专利名称：牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及两种中药单体成分的药理作用及其应用，具体是以牛蒡苷和苷元为活性成分的单体药物及其在抗帕金森药物中的应用。
背景技术：
牛蒡子为菊科(Compositae)牛蒡属(Arctium)植物牛蒡(Arctium lappa)的干燥成熟果实。牛蒡子的主要药效成分为牛蒡苷，我们的研究结果(He Fan，Dou De-Qiang, SunYu, Zhu Lin, Xiao Hong-Bin, Kang Ting-Guo. Plasma pharmacokinetics and tissuedistribution of arctiin and its main metabolite in rats by HPLC-UV and LC-MS.Planta Medica 2012, 78:800-806.)和国外报道均表明牛蒡苷是通过在胃肠道中代谢成牛蒡苷元而发挥其药效的。帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元渐进性死亡为病理特征的中枢神经系统退行性疾病。目前治疗手段主要以西药为 主，但只能改善症状，不能控制其进程，长期应用疗效减弱且毒性增大。

发明内容
本发明的目的在于公开一种牛蒡苷及苷元的新用途，即能有效防治帕金森病。我们的研究结果表明牛蒡苷元为牛蒡苷的代谢产物和吸收入血的活性成分，而且直接服用牛蒡苷元的生物利用度较低。因此牛蒡苷为牛蒡苷元的前体药物。我们首先通过体外实验发现牛蒡苷元具有较好的抗帕金森作用，然后通过体内实验发现口服牛蒡苷而显示其具有较强的抗帕金森病的作用。研究结果证明牛蒡苷和苷元均可应用于帕金森病的治疗。为证实牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病采用的技术方案是
一、牛蒡苷和苷元的制备
I、牛蒡苷的制备方法，是取牛蒡子粗粉I. Okg (牛蒡苷含量5. 2%)，用水煎煮提取三次，每次加15倍量水，I小时。合并提取液，减压浓缩至药材的2倍量，加95%乙醇至乙醇浓度达到80%，4°C醇沉12小时，过滤，取上清液，减压浓缩至近干，得浸膏。浸膏用甲醇溶解，用浸膏I等重量的100-120目硅胶拌样，用浸膏I等重量的200-300目硅胶分离，用氯仿-甲醇洗脱，得到含有牛蒡苷的馏分，合并含有牛蒡苷的馏分，浓缩后加95%乙醇结晶，得牛蒡苷30g (牛蒡苷含量大于95%)。2、牛蒡苷元的制备方法，是取牛蒡子粗粉I. OKg (牛蒡苷含量5. 2%)，加3倍量水，40°C温孵4个小时，加95%乙醇和水调节成10倍量60%乙醇提取液，加热回流煎煮I小时。继续用60%乙醇提取两次，每次I小时。合并提取液，浓缩近干。经硅胶柱分离，用100目硅胶按样品量I: I拌样，200-300目硅胶I: I进行柱层析，氯仿-甲醇洗脱，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重结晶，得牛蒡苷元25g (牛蒡苷元含量大于95%)。二、细胞的培养及ro细胞模型的建立
I.I实验材料多巴胺能人神经母瘤细胞株(SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库)，所用牛蒡苷和苷元取自本实验室。
I. 2细胞培养含10%灭活小牛血清(购自GIBCO公司，批号8166872)、青霉素100U .mL'链霉素 ΙΟΟμ g .mr1 (购自 HyClone 公司，批号:J120721)的 DMEM F-12 1:1 培养液(购自HyClone公司，批号NXA0559)培养SH-SY5Y细胞，置于37°C、5% C02的培养箱中。隔天更换培养液，培养至单层细胞约80%汇合时，传代培养，用对数生长期的细胞进行实验。I. 3造模及给药方法调节SH-SY5Y细胞密度约5X 104/mL，100 μ L/孔接种于96孔板，16h后分别加入不同浓度(I μ Μ、5 μ M和10 μ Μ)的牛蒡苷和牛蒡苷元,每一浓度设3个复孔，并设等量的对照组(不含处理试剂)和模型组(只加ΜΡΡ+，购于Sigma公司，批号100M4713V)，24h后，对照组加入完全培养基，模型组和空白组每孔加入用培养液稀释的ImM的MPP+ (I —甲基一4 —苯基吡啶离子)。I. 4四甲基偶氮唑盐(MTT+)法检测细胞存活率48h后，不同组细胞每孔均加入5mg/mL MTT+ 10 μ L，培养4h，吸去孔内培养基，每孔加DMSO 100 μ L，待结晶充分溶解，酶标仪检测490nm处各孔的吸收值(0D值)(参考波长620nm)，计算细胞存活率细胞存活率％ =(实验组OD值-空白组OD值/对照组OD值-空白组OD值)X 100% ]01.5统计学处理数据以均数土标准差(I 土S)表示，用单因素方差分析(one-wayAN0VA)进行统计学处理。结果见表I。表I不同浓度牛蒡苷和苷元对抗MPP+细胞毒性后的SH-SY5Y细胞存活率
权利要求
1.牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元纯度大于90%时具有治疗帕金森病作用。
2.根据权利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元是由牛蒡子粗粉制成，其中 牛蒡苷的制备方法如下取牛蒡子粗粉I. O kg，牛蒡苷含量5. 2%，用水煎煮提取三次，每次15倍量，I小时，合并提取液，减压浓缩至药材的2倍量，加95%乙醇至乙醇浓度达到80%，4°C醇沉12小时，过滤，取上清液，减压浓缩至近干，得浸膏，浸膏用甲醇溶解，用浸膏等重量的100-120目硅胶拌样，用浸膏等重量的200-300目硅胶分离，用氯仿-甲醇洗脱，得到含有牛蒡苷的馏分，合并含有牛蒡苷的馏分，浓缩后加95%乙醇结晶，得牛蒡苷30g，牛蒡苷含量大于90% ； 牛蒡苷元的制备方法如下取牛蒡子粗粉I. 0K，牛蒡苷含量5. 2%，加3倍量水，40°C温孵4个小时，加95%乙醇和水调节成60%乙醇含量的10倍量提取液，加热回流煎煮I小时，继续用60%乙醇提取两次，每次I小时，合并提取液，浓缩近干，经硅胶柱分离，用100目硅胶按样品量I: I拌样，200-300目硅胶I: I进行柱层析，氯仿-甲醇洗脱，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重结晶，得牛蒡苷元25g、牛蒡苷元含量大于93%。
3.根据权利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用，其特征在于采用多巴胺能人神经母瘤细胞株模型，证明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病的生物活性。
4.根据权利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用，其特征在于采用MTPT所致的C57BL/6小鼠模型，证明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病作用。
5.根据权利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用，其特征在于所述牛蒡子苷及苷元可单独或与其他药物组合治疗帕金森病。
全文摘要
牛蒡苷和牛蒡苷元为中药牛蒡子中的主要活性成分。本发明公开了一种抗帕金森病的中药牛蒡中活性成分牛蒡苷和苷元在抗帕金森方面的应用。通过体内和体外试验结果表明表明牛蒡苷及其苷元具有较强的抗帕金森病作用。本发明中的牛蒡苷和苷元在抗帕金森病方面有较强的活性，副作用小，价格便宜。
文档编号A61K131/00GK102895278SQ20121040202
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者窦德强, 李东薇, 康廷国 申请人:辽宁中医药大学