专利名称：皮肤材料及其制备方法
皮肤材料及其制备方法
技术领域：
本是发明涉及生物医学领域，特别是一种皮肤材料及其制备方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、 化学性和病原微生物性的侵袭，具有重要的生理功能。由于炎症、溃疡、烧伤等因素造成的 皮肤损伤，严重的可危及生命。 目前的临床治疗方式有自体皮肤移植、异体皮肤移植以及异种皮肤移植。通过皮 肤移植可以挽救病人生命、并有助于创面愈合。表皮干细胞(ESC)等干细胞移植治疗，在正 常情况下，保证了皮肤的微环境和毛发生长，在组织损伤后参与其修复，同时其也是潜在的 多能干细胞，完全可以利用其构建出具有完整表皮、真皮、皮肤附属器的功能健全的人工皮 肤，实现创面由暂时性解剖修复向功能永久性修复的转变。 当烧伤面积超过50%时，由于自体皮肤来源有限，因此在大多数情况下无法应用 自体皮肤移植，而且自体皮肤移植给患者造成新的创伤，治疗费用巨大。尽管异体皮肤移植 和异种皮肤移植可以克服以上问题，充当临时的伤面覆盖物，但是伴随移植会产生排斥反 应和可能的一些移植疾病。尽管组织工程皮肤是最先进的组织工程产物，但是它缺乏天然 组织的功能。基因治疗的方法通过赋予新的功能以及提高细胞的功能，可以用来制造新一 代皮肤替代物。 尽管干细胞移植治疗和基因治疗等方法在临床应用上已经取得了巨大的成功，但 是仍有问题未能很好的解决，在愈合过程中由于细胞之间的生长和分化缺乏正确的诱导， 植入的细胞和新生细胞及周边的健康细胞之间的生长不同步，因而无法产生正常的皮肤附 属物。

发明内容
基于此，有必要提供一种能够调控细胞生长和分化的皮肤材料。 此外，还有必要提供一种能够调控细胞生长和分化的皮肤材料的制备方法。 —种皮肤材料，包括生物材料和携带光敏感基因和目的基因的细胞，所述细胞接
种于所述生物材料中。 在优选的实施例中，所述细胞为自体细胞、异体细胞或自体细胞和异体细胞的混 合物。 在优选的实施例中，所述细胞为表皮细胞、成纤维细胞、干细胞或前体细胞。
在优选的实施例中，所述光敏感基因包括兴奋型通道蛋白基因和/或抑制型通道 蛋白基因。 在优选的实施例中，所述兴奋型通道蛋白基因为ChR2、 ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因为NpHR。 在优选的实施例中，所述目的基因为人生长激素、表皮生长因子或成纤维细胞生
3长因子。 在优选的实施例中，所述生物材料为可降解型生物材料或非降解型生物材料。 在优选的实施例中，所述可降解型生物材料为家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯到的丝
胶、丝素及胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚乳
酸，或者脱细胞真皮基质；所述非降解型生物材料为聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙
烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纤维。 —种皮肤材料的制备方法，包括如下步骤 从健康皮肤中分离、消化组织，提取细胞； 制备转基因细胞； 将光敏感基因转染到细胞中； 将含有转基因的细胞接种于生物材料中，构建含有细胞的组织工程化皮肤。
在优选的实施例中，利用慢病毒作为载体转染编码光敏感离子通道蛋白基因到细 胞中。 在优选的实施例中，所述慢病毒载体为人体免疫缺损病毒、乳多空病毒、腺病毒、 牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒中的一种。 上述皮肤材料移植到创面后，使光敏感离子通道蛋白的基因的多核苷酸序列连接 一个细胞特异启动子，从而靶向性的特定细胞中表达，通过光照系统发出特定波长光的剌 激，调控特定细胞的活性，从而精确调控细胞的分化以及基因表达水平，使移植的皮肤材料 细胞和新生细胞与周围的健康细胞之间生长同步，产生正常的皮肤附属物，来促进创面愈 合和提高愈合速度。
具体实施方式
研究发现，光敏感基因Channelrhodopsin-2(ChR2)对波长为470nm左右的蓝光 敏感，表达ChR2的细胞在蓝光的剌激下，细胞膜对Na+等阳离子的通透性增加，离子进入细 胞，去极化，使兴奋细胞；而Helorhodopsin(NphR)对波长为580nm左右的黄光敏感，表达 NphR的细胞在黄光的照射下，细胞膜对C1—离子的通透性增加，导致细胞超极化，从而抑制 细胞活性。基于病毒转染的蛋白表达系统，利用细胞类型特异性的启动子，光敏感基因即可 在特定类型的细胞中表达。这样利用蓝光或黄光交替照射就可以在特定细胞亚群水平上在 生理的时间分辨率上控制细胞的活性，从而精确调控干细胞的分化以及基因表达水平。
—种皮肤材料，包括携带光敏感基因和目的基因的细胞和生物材料。借助来源于 微生物的光敏感基因来调控细胞的生长、分化和基因表达来促进创面愈合和提高愈合速 度。 光敏感基因是编码光敏感离子通道蛋白基因。编码光敏感离子通道蛋白基因 可以是编码兴奋型通道蛋白基因(Channelrhodopsin-2， ChR2)、编码抑制型通道蛋白 基因(Helorhodopsin， NpHR)、与ChR2具有相同功能的基因(如ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310)或者与NpHR具有相同功能的基因。 ChR2蛋白是一种视紫红质，起源于单细胞类绿藻莱茵衣藻 (ChlamydomonasReinhardtii)。视紫红质蛋白ChR2由一分子的视蛋白(Opsin)和一分子 称为视黄醛(retinal)的生色基团所组成。ChR2对蓝光(波长为472nm)敏感，蓝光将使Na+等阳离子进入细胞而兴奋细胞。NpHR是一种嗜盐菌紫质(Halorhodopsins) 。 NphR对黄光(波长为593nm)敏感，
黄光将使cr等阴离子进入细胞而抑制细胞。 编码的ChR2/NpHR的多核苷酸序列可操作地连接一个细胞特异的启动子，从而靶 向性的特定细胞中表达。 目的基因可以为人生长激素、表皮生长因子或成纤维细胞生长因子等。目的基因 可以转染到与创面愈合相关的细胞中，使其大量表达相应的有生物活性的蛋白，从而促进 创面愈合的速度和提高创面愈合的质量。 细胞可以是自体细胞、异体细胞或其混合物，如表皮细胞、成纤维细胞、干细胞或 前体细胞等。 生物材料可以是可降解型生物材料，例如家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯到的丝胶、 丝素及胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸(PLA)，或者脱细胞真皮基质；也可以是非降解型生物材料，如聚酰胺、聚酯、 聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝酸纤维等。
皮肤材料制备方法如下 Sl，从健康皮肤中分离、消化组织，提取细胞。健康皮肤可以取自自体或异体。另 外，还可以进行细胞鉴定，并进行细胞原代培养和传代，例如进行形态学、细胞表型和致癌 性等细胞鉴定。 S2，制备转基因细胞。选择能促进创面愈合的目的基因，如人生长激素、表皮生长 因子、成纤维细胞生长因子等，转染到创面愈合密切相关的细胞中，使其大量表达相应的有 生物活性的蛋白，以促进创面愈合的速度和提高创面愈合质量。 S3，将光敏感基因转染到细胞中。本实施方式中，利用重组慢病毒载体等将携带编 码光敏感离子通道蛋白基因转染到目的细胞中。慢病毒载体克服了逆转录病毒只能感染分 裂期细胞的特点，可感染分裂期和非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、感 染效率高。对慢病毒载体进行了基因工程改造，使慢病毒的生活周期的复制能力失活。在病 毒DNA不整合至宿主细胞染色体的情况下实现慢病毒表达，由此减小了插入诱变的风险。 经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，可以兼容多个转录启动子。慢 病毒载体可以是人体免疫缺损病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒 或者逆转录病毒等。 S4，将含有转基因的细胞按一定细胞密度接种于生物材料中，构建含有细胞的组 织工程化皮肤。将细胞接种于生物材料后，可以继续培养，然后进行皮肤剌激、遗传毒性和 致敏试验等一系列的检测。 皮肤经培养并检验合格后，可以进行移植，将组织工程皮肤敷于创面上。移植前， 用75 %的酒精消毒，然后清除坏死的组织，将含有细胞液体涂于创面上，再立即将组织工程 皮肤敷于创面上。然后利用光照系统发光，调节光的强度和频率，透过生物材料对移植细胞 进行光剌激，在特定波长的光的剌激下，通过调控特定细胞的活性，从而调控移植细胞的生 长、分化和基因表达。光敏感基因可以只有兴奋型通道蛋白基因，也可以只有抑制型通道蛋 白基因，还可以同时有兴奋型通道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因。如果同时有兴奋型通 道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因，则便于更好的控制细胞的生长、分化和基因表达。
光照系统由LED组成，可为单个或多个，光强度和频率可调控。 上述皮肤材料可以应用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织
修复和皮肤组织替代物等。采用上述皮肤材料移植到创面后，使光敏感离子通道蛋白的基
因ChR2/NpHR在细胞内表达，通过特定波长光的剌激，调控特定细胞的活性，从而精确调控
细胞的分化以及基因表达水平，使移植的皮肤材料细胞和新生细胞与周围的健康细胞之间
生长同步，产生正常的皮肤附属物，来促进创面愈合和提高愈合速度。 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
一种皮肤材料，其特征在于所述皮肤材料包括生物材料和携带光敏感基因和目的基因的细胞，所述细胞接种于所述生物材料中。
2. 根据权利要求1所述的皮肤材料，其特征在于所述细胞为自体细胞、异体细胞或自 体细胞和异体细胞的混合物。
3. 根据权利要求1或2所述的皮肤材料，其特征在于所述细胞为表皮细胞、成纤维细 胞、干细胞或前体细胞。
4. 根据权利要求1所述的皮肤材料，其特征在于所述光敏感基因包括兴奋型通道蛋 白基因和/或抑制型通道蛋白基因。
5. 根据权利要求4所述的皮肤材料，其特征在于所述兴奋型通道蛋白基因为ChR2、ChR2-310、 Chop2或者Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因为NpHR。
6. 根据权利要求1所述的皮肤材料，其特征在于所述目的基因为人生长激素、表皮生 长因子或成纤维细胞生长因子。
7. 根据权利要求1所述的皮肤材料，其特征在于所述生物材料为可降解型生物材料 或非降解型生物材料。
8. 根据权利要求7所述的皮肤材料，其特征在于所述可降解型生物材料为家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯到的丝胶、丝素及胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚乳酸，或者脱细胞真皮基质；所述非降解型生物材料为聚酰胺、聚酯、聚 苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纤维。
9. 一种皮肤材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 从健康皮肤中分离、消化组织，提取细胞； 制备转基因细胞； 将光敏感基因转染到细胞中；将含有转基因的细胞接种于生物材料中，构建含有细胞的组织工程化皮肤。
10. 根据权利要求9所述的皮肤材料的制备方法，其特征在于利用慢病毒作为载体转 染编码光敏感离子通道蛋白基因到细胞中。
11. 根据权利要求10所述的皮肤材料的制备方法，其特征在于所述慢病毒载体为人 体免疫缺损病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒中的 一种。
全文摘要
本发明涉及一种皮肤材料，所述皮肤材料包括生物材料和携带光敏感基因和目的基因的细胞，所述细胞接种于所述生物材料中。上述皮肤材料应用于制备临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和皮肤组织替代物。采用上述皮肤材料移植后，通过光照使光感基因在特定细胞中表达，精确调控细胞的分化以及基因表达水平，使植入细胞和新生细胞及周边健康细胞生长同步，产生正常皮肤附属物，达到创面愈合质量较高效果。此外，还提供了一种皮肤材料的制备方法。
文档编号A61L27/38GK101693127SQ200910110740
公开日2010年4月14日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者卢恬, 张奕, 王立平 申请人:深圳先进技术研究院;