专利名称：用复合酶酶解牡蛎制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法。
背景技术：
蛋白酶抑制剂是一类具有肿瘤抑制活性的物质，目前牛肺胰蛋白酶抑制剂和人尿胰蛋白酶抑制剂已经被开发成肿瘤的辅助药物，广泛应用于临床。国外已有人以太平洋褶柔鱼、鲣鱼、河豚鱼、对虾、白姑鱼、长蛇鲻鱼等水产品为原料，分别从其肝脏、卵、表皮粘液和肌肉中分离到了蛋白酶抑制剂，所得产品主要应用于疾病的预防和治疗。但是，迄今尚未见从蛋白水解物中提取蛋白酶抑制剂的报道。目前存在的问题主要是天然胰蛋白酶抑制剂的含量非常有限，而且提取比较困难。

发明内容
本发明的目的是提供一种用复合酶定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，它能弥补现有技术的上述不足。
一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是将牡蛎肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl缓冲液打浆，按照550～650U/g肉的比例加入风味碱性蛋白酶，恒温搅拌，在45～55℃下酶解1～2小时，然后灭酶，冷却；用盐酸调pH至5-6，按照650-750U/g肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，45-55℃下恒温酶解1-2小时，灭酶，冷却，离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯化后，冻干。
本发明以低值的牡蛎为原料，利用风味碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶复合酶解制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽，所得产物活性高，对商品胰蛋白酶活性的抑制率可达67％。
具体实施例方式将牡蛎肉加入2～4倍，最好是3倍肉重的Tris-HCl缓冲液(0.05M、pH8.5)中打浆，体系最初pH为8～9，最好是8.5。按照550～650U/g肉，最好是600U/g肉的比例加入风味碱性蛋白酶(Alcalase)，在45～55℃，最好是50℃下恒温搅拌，酶解1～2小时，最好是1小时，然后100℃灭酶，冷却至40-50℃，最好45℃；用盐酸调pH至5-6，最好是5.5，按照650-750U/g肉，最好是700U/g肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，在45-55℃，最好是50℃下恒温酶解1-3小时，最好是2小时，然后100℃灭酶，冷却至常温，4000r/min以上的转速下离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯化后，冻干即得到具有胰蛋白酶抑制活性的肽(分子量≤10k)。
权利要求
一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是将牡蛎肉加入2～4倍肉重的Tris-HCl缓冲液打浆，按照550～650U/g肉的比例加入风味碱性蛋白酶，恒温搅拌，在45～55℃下酶解1～2小时，然后灭酶，冷却；用盐酸调pH至5-6，按照650-750U/g肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，45-55℃下恒温酶解1-2小时，灭酶，冷却，离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G-25柱层析分离纯化后，冻干。
全文摘要
一种用复合酶分步定向酶解牡蛎制取具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法，其特征是将牡蛎肉加入2～4倍肉重的Tris－HCl缓冲液(0.05M、pH8.5)打浆，按照550～650U/g肉的比例加入风味碱性蛋白酶，恒温搅拌，在45～55℃下酶解1～2小时，然后灭酶，冷却；用盐酸调pH至5－6，按照650－750U/g肉的比例加入菠萝蛋白酶，搅拌，45－55℃下恒温酶解1－2小时，灭酶，冷却，离心，取上清液经过10k超滤膜和Sephadex G－25柱层析分离纯化后，冻干。本发明以低值的牡蛎为原料，利用风味碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶复合酶解制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽，所得产物活性高，对商品胰蛋白酶活性的抑制率可达67％。
文档编号A61P35/00GK1724683SQ20051004415
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者曾名湧, 崔海英, 刘尊英, 董士远 申请人:中国海洋大学