专利名称：用于制备富含活性成分的银杏叶提取物的方法
技术领域：
本发明涉及用于制备富含活性成分的银杏叶提取物的方法。
目前，一些基于银杏叶提取物的标准植物药物制剂被用来治疗脑及外周血管性疾病，尤其是在欧洲、美国及远东。
目前使用最为广泛的银杏提取物(EGb761)含有24％的黄酮糖苷；3％的银杏内酯(ginkgolide)A、B、C和J的总和以及3％的白果内酯(bilobalide)(参见K.Drieu，La Presse Medicale(1986)，15，1455-1457)。患者的推荐日剂量为120mg。
例如，美国专利5,399,348介绍了一种用于制各银杏提取物的方法，所述提取物的平均组成为24％的黄酮糖苷，3％的银杏内酯A、B、C和J以及3％的白果内酯。这种方法包括以下步骤i.萃取用含有以重量计40％的水的丙酮萃取干叶粉末；ii.去脂在减压条件下浓缩萃取物直至浓缩物含有约30％的固体，从而除去丙酮，然后用水稀释以使固体浓度为15％，使所得到的悬浮液冷却至约10℃持续1小时，然后过滤除去脂质沉淀；iii.富集有机相向水性过滤液中加入30％的硫酸铵溶液，然后用甲乙酮和丙酮的混合物(9∶1至4∶6)进行液-液萃取并浓缩有机相，以使固体浓度为50％至70％；iv.除去鞣质用水和乙醇的以重量计50/50的混合物稀释以上浓缩物，以使固体浓度为10％，加入铅盐水溶液直至溶液颜色从棕褐色变成琥珀色，并过滤铅-鞣质沉淀物以得到透明的过滤液；v.清除不溶性硫酸盐形式的铅浓缩以上过滤液以使乙醇比例保持在5％以下，加入硫酸铵使其浓度达到约20％，随后用甲乙酮和乙醇的混合物(8∶2至1∶1)进行液-液萃取；和vi.干燥终产物浓缩有机相以使固体浓度为50％至70％，并在60至80
℃的烘箱中于真空下干燥，以分离得到含水低于5％的终产物。
在过去的十年中，已有许多研究致力于富集银杏提取物中的活性化合物部分并同时降低长链烷基酚类致敏化合物如银杏酚酸部分。
有相当数量的专利申请以及专利都介绍了可用来获得富含黄酮糖苷和萜烯内酯的银杏叶提取物的方法。
例如，美国专利5,389,370涉及用于制备浓缩了活性化合物的提取物的方法。其中所使用的方法是将通过液-液萃取而获得的富含黄酮糖苷的部分与用柱色谱分离得到的白果内酯和银杏内酯混合，以获得所需的组合物，所述组合物通常含有50％的黄酮糖苷和6％的白果内酯；50％的黄酮糖苷和7％的银杏内酯；或者50％的黄酮糖苷和6％的白果内酯以及7％的银杏内酯。所述方法采用了上述美国专利5,399,348的方法的前两步(其在此定义为步骤1和2)，接着加入了以下连续的步骤3.富集有机相用乙酸乙酯和己烷(9∶1)的混合物进行液-液萃取，再用正丁醇重新萃取水相，并将得到的正丁醇相浓缩至干燥，以获得富含黄酮糖苷的部分；4.活性碳处理用水洗涤乙酸乙酯-己烷相，然后用活性碳处理洗过的乙酸乙酯-己烷相，过滤并浓缩至干燥；5.重结晶将固体残渣溶解在以重量计50/50的乙醇和水的混合物中，冷却结晶并过滤，以获得银杏内酯；6.柱色谱分离将步骤5的上清液浓缩至干燥，并在硅胶柱上进行色谱分离，以获得富含银杏内酯和白果内酯的部分；和7.混合各部分将步骤3的富含黄酮糖苷的部分与步骤5或6的银杏内酯和/或与步骤6的白果内酯混和。
根据以上方法的一个实施方案，步骤4和5可用柱色谱代替。
此外，美国专利6,030,621介绍了一种用于获得富含黄酮糖苷和萜烯内酯的银杏提取物的方法，所使用的方法与美国专利5,389,370中的方法类似将富含黄酮糖苷的部分与通过柱色谱法获得的富含萜烯内酯的部分混合。通常，所制备的提取物包含47.2％的黄酮糖苷和6.3％的萜烯内酯，或者70％的黄酮糖苷和10％的萜烯内酯。此方法包括以下步骤a)萃取用含有以重量计50％的水的乙醇萃取干叶粉末；b)脱脂在减压条件下浓缩提取物直至除去乙醇，用水稀释浓缩物，将混合物静置48小时，并过滤脂质沉淀；c)捕集活性化合物使水性滤液通过由XAD-4树脂(多孔聚合物的混合物)和聚酰胺的混合物组成的树脂，以收集活性化合物；d)洗脱活性成分依次用含有以重量计30、60和90％的乙醇的乙醇/水混合物洗提活性化合物；和e)合并步骤d中得到的所有部分，蒸发除去乙醇，用己烷洗涤此水性浓缩物，并将洗过的水性浓缩物蒸发至干燥，以获得含有47.2％的黄酮糖苷和6.3％的萜烯内酯的提取物。
在上述方法的一个实施方案中，对从含有30％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分进行快速色谱分离，以获得至少含80％的萜烯内酯的部分。以同样的方式，将从含有60％乙醇和90％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分合并，并对其进行快速色谱分离，以获得至少含80％的黄酮糖苷的部分。将至少含80％黄酮糖苷的部分与至少含80％萜烯内酯的部分以不同的比例混合，可以获得含有高达70％的黄酮糖苷和10％的萜烯内酯的提取物。
由于健康安全的要求日益严格，所以希望使用尽可能纯的活性成分。因此，银杏提取物的趋势终将是停止使用如EGb761的提取物而使用更加富含活性成分的提取物。通常，可能的目标提取物是含有至少以重量计50％的黄酮糖苷和以重量计12％的萜烯内酯，或是含有至少以重量计30％的萜烯内酯和以重量计15％的黄酮糖苷。美国专利5,389,370或6,030,621的方法可用来获取这种提取物，但是当用于工业规模时，所述方法却被证明是非常复杂的，主要是因为采用了色谱分离的步骤。
本申请人已开发了一种不使用任何色谱分离步骤而获得符合上述标准的银杏叶提取物的方法。
因此，本发明的一个主题是用于制备银杏叶提取物的方法，其包含以下连续的步骤i.用含水以重量计不超过20％的乙醇提取干燥的银杏叶碎片；ii.在氯化钠水溶液存在下减压浓缩提取物，并从剩余的透明溶液中除去黑色油状物；iii.用正己烷、正庚烷或环己烷进行液-液萃取，以洗涤残余的水溶液；iv.用乙酸乙酯对洗涤过的水相进行液-液萃取；v.用氯化钠溶液洗涤步骤iv中获得的乙酸乙酯相，然后将洗涤过的乙酸乙酯相蒸发至干燥。
本申请中的干燥的银杏叶碎片是指粒度不超过5mm的干燥碎片。
优选地，本发明的干燥的银杏叶碎片是干粉末的形式。在本申请中，粉末是指粒度不超过1mm的粉末(优选不超过5mm)。
本发明的方法可用于-冻干的银杏叶碎片(优选粉末)，在该情况下可获得含有至少以重量计50％的黄酮糖苷和以重量计12％的萜烯内酯的提取物；-或干燥的银杏叶碎片(优选粉末)，在该情况下可获得在下文中被称为“主要提取物”的提取物，所述主要提取物含有至少以重量计30％的萜烯内酯和以重量计15％的黄酮糖苷(用所述方法还可以获取所述提取物的相关产品-在下文中被称为“相关提取物”，即与PCT专利申请WO96/33728中介绍的提取物类似的提取物，它含有以重量计约30至35％的黄酮糖苷和以重量计约1％的萜烯内酯)。
根据本发明的一个实施方案，上述方法被用于冻干的银杏叶碎片(或粉末)，并且所获得的提取物优选含有以重量计约52％的黄酮糖苷和以重量计约13％的萜烯内酯。
根据本发明的一个优选的实施方案，上述方法被应用于干燥的银杏叶碎片(或粉末)，并且所获得的主要提取物优选含有以重量计34至46％的萜烯内酯和以重量计18至30％的黄酮糖苷。更为优选的是，将上述方法应用于干燥的银杏叶碎片(或粉末)，所获得的主要提取物含有以重量计36至44％的萜烯内酯和以重量计18至30％的黄酮糖苷。特别地，上述方法被应用于干燥的银杏叶碎片(或粉末)，所获得的主要提取物将含有以重量计约40％的萜烯内酯(其中含有以重量计约24.5％的银杏内酯A、B和C和以重量计15.5％的白果内酯)和以重量计约24％的黄酮糖苷。
优选地，步骤i中的提取是用含有以重量计10至20％水的乙醇、更优选含有以重量计15至20％水的乙醇进行的。
优选地，将步骤ii中在氯化钠水溶液存在下减压浓缩后得到的混合物冷却至例如约10℃的温度，优选持续10或15分钟至1或2小时，然后再从所得的透明溶液中除去黑色油状物。更优选的是，可将硅藻土加入步骤ii中在氯化钠水溶液存在下减压浓缩后得到的混合物中，并在冷却此混合物之前将其中存在的所有乙醇蒸发除去。
同样优选的是，步骤iii中的洗涤使用的是正庚烷。
根据本发明方法的特别优选的实施方案，当将所述方案用于干燥的银杏叶碎片(或粉末)时，对步骤iii中经洗涤的剩余水溶液的体积和溶液中氯化钠的量预先进行调整，一方面使水溶性固体的含量以重量计达到约溶液总重量的8％，另一方面使氯化钠的含量以重量计达到溶液总重量的16％。水溶性固体的含量的测定方法是取乙醇溶液样本，蒸发除去乙醇，然后用二氯甲烷萃取，将残余的水相蒸发至干燥并称重，然后可以从所获得的固体残余物的质量推导出水溶性固体的含量。
步骤iv中，可以任选使用含有以体积计2至10％的丙酮或乙醇的甲基乙基酮替代乙酸乙酯。
步骤ii和v中所使用的氯化钠水溶液的浓度优选含有以重量计至少10％的氯化钠，而对于步骤v，氯化钠的浓度优选是饱和的。
根据应用于干燥的银杏叶碎片(或粉末)的上述方法的一个优选的实施方案，在步骤iv的液-液萃取结束时获得的盐水溶液相可通过一种方法进行再处理，所述方法包括a)用约1∶1的乙酸乙酯和乙醇的混合物进行液-液萃取；和b)将步骤a)结束时获得的有机相蒸发至干燥；c)将步骤b)中所获得的剩余物溶解于无水乙醇中，以使固体浓度相对于醇溶液的质量以重量计约为5％至10％。
d)将混合物冷却至优选10℃或10℃以下(例如2至8℃)的温度，优选冷却时间持续30分钟至12小时；e)过滤并蒸发所得到的过滤液中的乙醇，以得到干燥的提取物。
应用这种附加的方法可以回收得到附加的提取物，其通常含有以重量计约30至35％的黄酮糖苷和以重量计约1％的萜烯内酯。
或者，上述方法在步骤i至v之后，还包括以下步骤vivi.将干燥的提取物增溶于乙醇中，并将溶液冷却至优选10℃或10℃以下(例如2至8℃)的温度，如果有盐沉淀产生，则过滤除去盐沉淀，并将得到的溶液蒸发至干燥。
在这种情况下，当将本发明的方法用于工业生产时，优选的方法是在步骤v中仅将有机相浓缩至固体浓度为约50％至70％(而不是将其蒸发至干燥)，然后加入乙醇以使组成为以重量计5至20％的水、以重量计5至20％的固体，其剩余的为乙醇，然后再进行步骤vi。按照这种方式进行可省略干燥步骤。
本发明所获得的主要提取物可用于制药或食品行业(例如作为营养补充剂的成分)。因为一方面它们的烷基苯酚类物质的含量低于5ppm(HPLC测量结果)，另一方面，它们含有低于0.3％的前翠雀素(prodelphinidine)(优选低于0.25％，一般为0.05％至0.25％)。此外，它们还含少量的亲脂性杂质和多糖、除前翠雀素外的其它原花色素(proanthocyanidine)以及高分子量蛋白。
特别地，由于其前翠雀素的含量低，本发明的主要提取物更适于通过静脉途径向患者施用。相比之下，市售的提取物如EGb761等含有高达1.5％的前翠雀素。
此外，优选本发明的主要提取物的色谱图中对应于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羟基-3’，4’，5，7-黄酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羟基-4’，5，7-黄酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面积的和占色谱峰总面积的约39％。具体地讲，优选本发明的主要提取物的色谱图中对应于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羟基-3’，4’，5，7-黄酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面积占色谱峰总面积的约20％。类似地，优选本发明的主要提取物的色谱图中对应于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羟基-4’，5，7-黄酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面积占色谱峰总面积的约19％。
此外，使用本发明的方法所得的相关提取物含有低于0.5％的前翠雀素(优选低于0.4％，一般为0.15至0.40％)。
本发明的另一个主题是可通过本发明的方法获得的主要提取物。本发明的主题还有作为药物的所述主要提取物、包含所述主要提取物作为活性成分的药物组合物以及所述主要提取物用于制备药物的用途，所述药物可用来治疗选自以下的疾病/障碍脑和外周血管障碍(如血管源性耳鸣、动脉硬化、局部缺血、血栓、与静脉机能不全有关的症状、急性静脉炎症以及与痔疾有关的症状)、神经退化性疾病(如例如阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨庭顿舞蹈病或肌萎缩性侧索硬化症)以及老年慢性神经感官和认知性病理缺陷(尤其是在未患阿尔茨海默氏病或其它痴呆的老年病人中可见的记忆丧失)。最后，本发明的主题是所述主要提取物用于制备药物的用途，所述药物可为治疗增殖性疾病(尤其是癌症)提供辅助治疗。
含有本发明提取物的药物组合物可以是固体形式如，例如粉末剂、丸剂、颗粒剂、片剂、脂质体、明胶胶囊或栓剂。丸剂、片剂或明胶胶囊可以用一种物质进行包衣，所述物质能够保护组合物在足够的时间段内免受受试者的胃酸或胃中的酶的作用，以使这种组合物能够未经消化而进入受试者的小肠。所述提取物也可以局部施用，例如施用于肿瘤的实际部位。所述提取物也可以根据缓释方法施用(例如使用缓释组合物或渗透泵)。合适的固体载体包括磷酸钙、硬脂酸镁、碳酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯呲咯烷酮和蜡。
含有本发明提取物的药物组合物也可以是液体形式如，例如溶液剂、乳剂、混悬液或缓释制剂。适合的液体载体可以是例如水、有机溶剂如甘油或乙二醇类如聚乙二醇，或在水中的这些有机溶剂的不同比例的混合物。
本发明的药物的施用可以通过局部、口服、胃肠外途经、经肌肉内注射等方式进行。
本发明的提取物用于治疗上述疾病或障碍时的剂量随施用方法、待治疗患者的年龄和体重及其身体状况而变化，并且最终由医生或兽医决定。这种由医生或兽医所确定的量在此被称为“治疗有效量”。
如果预先不考虑医生的意见，根据主要提取物中的活性成分的含量，可以例如设计施用的日剂量为5至150mg、优选10至100mg(特别是40至80mg，例如50至70mg的剂量)的所述主要提取物。
在本申请中，术语“约”指的是所讨论数值周围的一个区间。如本申请中所使用的“约X”表示从X减X的10％到X加X的10％的区间，并更优选从X减X的5％到X加X的5％的区间。
除非特别指明，这里所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域一般技术人员通常所理解的含义相同。同样，所有在此提及的出版物、专利申请、专利以及其它参考资料在此引入作为参考。
以下实施例旨在阐明上述方法而不应当被认为是对本发明范围的限制。
实施例实施例1将100克冻干研碎的银杏叶(粒度小于4mm)用含有以重量计88％的乙醇的乙醇/水混合物萃取两次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下进行1小时。将两次萃取步骤的萃取液过滤，回收剩余的叶片并用200ml相同的溶剂混合物洗涤。合并萃取液并将其蒸发使体积减少至100ml，其中固体产物的含量约35g。将350ml 10％(重量)的氯化钠水溶液加入到醇浓缩物中，并在50℃下继续减压蒸发以除去剩余的乙醇。将浅桔黄色的透明盐溶液倾析通过过滤漏斗中的棉毛球然后抽吸滤过硅藻土而与黑色油状物分离，将盐水溶液中的提取物用每份150ml的正庚烷洗涤两次，然后再用每次150ml的乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯相并用50ml饱和氯化钠水溶液洗涤，然后减压蒸发至干燥。将干提取物重新溶解于60ml的无水乙醇中，置于5℃的冰箱中过夜，过滤以除去可能生成的沉淀盐并将过滤物蒸发至干燥，得到1.42g含有51.7％的黄酮糖苷和13％的萜烯内酯(6.55％的白果内酯)的提取物。
实施例2将100g在工业转炉中干燥并经研碎的银杏叶(粒度小于4mm，含有以重量计1.8％的黄酮糖苷和以重量计0.12％的银杏内酯)用含有以重量计80％的乙醇的乙醇/水混合物萃取两次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下进行1小时。将两次萃取步骤的萃取液过滤，回收剩余的叶片并用200ml相同的溶剂混合物洗涤。合并萃取液并将其蒸发使体积减少至800ml，其中固体产物的含量约33g。将60g氯化钠、100ml水和22g硅藻土加入到醇浓缩物中，并在50℃下继续减压蒸发以除去剩余的乙醇。将水性浓缩物冷却至10℃持续1小时。将浅桔黄色的透明盐溶液倾析通过过滤漏斗中的棉毛球、然后在覆盖有一层硅藻土的烧结玻璃漏斗上抽吸过滤而与黑色油状物分离。用两份125ml的正庚烷洗涤盐水溶液(约300ml)中的提取物，然后再用每次125ml的乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯相并用50ml饱和氯化钠水溶液洗涤，然后减压蒸发至干燥。将干燥的提取物重新溶解于23ml无水乙醇中，置于4℃的冰箱中过夜，过滤以除去可能生成的盐沉淀并将过滤物蒸发至干燥，得到1.06g含有23.6％的黄酮糖苷、39.2％的萜烯内酯(包括24.6％的银杏内酯A、B和C以及14.5％的白果内酯)和约0.14％的前翠雀素的提取物。
实施例3
在制备实施例2的提取物的方法中，经正庚烷清洗并用乙酸乙酯萃取的连续步骤后而获得的水相盐溶液再用两份125ml的乙酸乙酯-乙醇的1∶1混合物萃取，将所获得的有机相蒸发至干燥。将干燥的提取物置于无水乙醇中以使干燥提取物的浓度以重量计为溶液总重的5％。将混合物置于4℃的冰箱中过夜，然后用滤纸过滤(用4℃的无水乙醇冲洗固体)。蒸发至干燥后，得到含有31.88％的黄酮糖苷和0.67％的萜烯(含0.5％的银杏内酯A、B和C和0.17％的白果内酯)以及约0.21％的前翠雀素的提取物。
本发明提取物的鉴定A)HPLC本发明的提取物可以使用高效液相色谱法(HPLC)鉴定，洗脱梯度如下仪器-适合以下所指定条件的液相色谱仪及设备-实验室玻璃器皿-精确度至0.1mg的天平试剂-纯水(HPLC级)-乙腈(HPLC级)-异丙醇(HPLC级)-柠檬酸(HPLC级)-甲醇R-银杏提取物标准对照物步骤将200mg待分析的提取物溶解于10ml甲醇中，制得待测提取物溶液。以相同的方法将200mg银杏提取物标准对照(EGb 761)溶解于10ml甲醇中，制得参比溶液。
使用了以下色谱条件
-梯度类型 二级流动相从0％至100％线性梯度15分钟，然后以二级流动相洗脱5分钟。在进行以下进样前用基础流动相将色谱柱重新平衡10分钟。
-基础流动相纯水1000ml乙腈200ml异丙醇 30ml柠檬酸 4.92g-二级流动相纯水1000ml乙腈470ml异丙醇 50ml柠檬酸 6.08g-流速 1.5ml/分钟-检测 紫外360nm-色谱柱不锈钢，15cm长，直径4.6mm，填充有色谱用Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18硅胶或同等物(5μm)。
-进样体积 5μl结果所得到的实施例2提取物的色谱图由

图1所示，实施例3的提取物的色谱图由图2所示。
以下表I(实施例2的提取物)和表II(实施例3的提取物)中列出了所测定的不同色谱峰的积分值。在上述条件下，主峰的保留时间约为13至15分钟，分别对应于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羟基-3’，4’，5，7-黄酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羟基-4’，5，7-黄酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)。
表I
表II
B)测定前翠雀素的含量本发明提取物的前翠雀素含量按照以下所述方法进行测定将约50mg提取物溶解于25ml异丙醇和3N盐酸(5/1v/v)的混合物中。将5ml所得到的混合物转移至10ml烧瓶中，用液密塞子密封，然后将烧瓶浸于沸水中45分钟。冷却至20℃后，加入异丙醇与3N盐酸的混合物使体积增至10ml。测量556nm处的吸光度并通过进行以下运算得到前翠雀素的百分含量前翠雀素％＝A×86.206897/BA556nm处的吸收度B样品毫克数为降低结果的不确定性，重复实验3次并由所得结果计算平均值。
本发明提取物的药理学特性为证实本发明提取物的药理学特性，进行了以下实验。
1)细胞繁殖细胞系MDA-231乳癌细胞系得自Lombardi癌症中心(乔治敦大学医学中心)。将这些细胞在聚苯乙烯培养皿(Corning)中培养并在添加了10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改进的Eagle培养液(DMEM)中进行增殖。
结合实验将MDA-231细胞通过研磨分散于5ml磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBSS)中，然后在500g下离心15分钟。将经过离心的细胞重新悬浮于PBSS中并进行测试以确定它们的蛋白含量。可以按照“Papadopoulos等人，生物化学杂志，1990年，265期，3772-3779页”和“Hardwick等人，癌症研究，1999年，59期，831-842页”中所述的方法进行[3H]PK11195实验。[N-甲基-3H]PK11195或(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-异喹啉甲酰胺得自Du Pont-New England Nuclear(Wilmington，DE，美国)。PK11195得自Research Biochemicals Incorporated(Natick，MA，美国)。所得到的结果用LIGAND软件(Munson and Robard，Anal.Biochem.(1976)，72，248-254)进行分析。
Northern RNA分析使用“Hardwick等人，癌症研究，1999年，59期，831-842页”中所述的Northern分析法，可以对用实施例1或实施例2中的提取物或EGb761(参比)处理的MDA-231细胞中的外周型苯并二氮杂受体(PBR)的mRNA的表达进行评价。整体细胞RNA是使用试剂RNAzolB(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX，美国)和三氯甲烷进行分离的。用1％琼脂胶分离20μg总体RNA样品并将其过夜转移至尼龙膜(S&SNytran，Scheicher & Schuell，Keene，NH，美国)上。采用DNA引物的随机认证系统(Life Technologies，Gaithersbury，MD，美国)，用[α-32P]dCTP标记一段0.2kb长的人PBR的cDNA片段(得自含有人PBR全序列的pCMV5-PBR质粒载体)。所使用的杂交条件在先前所提及的文献中述及。自动放射显影是通过在-70℃下将印记(blots)暴光于X-OMAT AR底片(Kodak，Rochester，NY，美国)达4至48小时进行的。使用SigmaGel软件(Jandel Scientific，San Rafel，CA，美国)对PBR mRNA进行定量。
细胞繁殖用添加了0.1％FBS的DMEM作为细胞培养液，将MDA-231细胞置于96孔板(Corning，NJ，美国)中，浓度为每孔约10,000细胞(温育24小时)或5,000细胞(温育48小时)。然后将细胞在含有不同浓度的待测样品或参考样品(EGb761)的10％FBS中培养以上指定的时间。通过使用ELISABrDu仪器(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，美国)测量结合的5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)的量，对细胞繁殖的差异进行分析。BrdU的结合是在450nm的波长下(参比690nm)进行测量的。
2)谷氨酸诱导的神经毒性可按如下方式测试本发明的提取物用一系列浓度的上述实施例1或实施例2的提取物对大鼠脑神经细胞进行处理或未经处理，30分钟后使其与浓度为250 M的谷氨酸接触。然后计算抑制50％的谷氨酸毒性的剂量(IC50)，并与用提取物如黄酮糖苷和萜烯内酯的含量较低的EGb761得到的结果进行比较(即每ml含EGb761100μg)。
3)细胞毒性用HT22细胞系(鼠海马细胞)可测量本发明的提取物对细胞存活能力的影响。通过测定经一系列浓度的上述实施例1或实施例2的提取物处理过的HT 22细胞释放出的LDH的量以及锥虫蓝排除实验，可以估计细胞的存活能力。
细胞系HT 22细胞来自于Salk生物学研究所(Salk Institute for BiologicalResearch，La Jolla，CA，美国)。将此细胞用添加有10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改进的Eagle培养液(DMEM)在37℃下培养。所述培养液在下文中被称为完全培养液。
实验程序将HT 22细胞置于96孔板中，浓度为每孔完全培养液中含有5×103个细胞。24小时后，将所述实施例的提取物溶于DMEM中并将其以10、25、50、100、250、500和1000μg/ml的浓度加入细胞培养孔中，然后使提取物与细胞接触24或48小时。使用Promega分析试剂盒、按照制造商提供的使用说明进行LDH的测量。记录470nm处的吸收度。最高LDH释放量是用Triton X-100将细胞完全裂解后得到的。
当通过锥虫蓝排除实验估算细胞的存活能力时，将细胞置于6孔板中，并于24小时后以100g/ml的浓度加入实施例1或实施例2的提取物。
然后用不含钙及镁离子的磷酸盐缓冲液清洗细胞，再用胰蛋白酶在37℃下处理5分钟。用完全培养液终止反应，并向细胞悬浮液中加入0.04％的锥虫蓝。用血细胞记数器测定排斥锥虫蓝的细胞(即活细胞)数。按以下公式计算细胞存活百分比活细胞数(未染色细胞)/总细胞数(染色细胞和未染色细胞)×100
权利要求
1.制备银杏叶提取物的方法，其包括以下连续的步骤i.用含水以重量计不超过20％的乙醇提取干燥的银杏叶碎片；ii.在氯化钠水溶液存在下减压浓缩提取物，并从剩余的透明溶液中除去黑色油状物；iii.用正己烷、正庚烷或环己烷进行液-液萃取，以洗涤残余的水溶液；iv.用乙酸乙酯对洗过的水相进行液-液萃取；v.用氯化钠溶液洗涤步骤iv中获得的乙酸乙酯相，然后将洗过的乙酸乙酯相蒸发至干燥。
2.权利要求1的方法，其特征在于其不包括色谱分离步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中，步骤i中的干银杏叶碎片用干银杏叶粉末代替。
4.权利要求1至3的方法，其特征在于步骤i中的提取是使用含有以重量计10至20％的水的乙醇进行的。
5.权利要求1至4的方法，其特征在于步骤iii中的洗涤是用正庚烷进行的。
6.权利要求1至5的其中一项的方法，其特征在于步骤ii和v中所用的氯化钠水溶液的浓度为至少含有以重量计10％的氯化钠。
7.权利要求1至6的其中一项的方法，其在步骤i至v后还包括以下步骤vivi.将干燥的提取物溶于乙醇中并使溶液冷却，过滤可能产生的沉淀盐并将得到的溶液蒸发至干燥。
8.银杏叶提取物，其可以按照权利要求1至7的其中一项所述的制备方法获得。
9.权利要求8的银杏叶提取物，其特征在于所述方法是从干燥的干银杏叶碎片开始进行的。
10.权利要求9的银杏叶提取物，其特征在于其含有以重量计34％至46％的萜烯内酯和以重量计18％至30％的黄酮糖苷。
11.权利要求8的银杏叶提取物，其特征在于所述方法是从冻干银杏叶的干碎片开始进行的。
12.权利要求11的银杏叶提取物，其特征在于其含有以重量计约52％的黄酮糖苷和以重量计约13％的萜烯内酯。
13.用作药物的权利要求8至12的其中一项的银杏叶提取物。
14.药物组合物，其包含权利要求8至12的其中一项的提取物作为活性成分。
15.权利要求8至12的其中一项的提取物在制备用于治疗疾病/障碍的药物中的用途，所述疾病/障碍选自脑及外周血管障碍和神经退化性疾病。
16.权利要求8至12的其中一项的提取物在制备预计用来为治疗增殖性疾病提供辅助治疗的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及制备银杏叶提取物的方法，其包括以下连续的步骤i)用含水以重量计至少20％的乙醇提取干燥的银杏叶碎片；ii)在至少氯化钠水溶液存在下减压浓缩提取物并从剩余的透明溶液中除去黑色油状物；iii)用正己烷、正庚烷或环己烷进行液－液萃取，以洗涤残余的水相；iv)用乙酸乙酯对洗过的水相进行液－液萃取；v)用氯化钠溶液洗涤步骤iv)中获得的乙酸乙酯相，然后将洗过的乙酸乙酯相蒸发至干燥。
文档编号A61P9/14GK1501806SQ02808099
公开日2004年6月2日 申请日期2002年4月9日 优先权日2001年4月10日
发明者邓朋本 申请人:科学研究和应用咨询公司