专利名称：一种复肝宁片的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种复肝宁片的制备方法及应用。
背景技术：
复肝宁片记载于卫生部标准WS3-B-0786-91，由板蓝根114g、炒麦芽45g、柴胡 68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花114g、炒六神曲45g作为原料药制成,能舒肝健脾,清热利湿。用于乙型肝炎奥抗阳性属于肝旺脾虚，热毒较盛者。
现有技术中，尚未有复肝宁片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而采用打粉和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。发明内容
发明目的为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种复肝宁片的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种复肝宁 片在制备抑制人肺腺癌GLC-82细胞增殖药物中的应用。
技术方案本发明的目的是通过如下的方案实现的
—种复肝宁片的制备方法，由板蓝根114g、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花114g、炒六神曲45g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成取柴胡、金银花，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50。。，C02流量l_3ml/g生药· min，萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次48分钟，合并萃取液，浓缩，加到 DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
上述一种复肝宁片的制备方法，所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
上述一种复肝宁片的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
上述一种复肝宁片的制备方法，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度 40°C, CO2 流量 2ml/g 生药· min,萃取时间 160min。
上述复肝宁片在制备抑制人肺腺癌GLC-82细胞增殖药物中的应用。
现有技术中，复肝宁片每片O. 5g，每次6片，一日3次，采用本发明制备成的复肝宁片每片O. 5g，每次仅需3片，一日服用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
试验一、不同方法制备的复肝宁片中绿原酸含量的比较
1、仪器及试药本发明复肝宁片按实施例3方法制备，使用500g原料药，经提取制成1000片，每片重O. 5g。原复肝宁片，按部颁标准方法制备，使用500g原料药，经提取制成 1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、方法
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按绿原酸峰计算，应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取在60°C减压干燥4小时的绿原酸对照品适量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本发明复肝宁片和原复肝宁片，研细，混匀，取lg，精密称定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超声处理10分钟，离心，取上清液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得。
3、结果
结果表明，本发明复肝宁片中绿原酸的含量为1. 65mg/片；而原复肝宁片中绿原酸的含量为O. 29mg/片，在服用量减少的情况下，绿原酸含量有很大提高。
上述研究表明，采用本发明制备的复肝宁片，有效成分含量高于部 颁标准法制备的复肝宁片。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取板蓝根114g、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花114g、炒六神曲45g，将柴胡、金银花，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药· min，萃取时间 150min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中绿原酸的含量为1. 32mg/片。
实施例2
取板蓝根I Hg、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花I Hg、炒六神曲45g，将柴胡、金银花，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50°C，CO2流量3ml/g生药· min，萃取时间 180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中绿原酸的含量为1. 43mg/片。
实施例3
取板蓝根I Hg、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花I Hg、炒六神曲45g，将柴胡、金银花，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药· min，萃取时间 160min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
经检测，成品中绿原酸的含量为1. 65mg/片。
实施例4 :复肝宁片抑制GLC-82细胞增殖的实验研究资料
I实验材料
1.1实验用细胞株
人肺腺癌GLC-82细胞，南京正宽医药科技有限公司实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
1. 2实验药物
研究药物本发明复肝宁片按实施例3方法制备。
药液储液称取IOOmg复肝宁片，溶于5ml无水乙醇中，O. 2 μ m滤器过滤， 500 μ Idoff管分装，-20°C存储，同时O. 2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1. 3实验试剂
DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419);NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批号2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批号:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批号2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批号2010382);无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号080310182);MTT(Biosharp批号:0793) ;PBS (实验室自配)；
1. 4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号DM1L);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD 公司型号SPECTRAMAX 190) ;C02培养箱(FORMA型号3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANK)公司型号MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A);冰箱(西门子公司型号KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号ΚΑ-1000) ;0. 2μπι滤器(MILLIP0RE型号SLGP033RB) ;10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
2实验方法
I) GLC-82 细胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 进行常规培养(IOcm 培养皿)， 当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，IOOOrpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ I,培养板放入细胞培养箱中(37 °C，5%C02 )常规培养。
3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入复肝宁片溶液，继续培养24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，继续培养 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示
细胞增值抑制率(％)=(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
3统计处理
采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以 mean + S. D.表不。
4实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对GLC-82细胞增殖抑制有差异(p〈0. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0. 01)，当剂量达到 15-20mg/ml时有极显著性差异(Ρ〈0· 001)。
表I复肝宁片对GLC-82细胞增殖抑制影响研(X+SDJ
权利要求
1.一种复肝宁片的制备方法，由板蓝根114g、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂 45g、金银花114g、炒六神曲45g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成 取柴胡、金银花，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50。。，CO2流量l_3ml/g生药· min，萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到 DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,压片，制成1000片，每片重O. 5g。
2.根据权利要求1所述一种复肝宁片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述一种复肝宁片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分钟。
4.根据权利要求1所述一种复肝宁片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°C, CO2流量2ml/g生药· min,萃取时间160min。
5.根据权利要求1所述一种复肝宁片在制备抑制人肺腺癌GLC-82细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种复肝宁片的制备方法，由板蓝根114g、炒麦芽45g、柴胡68g、牡丹皮68g、山楂45g、金银花114g、炒六神曲45g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得绿原酸含量有很大提高，本发明还提供了复肝宁片在制备抑制人肺腺癌GLC-82细胞增殖药物中的应用。
文档编号A61P11/00GK102988836SQ201210378429
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者不公告发明人 申请人:卞毓平