专利名称：一种hiv-1脂质体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物预防医药领域，具体涉及一种预防艾滋病的HIV-I脂质体疫苗的制备。
背景技术：
艾滋病是全球所面临的最重大挑战之一，严重危害社会进步与经济增长，已造成 6000多万人被感染，其中3000万人已经死亡，目前存活的感染者约为3320万，其中90%以上的病例发生在发展中国家。至今为止，在各国政府与国际组织强有力的支持下，世界上先后开展了 100多个临床试验，但尚未有一个成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困难的一个主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-I具有高度的变异性。以往的疫苗所选择的抗原表位主要是自然感染中的优势抗原表位，而这些抗原表位是HIV-I中变异频率最高的位点。因此， 以这些抗原构建的疫苗诱导出的抗体具有延迟性，无法中和已经发生突变的HIV-I。通过保守免疫原设计来诱导具有广谱保护作用新疫苗是解决现有艾滋病疫苗研究中所存在的问题一个重要研究方向。高度保守的HIV-I gp41 MPER被认为是最具潜力的中和抗体设计靶点。目前为止分离得到的五个广泛中和抗体有三个(2F5，4E10和Z13抗体)是识别该区域的，其中4E10 能以较低的浓度中和HIV-I原始病毒株在内22株病毒株的全部亚型病毒，2F5可中和大约 67%左右的病毒。但是，无论在真核还是原核表达系统表达gp41或截短的gp41片段作为抗原时，由于获得的蛋白溶解性较差，很难产生相应的抗体。

发明内容
本发明的目的是提供了一种用于预防艾滋病的HIV-I脂质体疫苗。本发明将HIV-I gP41的MPER段较保守的抗原核心表位共价偶联到脂质体表面， 模拟HIV病毒env的天然状态，同时在抗原序列中加入通用的辅助性T细胞表位，通过B、T 细胞双信号识别，有助于增强机体对抗原的免疫应答，并能产生广谱的保护作用。其中HIV-I gP41的MPER段较保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5 所识别的核心表位，抗原序列中加入通用的辅助性T细胞表位包括但不限于破伤风毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒VPI上200-213序列。经豚鼠免疫实验，检测到较高滴度的针对HIV-I gP41的MPER的抗体，并具有一定的中和活性。


图1为本发明脂质体与抗原表位肽共价偶联反应示意图。马来酰亚胺活化的磷脂在PH中性条件下与抗原表位肽的巯基发生迈克尔加成，从而将脂质体与抗原偶联。
具体实施例方式下面结合实例对本发明进一步说明。实施例1抗原表位的设计选取HIV-I gp41 MPER上的4E10和/或2F5识别表位作为B细胞表位，加入通用 T细胞辅助表位，中间以6-氨基己酸连接。ELLELDKWASL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(Pl1)；ELLELDKffASL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P12)；SLNWFNITNWL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P21)；SLNWFNITNWL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P22)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P31)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P32)。实施例2HIV-I脂质体疫苗的制备利用薄膜分散法、反相蒸发法、乙醇注入法、冻干重建法等常用脂质体制备方法制备空白脂质体，脂质体膜材中加入马来酰亚胺活化的磷脂或其他脂溶性物质。在PH 中性条件下与抗原表位肽的巯基发生迈克尔加成，从而将脂质体与抗原偶联，反应原理如图1所示。以二油脂酰乙酰胆碱胆固醇心磷脂马来酰亚胺活化磷脂酰乙醇胺 (P0PC Chol CL MPB-PE) = 8 10 1 1(摩尔比)制备脂质体，将Pll加入上述空白脂质体，Pll 脂类的重量比为1 20，pH 6.6 6.7、4°〇搅拌1釙得？11脂质体疫苗 (Liposome Pll)。相同方法制备P12脂质体疫苗(Liposome P12)。GFC、RP_HPLC检测偶联率，结果显示约50%的ft·偶联到脂质体上。实施例3HIV-I脂质体疫苗的豚鼠免疫实验实验分5组，每组豚鼠5只。组1 弗式佐剂空白；组2 =Pr+弗式佐剂；组3 空白脂质体+MPL佐剂空白；组4:LipOSOme I^r+MPL佐剂。豚鼠皮下(四肢)多点注射，初免后每隔15天加强1次，0. 5ug/g体重。初免及加强采用Liposome Pll和Liposome P12 交替进行，四免后心脏取血检测针对MPER的抗体产生情况，根据抗体效价进行中和活性评价。结合抗体检测流程SA包被well — BSA封闭一bio-MPER —待测血清一羊抗豚鼠 IgG-HRP — TMB — 2MH2S04 — OD450。针对MPER的抗体产生情况见表1。抗体中和活性评价见表2。表1
权利要求
1.一种HIV-I脂质体疫苗，其特征在于脂质体表面共价键偶联HIV-lgP41的MPER段较保守的抗原核心表位，同时在抗原序列中加入通用的辅助性T细胞表位。
2.根据权利要求1所述的HIV-I脂质体疫苗，其特征在于所述HIV-IgP41的MPER段较保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5所识别的核心表位。
3.根据权利要求1所述的HIV-I脂质体疫苗，其特征在于所述抗原序列中加入通用的辅助性T细胞表位包括但不限于破伤风毒素830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列。
4.根据权利要求1所述的HIV-I脂质体疫苗，其特征在于所述脂质体的膜材包括但不限于心磷脂、神经鞘磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、胆固醇、饱和及不饱和的磷脂酰胆碱、马来酰亚胺活化的磷脂或其他脂溶性物质。
5.根据权利要求1-4所述的HIV-I脂质体疫苗，其特征在于所述脂质体的的制备方法包括薄膜分散法、反相蒸发法、乙醇注入法、冻干重建法。
6.根据权利要求1-5所述的HIV-I脂质体疫苗，其特征在于脂质体粒径为 10nm-50μ m。
7.权利要求6中的HIV-I脂质体疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、 口服给药、肺部给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道肛门给药。
8.权利要求7中的HIV-I脂质体疫苗在初免及加强免疫过程中可采用同种抗原核心表位-辅助T细胞表位，也可以同种抗原核心表位-不同辅助T细胞表位交替进行免疫。
全文摘要
具体涉及一种预防艾滋病的HIV-1脂质体疫苗的制备。本发明通过共价键将HIV-1gP41的MPER段较保守的抗原核心表位偶联到脂质体表面，模拟HIV病毒env的天然状态，同时在抗原序列中加入通用的辅助性T细胞表位，通过B、T细胞双信号识别，有助于增强机体对抗原的免疫应答，并能产生广谱的保护作用。
文档编号A61K39/21GK102485273SQ20101056768
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者孔维, 张勇, 董庆光, 陈妍 申请人:吉林大学