体地，颗粒可以是球形(包括椭圆形)或不规则形。可以用任何适当的材料构建颗粒，该材料能够将VWF保留在颗粒内部或颗粒表面上不确定的或变化长度的时间。例举的材料包括聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚交酯，聚乙醇酸交酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚己酸内酯，丙交酯-己内酯共聚物，聚羟基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐，聚原酸酯，清蛋白，胶原，明胶，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，丙烯酸羟烷基酯，甲基丙烯酸羟烷基酯，亚甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，基于纤维素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶，磁性颗粒，荧光颗粒，动物细胞，植物细胞，大颗粒聚清蛋白和小颗粒聚清蛋白(micro-aggregated albumin)，变性蛋白聚集体和脂质体，单独或结合使用。适用于本发明的固相材料对于本领域技术人员是众所周知的，应当不限于上述列举的那些例证性材料。
形成斯坦特固定模或线圈的例举材料包括但不限于聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚交酯，聚乙交酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚己酸内酯，丙交酯-己内酯共聚物，聚羟基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐，聚原酸酯，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸，丙烯酸羟烷基酯，甲基丙烯酸羟烷基酯，亚甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，基于纤维素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶；磁性材料，荧光材料；金，铂，钯，铼，铑，钌，不锈钢，钨，钛，镍及其合金；单独或结合使用。
固相材料的优选尺寸取决于所用材料的类型。例如，本领域技术人员将认识到如果固相是斯坦特固定模或线圈，大小优选为在血管如动脉范围内的直径。典型地直径可达约15mm或更大。如果固相是颗粒，如珠，直径可达约7mm，优选约1μm至约5mm，甚至更优选约20μm至约300μm。适用于本发明的固相材料的尺寸对于本领域的技术人员是众所周知的，并应当不限于以上列举的例证性大小。
在本文中，结合剂或靶向部分是指用于将一种物质与另一种结合的一种或多种固相化学或生物分子或构件。具体地，结合剂，或固相试剂与在限定细胞群体，典型地增生组织和/或相关脉管系统，或癌细胞和/或相关脉管系统上的配体，受体或配体/受体复合体结合。分子作为结合剂的功能不应当受限于附着的结构机理。例如，结合剂可以结合受体，抗原决定簇或表位，酶底物，或将结合剂与靶细胞或细胞群体连接的其它生物构件。结合剂可以是偶联物，包括但不限于免疫偶联物，化学偶联物(共价或非共价)，融合蛋白等。
在本文中，配体结合剂是指显示彼此特异性结合的互补的一组分子。配体/抗配体对通常以相对高的亲和力结合，为此，对于本发明的应用可能是高度理想的。非常著名的配体/抗配体对是生物素和抗生物素蛋白。在本文中，抗生物素蛋白是指抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，中性抗生物素蛋白，其衍生物和类似物，及其功能等价物。抗生物素蛋白可以以多价或单价方式与生物素结合。其它例举的配体/抗配体对包括但不限于同源肽，异源肽，“亮氨酸拉链”，锌指蛋白/双链DNA片段，酶/酶抑制剂，半抗原/抗体，配体/配体受体，和生长因子/生长因子受体。
在本文中，所选位点，预定位点，靶向，和预先靶向全都指其中在固相试剂周围的血小板累积将提供治疗有益的结果的位点。典型地，这涉及靶向部分的靶位点定位。该位点包括但不限于实体瘤的脉管系统，良性瘤的脉管系统，增生组织的脉管系统，AV畸形，脉管动脉瘤和内漏。
在本文中，使用导管，微型导管或通过针和注射器可以发生包含血小板结合剂的固体试剂的递送。最经常通过动脉循环进入来实现通过导管或微型导管的递送，然而通过静脉循环递送固体试剂也是理想的。例如，利用动脉或静脉循环通过对靶位点的导管可以递送颗粒，线圈或斯坦特固定模形式的固体试剂。利用动脉循环的固体试剂的递送是有利的，因为在靶组织中施用试剂下游的毛细血管床作为捕捉试剂的工具，由此防止试剂进入体循环。还可以使用与固体试剂有关的靶向试剂将固体试剂定位在动脉循环内部。利用静脉系统的固体试剂的递送也是理想的。可以通过使用与固体试剂有关的靶向试剂将固体试剂与靶位点结合来完成固体试剂在静脉系统中的定位递送。还可以在外科手术过程中将固体试剂递送到靶位点。例如，通过注射器和针可以将颗粒形式的固体试剂递送到靶位点。作为另一实施例，在外科手术过程中可以手工地将线圈或斯坦特固定模形式的固体试剂放置在靶位点。
在本文中，血栓是指陷于血纤蛋白中的血细胞的任何半固体聚集体和来源于血小板与固相试剂活性结合的血小板的凝块。按照本发明，作为活化的血小板在预定位置累积的直接结果形成血栓。血栓形成是指血栓的形成，典型地在血管中。形成血栓的是指易于导致血塞形成，或血栓形成的物质。
在本文中，栓塞是指血管内的团块，其通过血流，和通过大小约束最终变成进入并固定在血管或毛细管中，远离血管内团块的起始位点。栓塞形成不意味着主动过程，而是指被动过程，由此通过血管内团块穿过血流，在那它们变得进入并固定在小血管和毛细管中而发生血管闭塞。
相反，本发明涉及固相材料至靶脉管系统的递送，因此通过使用血小板结合剂将血小板活性补充在固相表面。与包括在此作为参考的引用的专利中所述的栓塞材料形成对比，由于血小板在固相材料周围的迅速累积，必须将本发明的试剂递送到接近靶脉管系统。
例如，由Draximage(Kirkland，Quebec，Canada)提供的大分子聚清蛋白(macro-aggregated albumin)(MAA)，例如被用作栓塞显象剂。MAA由大小为10μm-70μm，最大尺寸为150μm的颗粒组成，所述颗粒用高锝酸钠Tc 99m放射性标记以使闪烁照相术成像。将MAA颗粒静脉内注射，并作为栓塞穿过血流，其中它们被捕获在肺的肺泡毛细血管床中。使用本发明的方法，将VWF固定在MAA上，随后将颗粒注射到血管系统中导致血小板与颗粒立即结合和接近注射位置的脉管系统的闭塞。
本发明在现有的产生血管闭合的方法上改善，通过使用血小板结合剂将血小板固定在固相材料的表面，由此增加固相材料的有效尺寸。例如，被注射到血流中的包被或含有VWF的颗粒将在它的表面上迅速累积血小板，在接近注射位置有效产生分层的，活化的血小板的“洋葱-效应”。因此本发明能够将最少量的小颗粒递送到血流中，因此颗粒由与颗粒上或内部的血小板结合剂活性结合的血小板的增加而在尺寸上迅速增加。此外，颗粒结合的血小板将彼此相互作用，由此形成增加尺寸的聚集体，其产生紧密的基质和引起靶脉管系统的闭塞。
本发明另外在现有的产生血管闭塞的方法上改善，通过血小板结合剂将血小板固定在固相材料的表面。本发明的试剂因此将具有下列体内效应a)模塑它滞留的血管或毛细管的轮廓，b)产生固体，不渗透的三维基质；这又在脉管中产生紧密的，不渗透的密封，由此最大地抑制血液向下游血管和组织的递送。
例如，将血小板结合颗粒导入血流将进行经过下列顺序的事件a)在颗粒表面上将形成单层血小板，由此形成(i)增加直径的颗粒和(ii)包被活化血小板的颗粒，其有结合和激活悬浮液中附近的血小板的倾向，此处定义为‘单层的表面活化的血小板’颗粒(S-SAP颗粒)，(b)在血流中流动的血小板将与结合形成‘洋葱样’层的S-SAP颗粒的血小板相互作用，此处定义为‘多层的表面活化的血小板颗粒(M-SAP颗粒)，c)M-SAP将通过形成较大聚集体的血小板/血小板相互作用而彼此相互作用，此处定义为‘M-SAP基质’。
作为另一个实例，通过下述事件将进行将包含或具有表面结合的血小板结合剂(如VWF)的无定形血小板结合颗粒(如MAA)引入到血流中；a)单纯的(single)血小板将结合到颗粒的基质上或内部，从而形成(i)具有增加的直径和刚性的颗粒，(ii)包被以并包含活化的血小板的颗粒，所述血小板具有结合和活化悬浮液中附近血小板的倾向；b)在血流中流动的血小板将与结合到和/或结合入颗粒的血小板相互作用，从而在颗粒内部和/或颗粒上形成聚集体，c)包含和/或具有表面结合的血小板的颗粒将彼此相互作用以形成大的颗粒聚集体。
在本文中，提供治疗益处等等的治疗有益的是指受体动物的生理的理想变化。在本发明优选实施方案中，变化是可以检测的。按照本发明，可以使用或利用涉及活化血小板或血小板调节的任何生物机理来取得有益的治疗结果。按照本发明产生的例举的治疗益处包括但不限于形成血栓，形成血小板介导的闭塞，消除增生组织或细胞，消除肿瘤和/或肿瘤细胞，减小增生组织的尺寸，减小肿瘤的尺寸，使增生组织或肿瘤变得对另外的治疗如化学疗法和/或放射疗法等等敏感，缺乏或减少对增生组织或癌的营养供应，修复AV-畸形，减少或防止血液从内漏中损失和修复脉管动脉瘤。
在本文中，“施用”是指导致包含固相试剂的组合物递送到预定细胞，多种细胞，或组织，典型地哺乳动物的任何行为。施用可以体内，体外，或离体进行。例如，可以通过注射或通过内镜或导管施用组合物。施用还可以包括直接将按照本发明的组合物施用到细胞。例如，在外科手术期间，肿瘤或增生组织的脉管系统可能被暴露。按照本发明的实施方案，例如通过洗涤或冲洗外科手术部位，脉管系统，和/或细胞可以将暴露的细胞或脉管系统直接暴露于本发明的组合物。
使用结合或靶向试剂可以将固相血小板结合剂定位在特定的靶位点。例举的结合或靶向试剂包括但不限于单克隆抗体；多克隆抗体；嵌合单克隆抗体；人源化抗体；遗传工程抗体；抗体片段，其选自F(ab)2，F(ab’)2，Fab，F(ab’)，Dab，Fv，sFv，scFv，Fc，和最小识别单位；表示单克隆抗体活性部分的单链(SC-Mab)；肿瘤结合肽；蛋白质，包括受体蛋白质；肽；多肽；糖蛋白；脂蛋白等等，例如生长因子；淋巴因子和细胞因子；酶，免疫调制剂；激素，例如促生长素抑制素；配体(与它的互补抗配体配对)；寡核苷酸；与介导效应子功能的分子结合的上述任何一种；和上述任何一种的模拟物或片段。保持与确定靶细胞群体结合能力的以上所列靶向部分的类似物也可以用于所要求的本发明中。另外，可以设计合成的靶向部分。
用于本发明的实施中的单克隆抗体包括完整的抗体及其片段。该单克隆抗体和片段可以按照常规技术，如杂交瘤合成，重组DNA技术和蛋白质合成来生产。有效的单克隆抗体和片段可以衍生于任何物种(包括人类)或可以作为利用来自多于1种物种的序列的嵌合蛋白形成。通常参见Kohler和Milstein，Nature，256495-97，1975；Eur.J.Immunol.，6511-19，1976。优选的能够将固相试剂定位在靶位点的结合和/或靶向试剂是抗体或抗体样分子，优选单克隆抗体。更优选的结合剂是结合配体/受体复合体的抗体，所述配体/受体复合体在增生组织或细胞(例如肿瘤)或与增生组织或细胞有关的脉管系统上。最优选的结合剂是抗体或抗体样分子，其与肿瘤块如肿瘤脉管系统上或附近的生长因子/生长因子受体复合体结合。在本发明的优选实施方案中，结合剂(即抗体或抗体样分子)将与VEGF/VEGF受体复合体结合。在本发明另一优选实施方案中，抗体或抗体样分子结合将识别由于配体/受体(即生长因子/生长因子受体)相互作用形成的新表位(隐蔽的或先前不可用的表位)。在本发明另一优选实施方案中，抗体或抗体样分子与生长因子/生长因子受体复合体的结合将不影响生长因子或生长因子受体的功能。
在本发明的实施中寡核苷酸，例如与靶细胞核酸(DNA或RNA)的部分互补的反义寡核苷酸也有效用作靶向部分。与细胞表面结合的寡核苷酸也有效。
上述分子的功能等价物也有效用作本发明的靶向部分。一种靶向部分功能等价物是“模拟”化合物，一种设计来模拟用于靶向部分-靶细胞结合的适当构象和/或定向的有机化学构建体。另一靶向部分功能等价物是称为“最小”多肽，使用计算机辅助分子模型和具有改变的结合亲和力的突变体构建的短多肽，该最小多肽显示靶向部分的结合亲和力。
免疫球蛋白的Fv片段对于定向肿瘤治疗来说具有许多优于完整免疫球蛋白的显著的优势，包括在实体瘤组织上更好的损伤穿透和更迅速的血液清除，以及可能更低的Fc介导的免疫原性。典型的单链Fv(scFv)结合剂可以从分离自识别配体/受体复合体的抗体的可变区的基因来设计。
本发明的实施方案涉及与正常非肿瘤相关脉管系统相比，具有对标记的结合亲和力的靶向试剂，该标记被发现，表达，易于结合，或另外定位在肿瘤相关脉管内皮细胞的细胞表面上。另外，靶向试剂具有结合亲和力的某些标记可以与肿瘤相关脉管系统的组分有关而不是在肿瘤相关内皮细胞本身上。例如，该标记可以位于基底膜或肿瘤相关结缔组织上。
制备和使用如通过组织切片的免疫染色评估具有对肿瘤脉管系统相对高程度的选择性，和与正常内皮细胞的细胞表面的很小或无反应性的抗体或其它结合剂或部分可能是理想的。制备和使用能够结合所有脉管系统共有的表位的抗体或其它结合剂或部分也可能是理想的。
可以使用按照本发明的含有或不含靶向试剂的包括固相血小板-结合剂的任何组合物来引发体内治疗益处，血栓形成，和/或细胞致死或退化。组合物可以包括一种或多种佐剂，一种或多种载体，一种或多种赋形剂，一种或多种稳定剂，一种或多种渗透剂(例如，调节穿过细胞膜运动的试剂)，一种或多种显像剂，一种或多种效应物；和/或生理可接受的盐水和缓冲剂。通常，佐剂是与免疫原混合以便引发更显著免疫应答的物质。组合物还可以包括药用载体。药用载体包括但不限于盐水，无菌水，磷酸盐缓冲盐水等。在本发明的组合物中可以包括适于递送给患者的其它缓冲剂，分散剂，和惰性非毒性物质。组合物可以是适于给药的溶液，典型地是无菌的，非热源性的和不含不希望有的颗粒物质。通过常规灭菌技术可以将组合物灭菌。
在本发明的优选实施方案中，适当的组合物包括与配体/受体复合体结合的结合剂或靶向试剂。按照本发明用作靶子的示例性抗原包括但不限于癌相关抗原，所述癌包括肺，结肠，直肠，乳房，卵巢，前列腺，头，颈，骨，免疫系统，血液，或其它任何解剖位置。示例性抗原和/或预定位点包括但不限于VEGF/VEGF受体复合体，FGF/FGF受体复合体，或TGF.β/TGF.β受体复合体，p-选择蛋白，唾液酸-路易斯X(sialy-lewis X)，内皮缩血管肽，内皮缩血管肽受体，内皮缩血管肽/内皮缩血管肽受体复合体，AFP甲胎蛋白，血小板-内皮细胞粘附分子(PECAM)，CD31，CD34，CD36，糖蛋白Ib(GPIb)，endoglin，凝血调节蛋白，内皮白细胞粘附分子(ELAM)，胞间粘附分子1(ICAM-1)，MHC-1，和MHC-II。受试者可以是人或动物受试者。
如上所述，本发明的组合物或方法包括血小板结合剂或组分。示例性血小板结合剂或组分包括但不限于von Willebrand因子(VWF)，骨桥蛋白，血纤蛋白原，血纤蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，胶原，血小板反应蛋白，层粘连蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，磷脂酶A2(PLA2)，基质金属蛋白酶(MMPs)，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，血小板-内皮细胞粘附分子(PECAM)，胞间粘附分子1(ICAM-1)，胞间粘附分子2(ICAM-2)，CD11b/CD18(MAC-1)，CD11a/CD18(LFA-1)，p-选择蛋白糖蛋白配体1(PSGL-1)，单独地或组合。
如上所述，本发明的组合物或方法可以包括血小板介导的闭塞增强剂。血小板介导的闭塞增强剂可以是形成以上所述双功能分子一部分的部分，可以是按照本发明的组合物中的成分，和/或可以与按照本发明的组合物分开施用。
示例性的血小板-介导的闭塞增强剂包括但不限于瑞斯托菌素，凝血酶，肝素诱导的血小板减少症(HIT)抗体或其部分，抗磷脂抗体(APA)或其部分，通过Fc-介导机理的全抗体分子，抗LIBS抗体，抗CD9抗体，肾上腺素，凝血酶受体激活肽(TRAP)，蛋白酶(proteinase)活化的受体(也称为蛋白酶(protease)活化的受体，PAR)拮抗剂，组织蛋白酶G，弹性蛋白酶，花生四烯酸酯，血小板活化因子(PAF)，血栓烷A2(TxA2)，TxA2模拟物，磷脂酶A2(PLA2)，蛋白激酶C(PKC)的激活剂，腺苷二磷酸(ADP)，环加氧酶1(COX-1)的诱导物，环加氧酶2(COX-2)的诱导物，胶原，von Willebrand因子(VWF)，基质金属蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，离子载体，补体级联组分(例如C5b-9)血小板微粒，血小板膜级分。
如上所述，本发明的组合物或方法可以包括血小板介导的闭塞阻滞剂等。血小板介导的闭塞阻滞剂可以是形成如上所述的双功能分子一部分的部分，可以是按照本发明的组合物中的成分，和/或可以与按照本发明的组合物分开施用。
示例性的血小板介导的闭塞阻滞剂包括但不限于阿斯匹林，布洛芬，对乙酰氨基酚，酮洛芬，噻氯匹定，氯吡格雷，吲哚美辛，双嘧达莫，ω-3脂肪酸，前列环素，氧化氮，氧化氮的诱导物，氧化氮合成酶的诱导物，基质金属蛋白酶抑制剂(MMPIs，TIMPs)，抗GPIIb/IIIa试剂，抗αvβ3试剂，抗α2β1试剂，抗CD36试剂，抗GPVI试剂，金精三羧酸，凝血酶受体拮抗物，血栓烷受体拮抗物，链激酶，尿激酶，组织纤溶酶原激活物(tPA)。
另外，已知已经被冷却至低于它们膜相变温度(即＜15℃)的血小板变得不可逆地活化。尽管如果灌输到患者中的血小板正常起作用，血小板也被迅速清除出身体(即，在约24小时内，和7-10天的正常循环血小板的寿命形成对比)。尽管这些血小板被迅速清除，它们以高亲力合与固定的VWF结合。因此，冷却的血小板的灌输提供另外的增强在靶位点血栓形成的方法。因此，本发明的一个实施方案包括通过施用如上所述冷却的血小板控制血小板介导的闭塞。
如上所述，靶向部分可以是，或可以结合至结合对的一个成员。按照本发明的方法可能要求足够的时期来在固定位点累积靶向部分，对非目标累积的最佳靶向，累积和结合结合对的第二个成员，和/或清除未结合的物质。
按照本发明，可能使用两步，三步或更多靶向或定位步骤。这些方案中许多在本领域是众所周知的(参见，例如，使用生物素/抗生物素蛋白方案的美国专利5,578,287)。示例性的多步方案包括但不限于施用结合剂-配体，施用抗-配体以清除未结合的结合剂和局部化结合的结合剂-配体，和施用活化剂-配体。在本文中，活化剂是指任何活性或变成活性和导致治疗益处的治疗剂。
按照本发明的方法，结合剂必须能够结合配体/受体复合体，并可以通过任何在免疫学上适当的路线施用于患者。例如，可以通过静脉内，动脉内，皮下，腹膜内，鞘内，膀胱内，真皮内，肌内，或淋巴管内(intralymphatic)途径将结合剂导入患者。组合物可以是固体，溶液，片剂，气溶胶，或多相制剂形式。脂质体，长期循环脂质体，免疫脂质体，生物可降解微球体，微团等也可以用作载体，赋形剂，或递送系统。另外，使用本领域众所周知的离体方法，可以将血液，血浆或血清从患者中取出；任选地，纯化患者血液中的抗原可能是理想的；血液或血清然后可以与组合物混合，所述组合物包括按照本发明的结合剂或固相试剂；将处理过的血液或血清返回至患者。临床医师可以比较与这些不同的途径相关应答来确定最有效的给药途径。本发明不应当限制于任何具体的将结合剂导入患者的方法。
给药可以是一次，多次，或持续延长的时期。因为本发明的组合物可以用于处于严重疾病状态，即生命危险或可能生命危险的患者，如果需要可以施用过量的固相试剂。用于施用药物组合物的实际方法和方案，包括注射本发明组合物的稀释技术，是众所周知的或对本领域的技术人员将是明显的。这些方法和方案中的一些在Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.(1982)中描述。
固相试剂可以与其它结合剂结合给药，或可以结合其它治疗方案或试剂，例如化学治疗剂，栓塞剂如明胶海绵或聚乙烯醇(PVA)颗粒等给药。
如在本领域众所周知，与体内施用治疗剂或治疗剂偶联物相关的缺点包括非目标或不希望有的目标结合。因此最小化非目标结合，最小化非目标暴露于治疗剂或活化剂，和/或最大化清除未结合的结合剂，配体，或活化剂是任何施用的组合物的理想属性。此外，最优化这些属性典型地允许施用更高剂量的活化剂，治疗剂，或激活先前未激活试剂的方法的成分。本领域的技术人员精通于选择施用最高可能的剂量而安全地保持在毒性阈值以下的最佳参数。
因此，按照本发明的优选实施方案，未活化的血小板通过与固相试剂结合累积或被诱导累积在预定位点，然后适当固定的血小板被选择性地激活。
按照本发明的优选实施方案，激活的血小板通过与固相试剂结合或通过与固相试剂结合的血小板累积或被诱导累积在预定位点。
本发明的有效性可以通过测定血栓形成，血栓形成的形态测量研究，肿瘤坏死，肿瘤大小，肿瘤形态学，和/或导致肿瘤坏死的血栓形成，血流研究(例如血管造影术，多普勒超声，放射显影，CT扫描，MRI)，或疼痛症状的减轻的常规试验来监视。本领域的技术人员将认识到可以进行其它试验来评估或监视治疗益处。
本领域的技术人员将认识到对于某些先天性和病理学症状，其中一些所列如下，理想的是改进本发明的组合物或方法来补偿患者过度流血或形成血栓的体质。在这些情形下，可以利用增强或抑制本发明的方法或组合物的改良剂的应用。这些改良剂的应用预计最小化流血或凝固事件。此外，改良剂的应用能够在正常情形(即正常止血)下控制给药按照本发明的组合物。
可以许可使用控制剂(controller)，阻滞剂，或减弱本发明的方法或组合物的试剂的示例性的促血栓形成或促凝结症状包括但不限于，因子VLeiden缺乏，抗磷脂综合症(APS)，蛋白C和/或蛋白S和/或抗凝血酶III缺乏，深静脉血栓形成(DVT)，假von Willebrands病，IIb类von Willebrands病，周围性血管疾病(PVD)，和高血压，这只是其中之一。示例性的包括出血风险、可以许可使用增强剂或增加本发明方法或组合物的试剂的症状包括但不限于任何包括出血风险的症状，其包括但不限于凝固因子缺乏，血友病，血小板减少症，和抗凝治疗，这只是其中之一。控制血栓产生包括改变预定位点温度，改变预定位点血流速率，和改变预定位点血压中的至少一种。
作为前述的实例，本领域的技术人员将认识到在血管闭塞过程开始后，相关促血栓形成症状的逆转或抑制可能是必需的。在该情形中，降低血小板反应性的试剂的给药将又减小对血管闭塞引发剂的应答。该试剂容易被本领域技术人员知道和包括但不限于阿斯匹林或类阿斯匹林化合物，布洛芬，对乙酰氨基酚，酮洛芬，噻氯匹定，氯吡格雷，吲哚美辛，ω-3脂肪酸，前列环素，氧化氮，氧化氮的诱导物，氧化氮合成酶的诱导物，基质金属蛋白酶抑制剂(MMPIs，TIMPs)，抗GPIb试剂，抗GPIIb/IIIa试剂，抗αvβ3试剂，抗α2β1试剂，抗CD36试剂，金精三羧酸，凝血酶受体拮抗物，血栓烷受体拮抗物，链激酶，尿激酶，组织纤溶酶原激活物(tPA)。
其中增强或增加血小板闭塞过程是理想的示例性过程包括血小板减少(低血小板量)患者。这些个体将受益于伴随或预先给药(灌输)血小板产品以提供足够来源的血小板来实现血小板闭塞。本领域的技术人员将认识到在该情形下可以使用所有可灌输的模拟或近似正常血小板功能的产品。该试剂包括但不限于随机供体血小板，单采血液成分术血小板，自身血小板，洗涤的血小板，血小板膜级分，冷却的血小板，冷冻血小板，包含或表达血小板膜组分的颗粒，血小板代用品和全血。
作为另外的实例，一旦靶向治疗位点可以使用特定的血小板功能增强剂来提高或增强初始的血小板反应性。已经证明本领域的技术人员已知的试剂增强现有的血小板反应性和/或降低限制充分血小板反应性的阈值以促进在现有血栓周围的不可逆血小板附着和/或血小板脱粒和/或血小板/血小板结合和/或血小板增加。这些试剂包括但不限于瑞斯托菌素，凝血酶，肝素诱导的血小板减少症(HIT)抗体或其部分，抗磷脂抗体(APA)或其部分，通过Fc-介导机理的全抗体分子，抗配体诱导的结合位点(抗-LIBS)抗体或其部分，抗CD9抗体或其部分，肾上腺素，凝血酶受体激活肽(TRAP)，PAR拮抗剂，组织蛋白酶G，弹性蛋白酶，花生四烯酸酯，血栓烷A2(TxA2)模拟物，TxA2，磷脂酶A2(PLA2)，蛋白激酶C(PKC)的激活剂，腺苷二磷酸(ADP)，胶原，von Willebrand因子(VWF)，基质金属蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，离子载体，血小板微粒，血小板膜级分。
一旦导入患有肿瘤，增生组织，AV-畸形，动脉瘤或内漏的动物的血流中，固相试剂将定位在靶脉管系统中；结合或固定血小板，由此固定激活血小板；激活的血小板又结合和激活其它血小板直至形成闭塞。血小板激活和结合促进白细胞与活化的血小板结合，进一步增强靶脉管系统的闭塞。
实施例实施例1针对抗原细胞表面标记制备单克隆抗体的技术是非常简单的并且可以使用本领域技术人员众所周知的技术，如Kohler和Milstein(1975)的技术所举例说明，来容易地进行。一般地说，使用受激的内皮细胞制备单克隆抗体涉及下列程序。在组织培养物中培养衍生于人肿瘤的细胞或细胞系4天或更多天。将组织培养物的上清液(“肿瘤条件培养基”)从肿瘤细胞培养物中移取并以50％(v/v)的终浓度加入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养物中。在2天培养后，非酶方式收获HUVEC并将1-2×106个细胞腹膜内注射到小鼠中。以2周间隔重复该过程3次，最后的免疫是通过静脉内途径。3天后，收获脾细胞并通过标准方案(Kohler和Milstein，1975)与SP2/0骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释克隆产生具有适当反应性的抗体的杂交瘤。
从产生的杂交瘤收集物，将选择一种或多种杂交瘤，其产生比它识别非活化脉管内皮更大程度上识别活化脉管内皮的抗体。最终目标是鉴定实质上不具有对正常内皮的结合亲和力的抗体。通过使用例如针对一种或多种类型的肿瘤活化内皮细胞的ELISA，RIA，IRMA，IEF，或类似的免疫测定筛选来鉴定适当的产生抗体的杂交瘤。一旦已经鉴定候选物，将检验针对非活化或“正常”内皮或其它正常组织或细胞类型的反应性的缺少。这样，可以排除产生具有对特定应用不希望有的高水平正常交叉反应性的抗体的杂交瘤。
实施例2使用制备特异性地识别配体/受体复合体，特别地生长因子/生长因子受体复合体的单链抗体技术，由此产生的抗体分子识别生长因子/生长因子受体复合体，但不与生长因子或生长因子受体单独结合。通过用纯化的配体和受体，如VECF和VEGF受体的复合体免疫小鼠可以形成这些抗体，将产生的V基因用于在丝状噬菌体中构建抗体文库。抗体片段的噬菌体展示允许针对活化的内皮细胞抗原，特别地配体/受体复合体生产重组抗体分子。噬菌体系统模拟脊椎动物免疫系统。
在佐剂如Quil A的存在下用HPLC-纯化的重组VEGF和VEGF受体(例如可溶性VEGF/FLT-1受体或VEGF/KDR受体)复合体免疫雌性BALB/c小鼠。在达到适当的抗体效价后(通常在第4次加强后)，杀死小鼠和分离脾。从脾中分离信使RNA(mRNA)并转录成cDNA。扩增cDNA的V基因并装配为“单链Fv”(scFv)。在用适当的限制酶消化后，将scFv连接到噬菌粒载体中。然后用这些噬菌粒文库转化感受态大肠杆菌细胞，在用辅助噬菌体(例如M13K07，Pharmacia)感染后，制备展示scFv的噬菌体颗粒。筛选表达与配体/受体复合体结合，但不与配体或受体单独结合的可溶性scFv的选择的克隆。分别将配体/受体复合体，配体和受体用作固相抗原，使用标准ELISA技术完成该筛选。
实施例3已知多种对于本发明这个方面的实施能够用作现有的或可诱导的靶的内皮细胞标记，包括VEGF/VPF(血管内皮生长因子/血管通透因子)，内皮-白细胞粘附分子(ELAM-1；Bevilacqua等，1987)；脉管细胞粘附分子-1(VCAM-1；Dustin等；1986)胞间粘附分子-1(ICAM-1；Osborn等，1989)；试剂白细胞粘附分子-1(LAM-1试剂)乃至主要组织相容性复合体(MHC)II类抗原，如HLA-DR，HLA-DP，或HLA-DQ(Collins等，1984)。在这些之中，可能优选靶向VEGF/VEGF受体复合体。可以将识别上述内皮细胞抗原的单克隆抗体或特异的肽与固相试剂如包被VWF的颗粒结合，并通过导管或类似递送装置递送至靶脉管系统。颗粒由此与靶脉管系统中的内皮细胞结合，导致在颗粒上血小板结合和血小板激活，其又导致颗粒周围的血小板聚集和最终血栓形成。形成的血栓闭塞靶脉管系统，由此防止氧和营养递送到下游组织。
实施例4将血小板靶向特定位点可以采取血小板通过固定在固相试剂上的VWF直接与固相试剂结合的形式。例如，通过各种方法如通过导管可以将固定在1μm-5mm近似直径的颗粒上的重组和/或人和/或猪VWF递送到靶位点。在将VWF-颗粒递送到靶脉管系统后可以发生血小板结合，由此在血流中流动的血小板与颗粒接触，与颗粒结合，扩散越过颗粒，激活，结合其它血小板和最终形成闭塞血管的血栓。还可以离体引发血小板与VWF颗粒结合，由此在身体外血小板与脉管中的颗粒接触，随后通过导管或类似的试剂递送装置递送到靶位点。选择颗粒大小以使在用颗粒引发血小板反应性(即血小板与颗粒结合)后不发生颗粒超过毛细血管床的前进，由于尺寸限制或因为结合颗粒的血小板和/或结合的凝固蛋白与血管壁受体相互作用。因此，VWF的颗粒大小可以为直径约1μm-约5mm。最优选颗粒直径将为5μm-2mm。甚至更优选颗粒直径将为20μm-300μm。
实施例5-颗粒对于本发明来说可以将各种组合物的颗粒用作固相试剂。对于它们与结合血小板的试剂的结合能力已经检验了下列颗粒。聚苯乙烯微球粒购自Polysciences公司，(Warrington，PA)并通过被动吸附过程(温育在0.2M碳酸盐缓冲液，pH9.0-9.6中)或通过使用碳二亚胺或戊二醛与衍生的球粒共价键合包被人von Willebrand因子。检验几类球粒，包括普通聚苯乙烯微球粒(目录号07310，17134，17135，07312，07313，07314)，聚珠氨基微球粒(目录号19118)，聚珠羧酸酯微球粒(目录号17141)，fluoresbrite微球粒(目录号17155，17156)，聚苯乙烯染色的微球粒(目录号15715，15714，15716)，和顺磁颗粒(目录号19829)。所有球粒结合von Willebrand因子，在随后检验时结合血小板。通过聚集测量法(aggregometry)和相差显微术证实血小板与球粒的结合。
其它检验的颗粒包括聚乙烯醇(PVA)颗粒(Cook，Bloomington，Indiana)和大分子聚清蛋白(MAA)颗粒(Edmonton RadiopharmaceuticalCentre，Edmonton，Alberta，Canada)。在分开的实验中，von Willebrand因子被动地(碳酸盐缓冲液，如上)和共价地(戊二醛键合，如上)与颗粒结合。然后使用聚集测量法，相差显微术和荧光显微术(用FITC标记的抗-CD61抗体)证实血小板与颗粒的结合。
实施例6-哺乳动物VWF的比较使用两种方法将猪VWF，牛VWF，和人VWF固定在聚苯乙烯颗粒上。第一种方法(直接结合)利用在0.2M碳酸酯(pH9.35)的存在下材料被动吸收到固相颗粒上。第二种方法(间接结合)包括使用已经固定在固相颗粒表面的抗VWF抗体分别从猪，牛，和人血浆中分离VWF。在后一种方法中，所用抗体(兔源)购自Dako(Mississauga，Ontario；目录号A0082)，按照制造厂商提供的信息，证实与人，牛和猪von Willebrand因子结合。通过在碳酸盐缓冲液(0.2M，pH9.35)中被动吸收将抗体固定到聚苯乙烯球粒(直径4.5μm)并与各种来源的血浆在室温下温育60分钟。洗涤球粒使其不含未结合的蛋白，并用于激发来自人和猪的全血和富含血小板的血浆。类似地，通过如上所述的被动吸收单独地将人，猪和牛VWF直接与球粒连接(即无连接抗体)，并用于激发人和猪血小板(全血和富含血小板的血浆[PRP])。在一些实验中，将猪和人PRP混合在一起和用各种试剂(参见以下)激发。
+弱血小板反应，++中等弱血小板反应，+++中等血小板反应，++++强血小板反应，+++++极强血小板反应实施例7-白细胞相互作用与猪或人VWF结合的颗粒特性上与人或猪血小板结合，其取决于血的来源。另外，观察到包括单核细胞，粒细胞和淋巴细胞的白细胞与结合到颗粒的血小板相互作用(通过鉴别染色法和显微镜检查证实)。
血小板在靶位点激活诱导可以增强减小或杀死靶组织的二次效应。通过活化的血小板如血小板因子4(PF4)的试剂的释放抑制血管发生。激活后化学引诱物如RANTES的血小板释放增强白细胞(例如嗜酸性粒细胞，单核细胞)对靶组织的效应。通过颗粒组分如CD62血小板的激活后表达将诱导单核细胞和多形核白细胞(PMNs)的结合，其导致组织因子表达(单核细胞；前凝血剂)和细胞激活和攻击(PMNs)。另外，在靶位点通过活化的血小板的CD40配体(CD40L)的释放诱导由单核细胞的组织因子表达，其导致局部的高可凝固状态。
实施例8固相试剂还可以采取线圈或斯坦特固定模的形式。重组或哺乳动物来源的VWF可以与这些固相试剂结合并通过包括外科手术和/或通过导管的各种方法递送到靶脉管系统。使用特殊的导管和相关的导线通过血流可以到达靶位点，如动脉瘤。通过进入位点如股动脉将导线导入血管系统并轻轻挤过主要血管至靶位点。在导线上将导管引至靶位点，于是移去导线。然后将固相血小板结合线圈挤过导管的腔至使用它的动脉瘤。与线圈结合的VWF特异性地结合在血流中流动的血小板。血小板在线圈周围迅速激活和累积，由此形成局部的固定血栓，而又降低动脉瘤破裂的危险。实施例9-颗粒固定的VWF在猪模型中的急性作用本研究是设计来评估包被人VWF的颗粒在猪肾的脉管系统中诱导血栓形成的有效性。在该过程中，使用20-22规格的血管导管将导管插入肾动脉。通过外科手术暴露肾脉管并将多普勒流量探针(Doppler flow probe)附着于肾脉管以监测血液流进和流出靶器官。在从肾动脉和静脉采取的流量读数之间未发现显著的差异；因此，从肾静脉进一步采取所有的读数以显示通过靶肾的血流量。通过与戊二醛过夜温育将人VWF与人MAA共价结合。改变基于每重量蛋白质基础上的、与MAA结合的VWF的量的先前滴定研究已经确定1∶5-1∶80(MAA∶VWF)的比率提供足够的固定的VWF以诱导血小板结合和激活。在这个基础上，选择1∶20(MAA∶VWF)的比率用于体内研究。通过相差显微镜术的颗粒分析证明最终制剂中的颗粒大小为30μm-250μm(如通过使用测微计/血细胞计数器通过光学显微镜估计)。
注射MAANWF(500μl或1ml)接着人PRP(500μl，包含约200-400×106个血小板)于猪的肾动脉导致血流量的显著减少。在检验试剂后将人血小板注射至人体内尽可能接近近似的状况。另外，注意到猪血小板与人VWF的结合非常弱(参见实施例6，上面)。在注射检验试剂的10分钟内，血流量已经降低至小于基线水平的一半。在注射检验试剂的15分钟内，血流量已经降低至小于基线值的20％。在90分钟的监视期内向器官的血流量未增加。
相反，注射于对侧肾的肾动脉之中的对照试剂(仅MAA；相同蛋白质浓度)显示血流量瞬时减小。血流量开始减小50％，但迅速恢复至接近基线水平，即在15分钟内＞80％的最初血流量和在30分钟内＞90％的最初血流量。
靶脉管系统的组织学检查显示在检验器官的肾动脉的最接近的分支中的大血栓，和在对照肾中的肾脉管系统的较小血栓形成。在对照或检验动物的肝脏，肺，脾，脑，心脏和眼中未发现血栓。
实施例10-颗粒固定的VWF在猪模型中的慢性作用以类似于在实施例9中概述的方法的方式，使用20-22规格的血管导管将导管插入2头检验和2头对照猪的肾动脉。将多普勒流量探针通过外科手术放置在每只动物的肾静脉上，在闭合最初的切口后将导线暴露在动物的外皮上。在建立流过受侵袭的肾的血液的基线后，将1ml MAA∶VWF颗粒(11mg总蛋白)接着1mL富含人血小板的血浆(约460×106个血小板(血小板量458×109/升)注射到检验动物的肾动脉中，将等量的MAA注射到对照动物中。将动物转移至代谢板条箱(crate)并在7天期间在不同时间间隔监视。下表表示来自这些研究的血流量结果。
猪多普勒血流量(毫升每分钟)
组织学检查对照和检验动物的主要器官和组织以证明血栓形成和其它治疗相关损伤。除了在靶肾的肾脉管系统中以外未观察到血栓形成。
实施例11-用高锝酸钠Tc 99m标记MAA/VWF通过使用戊二醛(0.0625％v/v，最终)将人VWF(来源Alphanate，Alpha Therapeutics Corp.)与MAA颗粒(11mg蛋白质；来源注射用MAA，Edmonton Radiopharmaceutical Centre)结合来制备MAA/VWF颗粒。蛋白质比率为40∶1-20∶1(MAA∶VWF)。通过在500rpm下搅拌10分钟用MAA/VWF颗粒激发来自健康的未用药治疗的(大于2周)志愿者的柠檬酸盐富含血小板的血浆和柠檬酸盐全血来检验颗粒的功能性(10μl颗粒+100μl血小板来源)。通过相差显微术观察反应证实颗粒结合和激活血小板，形成大团血小板和MAA/VWF颗粒的能力。
然后使用88MBq-300MBq的活性用高锝酸钠Tc 99m标记MAA/VWF颗粒。在室温下将等体积盐水中的颗粒和高锝酸钠Tc 99m温育10分钟。使用薄层层析测定标记效率，发现超过95％。
然后检验Tc 99m标记的MAA/VWF颗粒以评估标记对颗粒功能性的影响。相差显微术证实Tc 99m标记的MAA/VWF颗粒能够结合和激活血小板。在标记颗粒的功能活性方面没有明显减小。
实施例12-猪肾脉管系统的MAA/VWF血栓形成的荧光镜透射研究使用股动脉方法将MAA/VWF递送到猪肾脉管系统。在全身麻醉(氟烷)后将5-Fr的鞘导管插入18-20kg小猪的股动脉中并通过荧光镜透视引导至左肾动脉。将导管定位以使在对比染料递送后，仅显现肾脉管系统的下极(lowerpole)。在时间零点，将1ml MAA/VWF颗粒(30-250微米大小)缓慢(10秒以上)递送至肾脉管系统。十(10)秒后递送1ml人PRP(420×109每升)，用1ml盐水冲洗导管。将导管保持在原位，在二十(20)分钟等待期后再次将造影剂(contrast agent)递送到靶脉管系统。观察到造影剂在导管末端汇集，然后迅速移动至肾上极(upper pole)的脉管系统中。肾下极的脉管系统缓慢累积未消散的(大于20分钟)造影剂，而上极脉管系统迅速失去造影剂(小于5秒)。在动物麻醉和导管仍在原位的同时，将受侵袭的肾通过外科手术暴露，正好邻近导管夹紧肾脉管系统，摘除受侵袭的肾。通过纵向切口将肾动脉打开并朝肾的方向解剖。在延伸至肾下极脉管系统内部深处的导管尖端的远端注意到大的血栓。在肾上极的脉管系统中未注意到凝固。另外，受侵袭的肾的下极显著地变白，显示缺乏血流，而肾的上极显示正常红色。
在接着上述步骤的分开的实验中将导管导至靶肾下极的脉管系统和用来递送1ml MAA/VWF颗粒，接着1ml人PRP。在20分钟后向肾下极的血流明显地被阻止，如通过荧光镜透视所确定。如上，在导管尖端汇集后对比染料迅速移动到上极脉管系统。然后将导管再定位和将MAA/VWF接着人PRP递送到上极脉管系统。在20分钟等待期后再次注射对比染料。荧光镜透视显示向上极脉管系统的血流被阻断。对比染料未进入下极脉管系统。然后在杀死动物之前通过外科手术摘除具有相关肾脉管的靶肾。肾的立即解剖显示在肾的上极和下极中血管大量的血栓形成。
尽管已经依据具体的优选实施方案描述本发明，它不限于那些实施方案。特别是按照前面的教导，本领域的技术人员可以完成备选的实施方案，实施例，和变体，其仍将被包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种治疗血管化肿瘤或增生组织的方法，其包含向具有血管化肿瘤或增生组织的哺乳动物施用包含结合剂的固相试剂，所述结合剂能够结合血小板，和随后体内诱导血栓，其包含通过血小板与固定在所述固相试剂上或内部的血小板结合剂结合来捕捉血小板，诱导血小板的激活，和使血栓形成。
2.权利要求1的方法，其中所述固相试剂是颗粒。
3.权利要求1的方法，其中所述固相试剂是线圈。
4.权利要求1的方法，其中所述固相试剂是斯坦特固定模。
5.权利要求1的方法，其中所述血小板结合剂是重组VWF。
6.权利要求1的方法，其中所述血小板结合剂是哺乳动物VWF。
7.权利要求6的方法，其中所述VWF是人源的。
8.权利要求6的方法，其中所述VWF是猪源的。
9.权利要求1的方法，其中所述固相试剂包括靶向部分。
10.权利要求9的方法，其中所述靶向部分是针对靶脉管系统上的抗原。
11.权利要求1的方法，其中所述固相试剂包含生物素或抗生物素蛋白或其模拟物或衍生物。
12.权利要求1的方法，其中所述固相试剂包含能够结合血小板的血小板特异性组分。
13.权利要求12的方法，其中所述血小板特异性组分包含选自天然的或合成的von Willebrand因子，骨桥蛋白，血纤蛋白原，血纤蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，胶原，血小板反应蛋白，层粘连蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，磷脂酶A2，基质金属蛋白酶，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，p-选择蛋白配体，MAC-1，LFA-1，上述任何一项的部分，和上述任何一项的功能等价物的组分中的至少一种。
14.权利要求13的方法，其中所列组分偶联或包含单独或组合的例如生物素模拟物，肽，人Fc片段的部分。
15.一种用于体内诱导血栓形成的组合物，其包含固相试剂，所述固相试剂包含血小板特异性组分；其中经递送到靶脉管系统，所述血小板结合组分结合血小板到所述固相试剂，诱导血小板激活并使血栓形成。
16.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂是颗粒。
17.权利要求16的组合物，其中所述颗粒是微球粒。
18.权利要求16的组合物，其中所述颗粒是大分子聚清蛋白。
19.权利要求18的组合物，其中所述颗粒大小为约5-约500微米。
20.权利要求18的组合物，其中所述颗粒大小为约30-约150微米。
21.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂是线圈。
22.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂是斯坦特固定模。
23.权利要求15的组合物，其中所述血小板特异性组分包含选自天然的或合成的von Willebrand因子，骨桥蛋白，血纤蛋白原，血纤蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，胶原，血小板反应蛋白，层粘连蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，磷脂酶A2，基质金属蛋白酶，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，p-选择蛋白配体，MAC-1，LFA-1，上述任何一项的部分，和上述任何一项的功能等价物的组分中的至少一种。
24.权利要求15的组合物，其中所述血小板特异性组分是重组VWF。
25.权利要求15的组合物，其中所述血小板特异性组分是哺乳动物的VWF。
26.权利要求15的组合物，其中所述血小板特异性组分是人源的。
27.权利要求15的组合物，其中所述血小板特异性组分是猪源的。
28.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂包含靶向部分。
29.权利要求15的组合物，其中所述靶向部分是针对靶脉管系统上的至少一种抗原。
30.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂另外包含用于将血小板与所述固相试剂结合的配体。
31.
32.权利要求15的组合物，其中所述固相试剂是用高锝酸钠Tc 99m放射性标记。
33.一种用于诱导血栓形成的组合物，其包含固相血小板结合试剂，所述固相血小板结合试剂具有第一结合组分和第二结合组分，所述第一结合组分包含将所述固相试剂与配体/受体复合体结合而不与单独的所述配体或受体结合的结合区；所述第二结合组分包含用于血小板的结合区。
34.一种用于诱导血栓形成的组合物，其包含固相血小板结合试剂，所述固相血小板结合试剂聚第一结合组分和第二结合组分，所述第一结合组分包含将所述结合组分与预定位点上的表位结合的结合区；所述第二结合组分包含用于血小板的结合区。
35.一种用于体内诱导血栓形成的试剂盒，其包含固相试剂和下列各项中的至少一种用于结合血小板的结合剂；具有血小板特异性组分的固相试剂；用于结合所述结合剂的配体；配体偶联物；用于结合所述配体或所述配体偶联物的抗-配体；血小板结合增强剂；血栓形成调制剂；补体级联组分；补体级联组分诱导物；和包括抗-配体的用于结合血小板的结合剂；放射性核素；造影剂；及其组合。
全文摘要
本发明通常涉及用于靶向和递送固相血小板依赖型血管闭塞试剂的方法和组合物。特别是，将包被血小板结合剂的颗粒或线圈或斯坦特固定模导至靶脉管系统，如实体瘤块或AV－畸形或动脉瘤或内漏的脉管系统；固相试剂然后结合和激活血小板，其又结合和激活其它血小板。该过程导致在固相试剂周围迅速形成血小板介导的血栓，致使血管闭塞。
文档编号A61L24/10GK1612724SQ02822461
公开日2005年5月4日 申请日期2002年9月11日 优先权日2001年9月12日
发明者迈克尔·W·斯图尔特, 罗兰·亨里克·珀森, 安托万·A·努杰姆 申请人:维日克斯医药公司