专利名称：：黄芩复合免疫增强剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本技术属水产养殖病害防控
技术领域：
，尤其涉及一种养殖甲壳类免疫增强剂的制备和应用方法。
背景技术：
：海水经济蟹类是我国海水养殖的重要组成部分，我国养殖的海水蟹类主要品种为锯缘青蟹(^c;^hserrateForskal)和梭子蟹(尸0rto/7"s邵)，属甲壳纲(fr"Wac朋)、十足目("ec，w/s)、梭子蟹科(尸or^/77jVae)，广泛分布于我国东部沿海各省及日本、印度、东南亚、澳大利亚、南非等海域，是我国重要的海洋经济蟹类，也是重要的出口创汇品种。近年来，我国海水蟹类养殖业迅速发展，2006年我国锯缘青蟹和梭子蟹养殖面积达76，277万公顷，占海水蟹养殖面积的95%以上，两者总产量达22万吨左右。其中锯缘青蟹产量达到10.85万吨，占世界总养殖产量的88.14%，是世界第一青蟹养殖大国。此外，我国的凡纳滨对虹(&^/e/7aei^ra/M，eie)(俗称南美白对虾)和脊尾白虾(firo/ah/^/cari"ca〃^Holthuis)(又称小白虫下)是我国重要的经济养殖虫下类，其中南美白对虾的养殖产量为全部经济甲壳类养殖之首，脊尾白虾在沿海养殖中占有重要的地位。随着海水蟹养殖的规模化发展，病害日益成为养殖发展的主要障碍。近年来，青蟹和梭子蟹先后发生了较为严重的疾病，其中养殖青蟹平均发病率为13.77%左右，平均死亡率5.43%，每年造成2亿余元的经济损失。疾病也给养殖梭子蟹造成了极大的经济损失。目前病害控制上，主要采用药物为主的控制手段，费用较高，抗菌药物的大量使用还导致养殖蟹药物残留、耐药菌株产生等一系列问题，极大地影响了养殖蟹虾的品质。
发明内容为了解决上述的水产养殖中存在的技术问题，本发明的一个目的是提供一种黄芩复合免疫增强剂，其不仅具有良好的杀虫作用，还可以大幅提高青蟹对弧菌感染的抵抗水平，增强甲壳动物的免疫力。本发明的第二个目的是提供上述的黄芩复合免疫增强剂的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述的黄岑复合免疫增强剂制成的新剂型。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案黄芩复合免疫增强剂，该复合免疫增强剂包括黄芩提取物或黄芩苷与左旋咪唑，黄芩提取物或黄芩苷与左旋咪唑的重量份数如下黄芩提取物或黄芩苷24份"左旋咪唑2.55份。作为最优选，黄芩提取物或黄芩苷与左旋咪唑的重量份数如下黄芩提取物或黄芩苷2.5份左旋咪唑3份。上述的黄芩苷(Baicalin)别名黄芩甙，购自国内厂家，产品的黄芩苷含量不低于95%，其余特征符合中国药典2005版(I部)的要求。上述的黄芩提取物可以采用以下的方法①取炒黄芩，充分粉碎后，加蒸馏水浸泡过夜；②煎煮沸腾30min,补水，再煎煮沸腾30min，用纱布滤去药渣，取上清液；③补水，同步骤②煎煮和滤去药渣，再煎煮两两次；④将3次煮出的药液进一步煎煮浓縮，过滤除去颗粒，取澄清滤出液；⑤加入NaOH，再加3倍体积95%乙醇，剧烈振荡；⑥静置后，8000r/min离心15min，得褐色沉淀；⑦加入水重新溶解沉淀，离心除去不溶物，再加NaOH及3倍体积95%乙醇，同歩骤，重复两次，干燥得黄芩提取物制品。当然，黄芩提取物的制备方法应不限于与上述方案，对于现有中药提取的方法，本发明均可以适用。为了实现上述的第二个目的，本发明的黄芩复合免疫增强剂的制备方法，取黄芩提取物或黄芩苷和左旋咪唑用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案一、黄芩复合免疫增强注射剂，该注射剂采用上述任意一个技术方案所述的黄芩复合免疫增强剂，加入蒸馏水溶解，再加入Na2C03溶液助溶，搅拌或振荡，然后用生理盐水稀释，所述的黄芩复合免疫增强剂占总重量百分比浓度为0.5°/。4.0%，优选的浓度为1%4.0%。二、黄芩复合免疫增强饲料，该饲料包括上述任意一个技术方案所述的黄芩复合免疫增强剂和面粉，黄芩复合免疫增强剂采用Na2C03溶液助溶后与面粉或面粉和饵料鱼混合，所述的黄芩复合免疫增强剂占总重量百分比为4.5%10.0%;或者，按每吨饲料加入0.2kg1.0kg所述的黄芩复合免疫增强剂的用量制成颗粒伺料。本发明的黄芩复合免疫增强剂用于制备预防或治疗养殖甲売类传染性疾病的药物或饲料中的应用；或者，本发明的黄芩复合免疫增强剂用于制备提高养殖甲壳类免疫力的药物或伺料中的应用。作为优选，所述的传染性疾病为病原性传染性疾病。优选的病原性疾病为白斑综合征病毒感染、血卵涡鞭虫感染以及其他纤毛虫、弧菌的感染引起的病原性疾病。优选的养殖甲壳类为青蟹、梭子蟹、南美白对虾或脊尾白虾。发明人在中草药免疫增强剂的广泛筛选基础上，发现黄芩提取物对青蟹有较好的免疫增强作用，可全面增强青蟹血清主要免疫指标，提高青蟹血清对弧菌的杀灭能力。青蟹体内测定表明黄芩提取物对青蟹血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶等免疫相关酶类有良好的增强作用，可增强青蟹血清的抗弧菌水平，增强青蟹血细胞吞噬率，并可大幅提高青蟹对弧菌感染的抵抗水平。生产性试验表明黄芩提取物可提高青蟹抗病力，减少秋季和越冬期青蟹发病高峰的青蟹死亡率，通过注射和投喂均可达到较好的效果，其中注射适合于越冬阶段青蟹增强免疫力和疾病预防，而添加到饲料中比较适合于养殖过程中发病高峰的疾病控制。考虑到目前大部分地区的海水蟹类养殖多采用自然海区捕获的鱼虾等鲜活饵料，因此发明者设计分别建立了鲜活饵料和颗粒饲料中添加免疫增强剂的方法。发明人在对黄芩提取物的研究中发现，黄芩提取物的主要成份是黄芩苷，实验室和生产性应用试验表明市售黄芩苷对青蟹有同样的免疫增强作用。研究阐明了黄芩提取物的主要活性成份，并使免疫增强剂的规模化生产和应用成为可能。此外，对虾白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞭虫是青蟹、梭子蟹病害的主要病原，而左旋咪唑不但是一种重要的杀虫药物，还有增强甲壳动物的免疫力。发明者的研究表明左旋咪唑与黄芩苷在促进酚氧化酶活性方面还有一定的协同作用。发明者确定了黄芩提取物的主要活性成份是黄芩苷，并确定了黄岑苷与左旋咪唑对青蟹的免疫激活剂量，确定了黄芩与左旋咪唑的最佳配比浓度。并根据青蟹养殖生产现状建立了注射法、拌料法和颗粒饲料加工法等三种免疫增强剂'使用途径，分别适用于不同养殖时期的青蟹。试验还表明，该免疫增强剂还可添加到饲料中，应用于南美白对虾和脊尾白虾的用于南美白对虾和脊尾白虾的疾病预防和控制。本发明的黄芩复合免疫增强剂可用于以下几个方面的疾病控制1)养殖塘青蟹的疾病预防和控制引起青蟹发病死亡的主要原因有白斑综合征病毒(WSSV)感染、血卵涡鞭虫感染以及其他纤毛虫、弧菌的继发感染等，疾病高发季节为每年9-10月，这期间水温适合水体病原菌的繁殖，加上雨水、昼夜气温变化等造成青蟹较大的应激反应，自身抵抗力较差。本发明的黄芩复合免疫增强剂对这一时期青蟹疾病有良好的预防和控制作用。由于这一期间养殖青蟹上多投喂鲜活饵料，可采用复合免疫增强剂与鲜活饵料拌匀后投喂方法。在发病高峰前，可以投喂添加复合免疫增强剂的颗粒饵料，连续投喂3-5天，有良好的防病效果。2)越冬期青蟹病害的预防和控制越冬期是青蟹死亡的另一高峰，这一时期青蟹进食较少，在青蟹放养前采用肌肉注射复合免疫增强剂是一个可以考虑的方法。也可在青蟹进越冬池前将复合免疫增强剂添加饲料连续投喂青蟹3-4天，以提高越冬青蟹的抗病力。3)南美白对虾和脊尾白虾疾病的预防控制南美白对虾和脊尾白虾疾病的主要疾病是白斑综合征病毒(wssv)和各类弧菌等，水质恶化也可成为疾病发生的诱因。研究表明复合免疫增强剂对南美白对虾和脊尾白虾有较好的疾病预防和控制效果，采用复合免疫增强剂添加的颗粒饲料投喂养殖虾，可取得良好的控制效果。具体实施例方式实施例l一、黄芩提取物从中药材炒黄芩中提取，具体制备方法如下①从中药店购买炒黄苓，取炒黄芩100g，充分粉碎后，加蒸馏水500mL4°C浸泡过夜；②将黄芩浸泡物用煎煮沸腾30min，补水250mL，再煎煮沸腾30min，用纱布滤去药渣，取上清液；③滤出药渣加水250ml，同②煎煮和滤去药渣，再煎煮两次；将3次煮出的药液合并，进一步煎煮浓縮至100mL，过滤除去颗粒，取澄清滤液；⑤在澄清滤出液中加入O.5MNaOH2mL，再加3倍体积95%乙醇，剧烈振荡；静置4h后，8000r/min离心15min，得褐色沉淀；⑦加入50mL水重新溶解沉淀，离心除去不溶物，再加O.5MNaOHlmL及3倍体积95%乙醇，同⑤离心沉淀，重复两次，干燥得黄芩提取物制品。卖施例2黄芩复合免疫增强剂的制备方法取上实施例l中制备的黄芩提取物干品2.5份，左旋咪唑3份，用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。左旋咪唑为兽用盐酸左旋咪唑(levamisolehydrochloride),购自国内厂家，其特征符合中国兽药典2005版(I部)的要求。实施例3鉴于黄芩提取物主要成份为黄芩苷，故也可用黄芩替代黄芩提取物。黄芩复合免疫增强剂的制备方法取黄芩苷2.5份，左旋咪唑3份，用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。黄芩苷(Baicalin)别名黄芩甙，购自国内厂家，产品的黄芩苷含量不低于95%，其余特征符合中国药典2005版(I部)的要求。实施例4黄芩复合免疫增强剂的制备方法取上实施例l中制备的黄芩提取物干品4.0份，左旋咪唑2份，用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。实施例5黄芩复合免疫增强剂的制备方法取黄芩苷4.0份，左旋咪唑2份，用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。实施例6复合免疫增强剂的肌肉注射对青蟹和其他蟹类的肌肉注射按下述方法进行1)取实施例27制备得到的黄芩复合免疫增强剂12g，用20mL蒸馏水溶解，加入lmL0.1M的Na2C03溶液，搅拌或振荡至基本溶解，补水至IOOmL;2)将溶解免疫增强剂用0.2"m灭菌过滤器过滤除菌，无菌保存于4"C备用；3)使用前，应将免疫增强剂溶液用25。C水浴预热，用25'C水浴预热的生理盐水将免疫增强剂溶液稀释5倍；注射剂量按青蟹得蟹的平均体重。按100g青蟹0.2mL剂量注射青蟹步足基部，注射前后注射部分均用酒精棉消毒；4)注射完毕后将青蟹暂养观察O.5-lh，无异常后可放回养殖池中。实施例7复合免疫增强剂与鲜活饵料拌匀后投喂取实施例27制备得到免疫增强剂50g，用水100mL溶解，加入O.5mL0.1MNa2C03溶液助溶，与饵料鱼100kg混合，加入面粉0.51kg充分混匀，投喂青蟹。实施例8复合免疫增强剂颗粒词料制备方法按每吨饲料添加0.5kg实施例27制备得到免疫增强剂的用量制成颗粒饲料，可根据投喂对象分别采用青蟹、南美白对虾或脊尾白虾的基础饲料，分别用于青蟹、南美白对虾、脊尾白虫下的疾病预防中。试验例l:越冬期锯缘青蟹的疾病预防控制试验本实施方案与结果取自发明者越冬试验数据，试验方法和结果简述如下1)试验设复合黄芩复合免疫增强剂组和对照组，分别注射复合黄芩增强剂10组(实施例2)和生理盐水，剂量按
发明内容3肌肉注射法进行。根据蟹的体重不同，各组在步足与背面交界处注射免疫多糖O.15—0.3mL，每组注射30只青蟹，注射后将青蟹放养于300cmX200cmX150cm网箱中；试验期间水温为10±2°C，盐度为19.5%。。注射后8、16、24、32d取样3只，抽取青蟹血淋巴液，测定青蟹血清的相关免疫指标。2)结果表明青蟹注射黄芩复合免疫增强剂后，血清碱性磷酸酶(ALP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力均显著高于对照组，其中ALP水平32d后未见明显下降，S0D活力可维持16d，血清氧化酶(POD)和酚氧化酶(PO)活力也显著升高，其中P0比对照提高了176。/。，表明免疫增强剂有显著的免疫增强作用。统计使用免疫增强剂组和对照组的成活率，结果见表l。由表可见，养殖45d后免疫增强剂组的成活率为82%，对照组为61%，免疫组比对照组有显著提高。表1免疫增强剂对锯缘青蟹存活率的影响存活情况(45d)免疫增强剂组对照组~"宛亡个数/只^~~^存活个数/只2518存活率82%61%试验例2越冬期锯缘青蟹的疾病预防控制生产性试验本实施方案与结果取自发明者越冬生产性试验数据，试验方法和结果简述如下试验在蛇蟠岛振华养殖公司进行，该公司为大规模越冬养殖应用试点，采用室内水泥池养殖模式，试验期间水温为15±2°C，盐度为19.5%。。试验组注射黄芩复合免疫增强剂(实施例2)，对照不注射，养殖注射15d后测定相关免疫指标，统计养殖30d各组青蟹的存活率。结果见表2。表2免疫增强剂在锯缘青蟹生产性越冬池中的应用结果免疫指标CIS-2对照ALP/U/mL0.420.30PO/U/mL62.7819.80SOD/U,/mL1612.001140.90蛋白含量mg/mL121.60103.10SOD比活U/mgprot13.2611.07抗菌活力/U/mL0.140.14存活率88%59%由表可见，注射黄芩复合免疫增强剂组，15d后血清各免疫指标比对照组有明显提高，其中以血清中酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(ALP)最为明显，注射30d后免疫增强剂组青蟹存活率88。/。，对照组的存活率仅为59°/。。表明免疫增强剂可显著提高青蟹越冬的成活率。^验例3黄芩复合免疫增强剂在青蟹和脊尾白虾疾病预防控制中的效果本实施结果取自发明者制备免疫增强剂添加颗粒饲料结果。试验方法和结果简述如下取黄芩苷2.5份、左旋咪唑3份混合而成的复合免疫增强剂，按每吨饲料0.5kg添加量添加至饲料中，基础词料采用南美白对虾料配方，制备为颗粒饲料。生产使用量为每20亩大小蟹塘发病高峰前投喂饲料20kg，于早上投喂，连续投喂3-5d。调査使用者的效果。结果见表3。表3免疫增强剂词料在秋季发病高峰青蟹或脊尾白虾养殖中的应用结果编号养殖种类效果简述有效性l上市青蟹存活提高SI~"2青蟹、脊尾白虫下混养白虾、青蟹发病减少有效3青蟹、脊尾白虾混养白虾、青蟹发病减少有效<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注下午投料。由表可见，投喂黄芩复合免疫增强剂饲料后，7个养殖点的青蟹或脊尾白虾死亡有明显减少，捕捉上市青蟹的活力也明显增强。由于试验池前期，除一青蟹单养池外，均以投喂鱼虫下等鲜活饵料为主，为增加养殖品种的摄食，要求养殖户在早上投喂饲料，下午投喂鲜活饵料。其中一个失败的养殖户，可能原因为前期己明显发病，又错在下午投料，养殖品种不能及时进食免疫增强饲料，反而造成残饵污染水体，加剧了疾病。由本试验可以认为，添加免疫增强剂的颗粒饲料可用于青蟹和脊尾白虾发病高峰时候的疾病预防和控制。4青蟹、脊尾白虾混养5青蟹、脊尾白虾混养6青蟹单养7脊尾白虾为主小计一权利要求1.黄芩复合免疫增强剂，其特征在于该复合免疫增强剂包括黄芩提取物或黄芩苷与左旋咪唑，黄芩提取物或黄芩苷与左旋咪唑的重量份数如下黄芩提取物或黄芩苷2～4份左旋咪唑2.5～5份。2.根据权利要求1所述的黄芩复合免疫增强剂，其特征在于黄芩提取物或黄苓苷与左旋咪唑的重量份数如下黄芩提取物或黄芩苷2.5份左旋咪唑3份。3.根据权利要求1或2所述的黄芩复合免疫增强剂，其特征在于黄苓提取物的'制备方法如下①取炒黄芩，充分粉碎后，加蒸馏水浸泡过夜；②煎煮沸腾30min，补水，再煎煮沸腾30min，用纱布滤去药渣，取上清液；③补水，同步骤②煎煮和滤去药渣，再煎煮两两次；④将3次煮出的药液进一步煎煮浓縮，过滤除去颗粒，取澄清滤出液；⑤加入NaOH，再加3倍体积95%乙醇，剧烈振荡；静置后，8000r/min离心15min，得褐色沉淀；⑦加入水重新溶解沉淀，离心除去不溶物，再加NaOH及3倍体积95X乙醇，'同步骤⑤离心沉淀，重复两次，干燥得黄苓提取物制品。4.根据权利要求1或2所述的黄岑复合免疫增强剂的制备方法，其特征在于该方法如下取黄芩提取物或黄芩苷和左旋咪唑用搅拌机充分混合，阴凉避光处保存。5.黄芩复合免疫增强注射剂，其特征在于该注射剂采用权利要求1或2所述的黄岑复合免疫增强剂，加入蒸馏水溶解，再加入Na2C03溶液助溶，搅拌或振荡，然后用生理盐水稀释，所述的黄芩复合免疫增强剂占总重量百分比浓度为0.5%4.0%。6.黄芩复合免疫增强饲料，其特征在于该词料包括权利要求1或2所述的黄芩复合免疫增强剂和面粉或面粉、饵料鱼，黄芩复合免疫增强剂采用Na2C03溶液助溶后与面粉或面粉、饵料鱼混合，所述的黄芩复合免疫增强剂占总重量百分比为4.5%10.0%;或者，按每吨饲料加入0.2kgL0kg权利要求1或2或3所述的黄芩复合免疫增强剂的用量制成颗粒词料。7.根据权利要求1或2所述的黄芩复合免疫增强剂用于制备预防或治疗养殖甲壳类传染性疾病的药物或饲料中的应用。8.根据权利要求7所述的黄芩复合免疫增强剂用于制备预防或治疗养殖甲壳类病原性疾病的药物或饲料中的应用，其特征在于所述的传染性疾病为病原性传染性疾病。9.根据权利要求7所述的黄芩复合免疫增强剂用于制备预防或治疗养殖甲壳类病原性疾病的药物或饲料中的应用，其特征在于所述的传染性疾病为白斑综合征病毒感染、血卵涡鞭虫感染以及其他纤毛虫、弧菌的感染引起的病原性疾病。10.根据权利要求7所述的黄芩复合免疫增强剂用于制备预防或治疗养殖甲壳类传染性疾病的药物或饲料中的应用，其特征在于所述的养殖甲壳类为青蟹、梭子蟹、南美白对虾或脊尾白虾。全文摘要本技术属水产养殖病害防控
技术领域：
，尤其涉及一种养殖甲壳类免疫增强剂的制备和应用方法。黄芩复合免疫增强剂，该复合免疫增强剂包括2～4份黄芩提取物或黄芩苷与2.5～5份左旋咪唑。该复合免疫增强剂可有效增强养殖青蟹非特异性免疫力，提高青蟹血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活力，提高青蟹对白斑综合征病毒、弧菌和血卵涡鞭虫等常见病原的抗病力。本复合免疫增强剂可通过注射或添加到青蟹鲜活饵料、颗粒饲料中应用于青蟹养殖中，用于青蟹发病高峰期的疾病预防和控制，降低青蟹发病率和死亡率。本免疫增强剂添加到饲料中用于南美白对虾和脊尾白虾的疾病预防和控制。文档编号A61K36/539GK101642488SQ20091010157公开日2010年2月10日申请日期2009年8月17日优先权日2009年8月17日发明者问刘,潘清清,邱庆连,冬钱申请人:浙江省淡水水产研究所