专利名称：一种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学工程和智能高分子材料领域，具体涉及ー种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用。
背景技术：
长期以来，供体紧缺和移植排斥反应是器官移植发展的两大障碍。目前使用的天然材料与人工合成支架材料因強度低和降解产生炎症等问题导致其临床应用疗效欠佳。细胞片层技术是组织工程中收获种子细胞的ー项新技术，无需支架即可成功移植，避免了传统支架材料移植后引发的免疫源性、诱发炎症反应、光学干渉等问题。
细胞片层(Cell Sheet)医疗是将患者自身的细胞取出后在培养皿中培养，然后将増殖成的片层移植于患部，促使患部器官再生的技木。当细胞片层贴在因重病或重伤而导致功能无法恢复的器官上时，被称为细胞因子的相当于生长激素的物质便会从细胞片层中分泌出来，促使毛细血管扩张，受损的细胞将复活重现。由于它是患者自身的细胞，因此不产生排斥反应。通过细胞片层技术能使糖尿病、牙周病、肺气漏、肝功能障碍和关节功能障碍等病的患者得到治愈的可能性大大提高。中国专利CN101896600A公开了ー种图案化的细胞片层和其生产方法。所述方法包括步骤提供布置在基底上的连续的细胞片层，所述基底包含形状转变性质和/或可改变的表面特性；使所述连续的细胞片层以图案化方式暴露于释放剂；在暴露于所述释放剂之后洗涤所述细胞片层，以除去已被所述释放剂影响的细胞，和使用第二细胞类型重新填充在被所述释放剂影响的细胞已被除去之后留下的缺ロ。聚异丙基丙烯酰胺(polyN-isopropylacrylamide, PNIPAAm)具有温度敏感性能，其体积相转变温度为 32。。。Yamato等(Tissue Eng.，2001，7 :473.)将PNIPAAm接枝到细胞培养板表面，于37°C条件下接种上细胞，由于PNIPAAm具有疏水性，因而细胞可进行黏附、伸展和増殖；当降低温度至32°C以下，PNIPAAm具有亲水性，体积膨胀，细胞与培养板表面分离，整体细胞群则在保持细胞间连接状态下以片状形态脱附，从而获得保留细胞活性的细胞片层。通过改变温度收获细胞片层避免了酶消化法对细胞造成的生物学功能损伤，并可直接黏附到组织上而无需縫合，同时避免了支架材料降解成分对细胞的伤害。水凝胶是由亲水性聚合物链构造的具有三维交联网络结构的高聚物和介质组成的多元体系，在药物控释、软组织支架构建和细胞包载等生物医用材料方面具有良好的应用前景。水凝胶材料作为填充缺损型支架、生物活性分子控制释放载体以及组织/细胞的转载系统，正朝向智能化方向发展。温度敏感水凝胶是其体积随环境温度变化而改变的高分子水凝胶；pH敏感水凝胶是其体积随环境pH值变化而改变的高分子水凝胶，这类凝胶大分子网络中具有可解离成离子的基团(羧基、磺酸基或氨基)，可根据环境PH值变化夺取或释放质子。利用温度或PH响应水凝胶的软湿特性和敏感特性，则可通过改变温度或pH值实现细胞的片层脱附。纯的合成水凝胶细胞相容性较差，在合成水凝胶中弓I入天然生物相容性单体如胶原、壳聚糖和丝胶等，则可促进细胞的増殖和脱附。由上分析可以看出，目前尚无将温敏性或pH敏感性水凝胶、生物相容性高分子和细胞片层脱附技术相结合的报道。本发明综合考虑了水凝胶的温度或PH值敏感特性和软湿特性，以及生物相容性高分子良好的细胞相容性，以去离子水作为溶剂，采用自由基聚合，制得可通过调节温度或PH值实现细胞片层自动脱附的水凝胶，并可应用于皮肤、角膜上皮和牙周膜韧带等组织和器官的治疗与修复。

发明内容
本发明拟解决的技术问题是为有效促进细胞黏附，避免传统的酶解法对细胞活性和功能等造成的损伤，同时降低与传统组织工程相关的并发症，如炎症反应等，提供可应用于生物医学工程的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，该水凝胶既具有良好的生物相容性，能促进细胞快速増殖，又具有优异的温度或PH值响应性能，仅通过改变温度或pH值凝胶便可快速在亲水性和疏水性之间变化，从而实现细胞増殖和脱附的智能调控。本发明的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，由功能単体Ml、化学或物理交联剂M2和水溶性生物高分子M3溶于溶剂M4中采用氧化还原引发体系进行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3 和 M4 的质量百分比为 Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3 :1-15%, M4 :60-90%，改变温 度或PH值后细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。所述的Ml具有温度敏感性或pH值敏感性，为N-异丙基丙烯酰胺或N，N’ -双こ基丙烯酰胺或双こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー种，以及其共混物。所述的M2是化学交联剂或物理交联剂，为N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或锂皂石或镁皂石或锌皂石或硅酸镁锂中的ー种，以及其混合物。所述的M3是水溶性生物高分子，为淀粉或羧甲基纤维素钠或海藻酸钠或壳聚糖或腐植酸钠或明胶或瓜儿胶或聚こ烯吡咯烷酮或β-环糊精或丝胶蛋白中的ー种，以及其混合物。所述的Μ4为去离子水。所述的水凝胶脱附细胞为小鼠成纤细胞或角膜细胞或骨骼肌细胞或骨髄间充质干细胞或皮肤纤维原细胞或人脐静脉内皮细胞或大鼠胰岛细胞或牙周膜干细胞中的ー种。所述的水凝胶在温度为3_15°C或pH值为2-5时增殖的细胞从水凝胶表面迅速脱附，形成细胞片层。所述的水凝胶智能脱附后的细胞片层植入受区位点、通过同型或异型细胞片层的叠加而构建三维结构的组织。所述的水凝胶智能脱附后的细胞片层在皮肤、角膜上皮和牙周膜韧带组织或器官的治疗与修复中的应用。本发明的原理是温敏或pH值响应水凝胶具有良好的温度和pH值敏感性，在环境温度分别高于或低于相转变温度或临界PH值时，凝胶会发生亲疏水的变化，其体积发生收缩或溶胀现象。高温或低PH值时，由于疏水基团起主导作用或酸根离子质子化，凝胶宏观表现为体积收缩，同时由于水凝胶含有生物相容性高分子，细胞在凝胶表面快速黏附、铺展、増殖达到一定的数量后，将环境温度降到相转变温度以下或环境PH值升到临界pH值以上，这时凝胶体积膨胀，贴附在凝胶表面的细胞自动脱附，从而得到具有高活性的细胞片层，转载至皮肤等组织缺损处可快速増殖。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(I)本发明可用于细胞片层智能脱附的水凝胶成分简单，操作方便，具有优良的温度或PH值响应特性，以及生物相容性，可有效促进细胞的快速增殖和脱附。(2)水凝胶的细胞相容性和细胞増殖或脱附速率可通过单体投料比、交联度和反应温度等来调控。·(3)细胞片层脱附简便易行，仅仅通过控制温度或pH值就可以实现细胞的自动脱附，从而避免了传统的酶解法对细胞活性、功能等造成的损伤。(4)获得的细胞片层保留了完整细胞外基质，不需支架材料，通过相同或不同的细胞片层相互层叠而获得全细胞的三维组织，克服了传统组织工程支架降解的弊端，在牙周和皮肤组织再生等领域具有良好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步详细阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置換方式，都包含在本发明的保护范围之内。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例Iー种细胞片层智能脱附水凝胶，由N-异丙基丙烯酰胺、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺和羧甲基纤维素钠溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的异丙基丙烯酰胺、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、羧甲基纤维素钠和去离子水的质量百分比为80%，降低水凝胶环境温度为5°C，増殖7天的皮肤纤维原细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的皮肤纤维原细胞片层可用于烧烫伤皮肤表皮的治疗与修复。实施例2—种细胞片层智能脱附水凝胶，由N-异丙基丙烯酰胺、锂皂石和海藻酸钠溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的异丙基丙烯酰胺、锂皂石、海藻酸钠和去离子水的质量百分比为11%，降低水凝胶环境温度为4°C，増殖7天的角膜细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的角膜细胞片层可用于角膜的治疗与修复。实施例3ー种细胞片层智能脱附水凝胶，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和腐植酸钠溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酷、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、腐植酸钠和去离子水的质量百分比为8%，3%，4%，85%,降低水凝胶环境温度为3°C，増殖7天的骨髓间充质干细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的骨髓间充质干细胞片层可用于硬皮病的治疗与修复。实施例4
ー种细胞片层智能脱附水凝胶，由N，N’ -双こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯和聚こ烯吡咯烷酮溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的N，N’ -双こ基丙烯酰胺、ニ甲基丙烯酸こニ醇酯、聚こ烯吡咯烷酮和去离子水的质量百分比为10 %，4%，6 %，80%，降低水凝胶环境温度为4°C，増殖7天的人脐静脉内皮细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的人脐静脉内皮细胞片层可用于心肌组织的治疗与修复。实施例5ー种细胞片层智能脱附水凝胶，由异丙基丙烯酰胺和丙烯酸(质量比为3 I)的共混物、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺/锂皂石的混合物和丝胶蛋白溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的共混物、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、丝胶蛋白和去离子水的质量百分比为12%，6%，12%，80%，降低水凝胶环境温度为5°C，増殖7天的牙周膜干细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的牙周膜干细胞片层可用于牙周炎的治疗与修复。 实施例6ー种细胞片层智能脱附水凝胶，由甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物(质量比为4 I)、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和壳聚糖溶于去离子水中采用过硫酸氨/四甲基こニ胺引发体系进行自由基聚合而成，所述的甲基丙烯酸N，N- ニ甲氨基こ酯和甲基丙烯酸的共混物、N, N’ -亚甲基双丙烯酰胺、壳聚糖和去离子水的质量百分比为14%,8%, 3%, 75%,降低水凝胶环境温度为3°C，増殖7天的皮肤纤维原细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。脱附后的皮肤纤维原细胞片层可用于烧烫伤皮肤表皮的治疗与修复。
权利要求
1.ー种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用，其特征在于由功能単体Ml、化学或物理交联剂M2和水溶性生物高分子M3溶于溶剂M4中采用氧化还原引发体系进行自由基聚合而成，所述的Ml、M2、M3和M4的质量百分比为Ml :8-15%, M2 :1-10%, M3M4 60-90%,改变温度或pH值后细胞从水凝胶表面脱附，形成片层结构。
2.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的Ml具有温度敏感性或pH值敏感性，为N-异丙基丙烯酰胺或N，N’ -双こ基丙烯酰胺或双こ氧基丙烯酰胺或甲基丙烯酸N，N-ニ甲氨基こ酯或丙烯酸或甲基丙烯酸或衣康酸中的ー种，以及其共混物。
3.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的M2是化学交联剂或物理交联剂，为N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺或ニ甲基丙烯酸こニ醇酯或哌臻丙烯酰胺或戊ニ醛或锂皂石或镁皂石或锌皂石或硅酸镁锂中的ー种，以及其混合物。
4.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的M3是水溶性生物高分子，为淀粉或羧甲基纤维素钠或海藻酸钠或壳聚糖或腐植酸钠或明胶或瓜儿胶或聚こ烯吡咯烷酮或β -环糊精或丝胶蛋白中的ー种，以及其混合物。
5.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的Μ4为去离子水。
6.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的水凝胶脱附细胞为小鼠成纤细胞或角膜细胞或骨骼肌细胞或骨髓间充质干细胞或皮肤纤维原细胞或人脐静脉内皮细胞或大鼠胰岛细胞或牙周膜干细胞中的ー种。
7.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的水凝胶在温度为3-15°C或pH值为2-5时增殖的细胞从水凝胶表面迅速脱附，形成细胞片层。
8.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶，其特征在于所述的水凝胶智能脱附后的细胞片层植入受区位点、通过同型或异型细胞片层的叠加而构建三维结构的组织。
9.根据权利要求I所述的ー种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用，其特征在于所述的水凝胶智能脱附后的细胞片层在皮肤、角膜上皮和牙周膜韧带组织或器官的治疗与修复中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用。所述水凝胶由功能单体M1、化学或物理交联剂M2和水溶性生物高分子M3溶于溶剂M4中采用氧化还原引发体系进行自由基聚合而成，所述的M1、M2、M3和M4的质量百分比为M15-10％，M22-10％，M31-15％，M475-92％。该水凝胶具有优良的温度或pH值响应特性，以及生物相容性，可有效促进细胞的快速增殖和脱附。脱附后形成的细胞片层保留了完整细胞外基质，避免了酶解法对细胞造成的生物学功能损伤和支架材料降解成分对细胞的伤害。本发明的水凝胶智能脱附后的细胞片层可用于皮肤、角膜上皮和牙周膜韧带相关组织和器官的治疗与修复。
文档编号A61L27/52GK102718928SQ201210228270
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者张青松, 王小召, 董盼盼, 陈莉, 鲁思 申请人:天津工业大学