专利名称：具有抗肿瘤活性的金铁锁总皂苷及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种金铁锁有效部位一总皂苷在抗肿瘤作用方面的应用及其制剂。
背景技术：
恶性肿瘤一直是严重威胁人类健康的重大疾病之一。抗肿瘤药物的药物毒性及不良反应也越来越受到重视。世界各国科研人员一直在为寻找具备一定选择性抗肿瘤的候选药物而不懈努力。寻求毒副作用小、抗肿瘤作用强，具有一定选择性抗肿瘤的药物是目前和将来的研究热点和重点。天然药物是理想的抗肿瘤候选药物筛选的一大宝库，如紫杉醇、喜树碱等一批具有较强抗肿瘤活性的天然药物被筛选出来，表现出了较好的临床疗效和应用前景。因此，鉴于我国自然草药资源丰富，民族、民间草药用药经验广泛的特点，从民族民间用药中筛选出毒副作用小、抗肿瘤作用强的药物及其有效部位，具有相当的优势。在从民族民间药物中筛选抗肿瘤活性的候选药物的过程中，首次发现了苗族药物金铁锁具有很强的抑制肿瘤细胞和实体瘤生长的作用，而对正常细胞和小鼠体重等方面的影响明显，这是一个令人兴奋的重要发现。金铁锁PsammosiIenetunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu 为石竹科单属种植物，别名独定子、蜈蚣七、对叶七、白马分鬃等，主要分布于贵州、云南、四川、西藏等中国西南地区， 是苗族民间常用药物之一。其功效具有散淤定痛，止血，消痈排脓等作用。主治跌打损伤， 风湿，胃痛，痈疽疮疖，创伤出血等。主要化学成分含有三萜、三萜皂苷、环肽以及内酰胺以及氨基酸和有机酸等，药理作用主要集中在镇痛、抗炎、免疫和抗类风湿等几个方面。在本发明之前，尚未见有金铁锁抗肿瘤作用及临床运用方面的报道。

发明内容
本发明的目的之一是提供金铁锁具有抗肿瘤作用有效部位-总皂苷及制备方法；本发明的目的之二是提供金铁锁总皂苷药物制剂的制备方法；本发明的目的之三是提供金铁锁的抗肿瘤作用的新用途及实验数据；本发明通过以下技术方案来实现本发明金铁锁总皂苷的制备方法取金铁锁药材粉碎后，经乙醇70°C _95°C回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇得浸膏。取浸膏以2倍量的水溶解后， 以正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，减压蒸干溶剂后得金铁锁总皂苷粗提物；然后将金铁锁总皂苷粗提物用低碳醇溶解，过大孔吸附树脂柱，以梯度乙醇-水溶液为流动相进行洗脱，再用TLC方法监测流出产物，收集含金铁锁总皂苷的流出产物；合并洗脱液，减压浓缩去除溶剂，冷冻或喷雾干燥至粉，得金铁锁总皂苷。本发明的药物制剂含有-99%的金铁锁总皂苷和99% -1%的赋形剂，优选含有20% -80%的赋形剂，最好含有40% -60%的金铁锁总皂苷和60% -40%的赋形剂。按照药剂学制备工艺和方法，可以将本发明的金铁锁总皂苷制备成多种抗肿瘤药物的临床应用剂型，包括口服制剂和非肠道给药剂型。所指的口服机制包括片剂、胶囊剂、脂质体、滴丸、缓控释剂、微孔渗透、薄膜包衣、乳剂、颗粒剂、口崩片中的任何一种；非肠道给药剂型包括注射剂、粉针剂中的任何一种。本发明通过体外肿瘤细胞培养实验，初筛金铁锁总皂苷的抗肿瘤作用的药理学活性并评价其作用效价，然后通过整体动物实验进一步验证其抗肿瘤作用及强度。体外细胞实验筛选了金铁锁总皂苷对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌共5种肿瘤细胞抑制作用及其效价，同时比较的研究其对正常脾淋巴细胞抑制作用情况，考察了金铁锁总皂苷其对肿瘤细胞株杀伤作用的选择性和敏感性，分析了其对肿瘤细胞的特异性抑制作用，以及对正常细胞生长有无明显影响。通过整体动物实验，分析了金铁锁总皂苷对S18tl小鼠实体瘤生长的抑制作用以及对小鼠体重的影响。


图1是金铁锁总皂苷(TSPT)及各给药组小鼠S18tl瘤体大小的比较中“生理盐水”是指生理盐水给药组；“TSPT大剂量”、“TSPT中剂量”、“TSPT小剂量” 分别是指金铁锁总皂苷分别为10mg/kg、5mg/kg、2. 5mg/kg的给药剂量组；“顺钼”是指阳性对照药顺钼给药组。具体实施例如下实施例1金铁锁总皂苷的制备方法优化后的提取条件是取金铁锁药材3kg，以8倍量体积为95%的乙醇76°C条件下回流提取3次，每次lh，合并提取液，减压回收乙醇至干，然后将金铁锁提取物用低碳醇溶解，过大孔吸附树脂柱，分别以10 %，30 %，50 %，70 %，90 %乙醇-水溶液为流动相进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩去除溶剂，冷冻或喷雾干燥至粉，得金铁锁总皂苷151. 3g。实施例2金铁锁总皂苷对体外5种肿瘤细胞的抑制作用细胞乳腺癌细胞(MCF-7)、人结肠癌细胞C26、人肝癌细胞BEL-7401、人卵巢癌细胞(SK0V3)、人胃癌细胞(BGC-823)，上述5种肿瘤细胞均由中国医学科学院肿瘤医院提供。药品与试剂金铁锁总皂苷，由北京中医药大学分子生药实验室提供，白色粉末，青霉素(Sigma, USA)、链霉素(Sigma, USA)；胰蛋白酶(Sigma, USA)、RPMI1640 培养基(Gibco, Invitragen co.，USA)；胎牛血清(Gibco, Invitragen co.，USA) ；二甲基亚砜(DMSO) (Sigma, USA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT) (Sigma, USA)。培养条件温度37°C、湿度 100%、含5%二氧化碳空气中培养。仪器:C02培养箱(Thermo 311型)；超净工作台(苏州净化设备厂)；倒置荧光显微镜(BDS200型)；酶标自动分析仪(华东电子集团医疗装备有限公司)；台式离心机 (Anke7DL-50B型)；高压灭菌锅(日本森展企业有限公司)；冰箱(Hisense 225U型)；电热恒温干燥箱(中兴202型)实验方法，MTT法各种肿瘤细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度；取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液180 μ L (3000个/孔)， 于37°C，5% CO2培养箱中培养池。金铁锁总皂苷溶解在生理盐水中，终浓度为4 μ g/mL、 16 μ g/mL,64 μ g/mL,256 μ g/mL、512 · μ g/mL,各 20 μ L/ 孔，每浓度 8 个复孔，正常对照组加入等量1640培养基，同时设顺钼阳性对照20μ L，终浓度为312μ g/mL，于37°C，5% CO2 培养箱中培养48h。弃去培养液，每孔加入200 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，继续培养4h。 弃去MTT，每孔加入200 μ L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 540nm处测量各孔的吸光值。计算抑制率和IC5tl值。实验结果显示(见表1)，金铁锁皂苷1. 6 μ g/mL对部分肿瘤细胞株如人胃癌细胞 (BGC-823)、和乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖没有明显的抑制作用，但随着药物剂量的增加至 6. 4 μ g/mL、25. 6 μ g/mL、52. 1 μ g/mL时，对各肿瘤细胞株均呈现明显的生长抑制作用，并具有一定的浓度依赖关系，最高抑制率达71. 4% (人胃癌细胞株BGC-82;3)和71. 9% (人结肠癌细胞C26)。数据还显示，人结肠癌细胞以6对金铁锁总皂苷最为敏感，IC50值最小仅为9. 02 μ g/mL，说明金铁锁总皂苷抗癌作用效价较强，作用强度接近临床常用化疗西药如顺钼等。表1金铁锁总皂苷对5种肿瘤细胞的抑制率及IC5tl值
P制率(%)
金铁锁总皂苷(Me/niL)
IC50
细胞株1.66.425.651.2BGC-8230.067.071.471.019.,85Bel-740113.039.854.155.423.,79SK0V315.955.457.158.815.,64MCF-70.058.763.258.323.,26C2624.250.871.963.59.02实施例3金铁锁总皂苷对正常脾细胞的作用脾细胞免疫细胞培养6 8周龄昆明小鼠，颈椎脱臼处死，75 %乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌纸上， 左腹侧朝上；在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5mL Hanks液的培养皿中；将脾脏放置不锈钢网QOO目)上， 用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液。培养液10%小牛血清、青霉素lOOu/mL、链霉素 100u/mL的RPMI 1640。培养条件温度37°C、湿度100%、含5%二氧化碳空气中培养。细胞增殖检测取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液10(^1^，浓度3\105个/1^，371，5% CO2 培养箱中培养浊。终浓度为 32μ g/mL、6. 4μ g/mL、8. Ομ g/mL、12. 8μ g/mL、25. 6g/mL，各 10 μ L/孔，每浓度8个复孔，正常对照组只加入等量的溶媒(30%乙醇-NaCl溶液)，同时设 ConA阳性对照组ConA 10 μ L，终浓度为5 μ g/mL,于37°C ,5%C02培养箱中培养48h。取出细胞培养板，倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，继续培养4h。弃去培养液，用PBS冲2-3遍(根据细胞贴壁情况确定是否冲洗)，每孔加入100 μ L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 540nm处测量各孔的吸光值。增殖率=(处理组OD值一对照组OD值)/对照组OD值X 100%实验结果显示(见表2)，金铁锁总皂苷在6. 4 μ g/mL时开始出现对脾淋巴细胞的轻微抑制作用，但这种作用较小，当剂量高达51. 2 μ g/mL时，其抑制率仅为2. 1%，与相同剂量对肿瘤细胞的抑制率71. 0%相比(参见表1)，金铁锁总皂苷对正常细胞的这种抑制作用显得微不足道。由实施例2和实施例3可知，金铁锁总皂苷对肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用，而对正常细胞的细胞毒性相对较小。表2金铁锁总皂苷对脾细胞的增殖抑制作用
权利要求
1.苗药金铁锁抗肿瘤活性有效部位，其特征在于其有效部位提取物为总皂苷，其基本母核结构为齐墩果烷型五环三萜类化合物，该提取物中金铁锁总皂苷含量在50%以上。
2.根据权利要求1所述的金铁锁总皂苷，其特征在于所提取溶剂为乙醇、水及其不同的配比。
3.根据权利要求1所述的金铁锁总皂苷，所述提取方法为回流提取，提取温度为 70-100°C，至少提取一次，每次时间为40分钟-1小时。
4.一种用于肿瘤治疗的药物制剂，其特征在于含有抗肿瘤作用的有效剂量的金铁锁总皂苷和一种或多种药学上可以接受的赋形剂，或可以与金铁锁总皂苷租方的其它药物。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于含有-99%的金铁锁总皂苷和 99% -1%的药用赋形剂或其它可组方的药物。
6.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所说的药物制剂是指非肠道给药或口服类制剂。
7.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、 脂质体、滴丸、缓控释剂、微孔渗透泵、薄膜包衣、乳剂、颗粒剂、口崩片的任何一种；非肠道给药的剂型选自于注射剂、粉针剂当中的任何一种。
8.金铁锁总皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8的用途，其特征在于所说的抗肿瘤活性是指抑制肿瘤细胞的增殖和抑制实体瘤的生长。
10.根据权利要求9的用途，其特征在所说的肿瘤细胞包括5种乳腺癌细胞(MCF-7)、 人结肠癌细胞C26、人肝癌细胞BEL-7401、人卵巢癌细胞(SK0V3)、人胃癌细胞<(BGC-823)； 所说的实体瘤为S180的小鼠移植性肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一种苗族药物金铁锁抗肿瘤作用的新用途，同时公开了其抗肿瘤活性药用部位的制备方法及其制剂。制备方法主要经过乙醇提取，浓缩，正丁醇萃取、大孔吸附树脂纯化等步骤获得金铁锁总皂苷。以总皂苷为原料，制备成片剂、胶囊剂、注射剂等临床常用的药物制剂。药效学评价采用体内外结合的方法。体外试验显示，TSPT对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤，6种肿瘤细胞具有较强的抑制作用，而对正常脾淋巴细胞抑制不明显；整体动物体内实验结果显示，该药对S180实体瘤抑制率高达72％，作用效价高，而对小鼠体重影响不大；与阳性药顺铂比，副作用较低。上述实验结果表明，该药抗癌效价强、副作用低，具备原始创新的优势。
文档编号A61P35/00GK102232988SQ20111016384
公开日2011年11月9日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者刘春生, 张元 , 张园园, 王学勇, 王秀丽, 赵保胜, 高伟 申请人:王学勇