专利名称：脑蛋白水解物溶液提取新方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种脑蛋白水解物溶液的提取方法。
背景技术：
脑蛋白水解物注射液原液为淡黄色的澄明液体，为猪脑组织提取、分离、精制而得，内含约16种游离氨基酸，并含少量肽；是一种大脑所特有的肽能神经营养药物，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化， 并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。脑蛋白水解物注射液原液可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统，提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。还可透过血脑屏障进入神经细胞，氨基酸在脑内迅速代谢，T1/2由数秒至数小时。目前提取脑蛋白水解物注射液原液的方法一般有以下几种1、多酶提取法是目前市场最常用的脑蛋白水解物溶液的提取方法，一般是先胃酶或胃蛋白酶水解，再使用胰酶或胰蛋白酶水解。该方法水解最大的缺点就是水解不彻底， 直接影响产品的氨基酸含量，所以后续生产过程中额外需添加氨基酸，以达到符合国家规定标准。2、酶法+酸水解提取法该方法是建立在多酶提取法的基础上，在继续使用酸水解，一般采用6M盐酸来水解，从而达到提高氨基酸含量的目的；但该方法最大的缺点在于， 酸水解会破坏产品中色氨酸，因此在产品质量标准中色氨酸含量不符合质量标准，同时该产品质量标准中的鉴别项也不符合规定。3、酶法+碱水解提取法该方法同样是建立在多酶提取法的基础上，再继续使用碱水解，一般采用6M氢氧化钠来水解，从而达到提高氨基酸含量的目的；但该方法最大的缺点在于，碱水解虽不会破坏产品中色氨酸，但产品中其余氨基酸的结构会因为碱水解而消旋，从而变成对人体无用的D型氨基酸。因此对产品的疗效影响很大。

发明内容
本发明针对技术不足，提出一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，在提高氨基酸含量目的的同时，又保留了色氨酸，并且不改变氨基酸的结构。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤①、取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑、脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用纯化水或注射用水清洗干净，加1 2倍纯化水或注射用水胶体磨勻浆2 3次； ②、取步骤①的勻浆液，加热至35 45°C，调节PH值7. 5 8. 5，加浆重0. 5 2. 5%的胰蛋白酶，搅拌反应2 8小时；调节pH值至2. 0 2. 5，加热至90°C以上，保温 10 30分钟，离心过滤；③、取步骤②离心上清液，按体积比1 3 1 3加入40 50wt%羟胺溶液，调节pH值至1. 5 2. 5，80 100°C密闭反应10 30小时；冷却至40°C以下，调节pH值至 6. 9 7. 5，离心过滤；④、取步骤③离心上清液，超滤，收集滤液。优选 的，步骤④超滤所使用的是分子量为8KD 20KD的超滤膜。优选的，步骤②胰蛋白酶的加入量为浆重的1%。优选的，步骤③羟胺溶液的加入量与上清液的体积比为1 1。与现有技术相比，本发明采用多酶水解结合羟胺裂解的方式来提取脑蛋白水解物溶液，该方法的原理在多酶提取法的基础上，但后续采用了羟胺做裂解，在提高氨基酸含量目的的同时，又保留了色氨酸同时不改变氨基酸的结构；利用羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之间的肽键(Asn-Gly)。在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键 (Asn-Pro) 0天冬酰胺和亮氨酸之间的肽键(Asn-Leu)与天冬酰胺和丙氨酸之间的肽键 (Asn-Ala)也能部分裂解。本发明提高了脑蛋白水解物注射液中氨基酸总量，以及提高了其中的肽含量，从而提高了该产品的质量标准，使之达到国家药品标准。
具体实施例方式一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤步骤一取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑及脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用纯化水或注射用水清洗干净，加1 3倍纯化水或注射用水胶体磨勻浆2 3次。步骤二 取勻浆液，加热至35 45 °C，用氢氧化钠调节pH值7. 5 8. 5，加浆重
0.5 2. 5%的胰蛋白酶，搅拌反应2 8小时。反应结束后，用盐酸调节pH值至2. 0 2. 5，加热至90°C以上，保温10 30分钟，离心过滤取上清。步骤三取离心上清液，按体积比1 1加入50%羟胺溶液，用盐酸调节pH值至
1.5 2. 5，80 100°C密闭反应10 30小时，反应结束后冷却至40°C以下，用氢氧化钠调节pH值至6. 9 7. 5，离心过滤取上清。步骤四取离心上清液，用分子量8KD 20KD的超滤膜超滤，收集滤液按脑蛋白水解物注射液国家药品标准检测。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。实施例1一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤①、取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑及脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用纯化水清洗干净，加1倍纯化水胶体磨勻浆3次。②、取勻浆液，加热至45°C，用氢氧化钠调节pH值7. 5，加浆重2. 5%的胰蛋白酶， 搅拌反应2小时。反应结束后，用盐酸调节pH值至2. 5，加热至95°C，保温30分钟，离心过滤取上清。③、取离心上清液，按体积比1 1加入50衬％羟胺溶液，用盐酸调节？!1值至2.5， 80°C密闭反应30小时，反应结束后冷却至30°C，用氢氧化钠调节pH值至7. 5，离心过滤取上清。
④、取离心上清液，用分 子量20KD的超滤膜超滤，收集滤液；按脑蛋白水解物注射液国家药品标准WSi-(X-OIS)-ZOOIZ进行检测，结果见下表1。实施例2一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤①、取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑、脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用注射用水清洗干净，加2倍纯化水或注射用水胶体磨勻浆2次；②、取勻浆液，加热至35°C，调节pH值8. 5，加浆重0. 5%的胰蛋白酶，搅拌反应8 小时；调节PH值至2. 5，加热至940C，保温10分钟，离心过滤；③、取步骤②离心上清液，按体积比3 1加入40衬％羟胺溶液，调节？!1值至2.5， 90°C密闭反应20小时；冷却至33°C，调节pH值至7. 2，离心过滤；④、取步骤③离心上清液，用分子量8KD的超滤膜超滤，收集滤液；按脑蛋白水解物注射液国家药品标准WSi-(X-OIS)-ZOOIZ进行检测，结果见下表1。实施例3—种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤①、取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑、脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用注射用水清洗干净，加1. 5倍纯化水或注射用水胶体磨勻浆3次；②、取勻浆液，加热至40°C，调节pH值8. 0，加浆重1 %的胰蛋白酶，搅拌反应5小时；调节PH值至2. 2，加热至98°C，保温20分钟，离心过滤；③、取步骤②离心上清液，按体积比1 3加入45衬％羟胺溶液，调节pH值至2.0， 92 °C密闭反应15小时；冷却至37°C，调节pH值至6. 9，离心过滤；④、取步骤③离心上清液，用分子量12KD的超滤膜超滤，收集滤液；按脑蛋白水解物注射液国家药品标准WSi-(X-OIS)-ZOOIZ进行检测，结果见下表1。表1为各实施例产品的检测情况
权利要求
1.一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，包括以下步骤①、取新鲜或冷冻猪脑，摘除小脑、脑干，并去除大脑脑组织表面的筋膜，用纯化水或注射用水清洗干净，加1 2倍纯化水或注射用水胶体磨勻浆2 3次；②、取步骤①的勻浆液，加热至35 45°C，调节pH值7.5 8. 5，加浆重0. 5 2. 5% 的胰蛋白酶，搅拌反应2 8小时；调节pH值至2. 0 2. 5，加热至90°C以上，保温10 30 分钟，离心过滤；③、取步骤②离心上清液，按体积比1 3 1 3加入40 50衬％羟胺溶液，调节pH 值至1. 5 2. 5，80 100°C密闭反应10 30小时；冷却至40°C以下，调节pH值至6. 9 7. 5，离心过滤；④、取步骤③离心上清液，超滤，收集滤液。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤④超滤所使用的是分子量为 8KD 20KD的超滤膜。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②胰蛋白酶的加入量为浆重的1%。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤③羟胺溶液的加入量与上清液的体积比为1:1。
全文摘要
本发明公开了一种脑蛋白水解物溶液的提取方法，采用多酶水解结合羟胺裂解的方式来提取脑蛋白水解物溶液，在多酶提取法的基础上，但后续采用了羟胺做裂解，在提高氨基酸含量目的的同时，又保留了色氨酸，并且不改变氨基酸的结构；利用羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之间的肽键；在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键；天冬酰胺和亮氨酸之间的肽键与天冬酰胺和丙氨酸之间的肽键也能部分裂解。本发明提高了脑蛋白水解物注射液中氨基酸总量，以及提高了其中的肽含量，从而提高了该产品的质量标准，使之达到国家药品标准。
文档编号A61P25/28GK102302767SQ20111022733
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者刘保林, 周正兵, 高留根 申请人:杭州华津药业股份有限公司