专利名称：青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体a中的作用及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用。
背景技术：
青蒿又名黄花蒿(Artemisia anaua L),属菊科,是一年生草本植物。青蒿素是我国药学工作者于20世纪70年代初从中药青蒿中提取的倍半萜内酯类抗疟药物。鉴于传统的奎宁类药物普遍遇到抗药性问题，青蒿素和它的衍生物目前已取代它们，成为世界上抗疟疾的主流药物。青蒿素的大环上有一个内过氧化物桥，在亚铁离子或亚铁血红素的催化下，会放出以碳为中心的自由基。细胞内的蛋白质和核酸被这些自由基烷化后死亡。疟原虫寄生在红血球内，含有大量来自血红蛋白的亚铁血红素，因而青蒿素很易被活化，进而将疟原虫杀死。青蒿素和它的衍生物，如二氢青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚及青蒿琥酯等已广泛应用于疟疾治疗，更多的青蒿素衍生物正在研制中。青蒿素及其衍生物的抗疟活性已得到世界公认，具有起效快、药效高、毒副作用低等优点。除广泛应用于抗疟治疗外，青蒿素类药物还具有其它多种药理作用，如抗血吸虫作用、抗心律失常、平喘、抗内毒素、抗变态反应、抗红斑狼疮、免疫抑制等作用。随着对青蒿素及其衍生物活性研究的不断深入，人们发现，该类化合物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用和良好的治疗效果，然而，其具体作用靶点及相关信号通路及作用机制还不明确。因此本领域迫切需要了解青蒿素及其衍生物在一直肿瘤中的作用。

发明内容
本发明的目的是提供青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用。本发明的另一目的是提供青蒿素及其衍生物作为血小板衍生生长因子受体A抑制剂/拮抗剂的应用。本发明的另一目的是提供体外治疗肿瘤的方法。在本发明的第一方面，提供了一种青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途=I3DGFRa阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。在另一优选例中，所述的I3DGFRa阳性肿瘤细胞为TOGFRa阳性卵巢癌细胞或PDGFRa阳性肝癌细胞。在本发明的第二部分，提供了一种青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A (H)GFR a )的抑制剂或拮抗剂。在另一优选例中，所述的血小板衍生生长因子受体A (H)GFR a)来自于人。在另一优选例中，所述的抑制剂或拮抗剂还用于:⑴抑制TOGFR a酪氨酸激酶的活化；和/或
(ii)抑制TOGFRa的蛋白稳定性；和/或(iii)促进TOGFRa泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或(vi)抑制TOGFR a阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物选自下组:蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物为二氢青蒿素。在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRa)活性的方法，包括步骤:将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体AQ3DGFRa )。在另一优选例中，所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培养所述细胞。在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞,较佳地包括F1DGFRa阳性肿瘤细胞，更佳地包括I3DGFR a阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞，如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞0VCAR3、肝癌细胞H印3B。在另一优选例中，所述方法还用于至少以下一种应用:体外非治疗性地抑制I3DGFR a酪氨酸激酶的活化；体外非治疗性地抑 制I3DGFRa的蛋白稳定性；体外非治疗性地促进I3DGFR a泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和体外非治疗性抑制I3DGFRa阳性肿瘤细胞的生长。在本发明的第四方面，提供了一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括:(I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和(II)含吉西他宾或卡钼的制剂，所述制剂组合用于制备:(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或(b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。在另一优选例中，所述制剂包括:片剂、胶囊、栓剂、注射剂。在另一优选例中，所述肿瘤为I3DGFRa阳性肿瘤。在本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗TOGFRa相关疾病的方法，其中所述疾病与TOGFRa的过表达或活性过高有关，所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。在另一优选例中，所述的TOGFRa相关疾病包括肿瘤(H)GFRa阳性肿瘤)，如卵巢癌或肝癌。在另一优选例中，PDGFRa阳性肿瘤为TOGFRa阳性卵巢癌或TOGFRa阳性肝癌。在另一优选例中，所述的施用包括:瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物。 在本发明的第六方面，提供了一种方法，所述方法用于体内或体外抑制I3DGFR a酪氨酸激酶的活化、抑制I3DGFRa的蛋白稳定性、促进TOGFRa泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制I3DGFR a阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。在本发明的第七方面，提供了一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，所述试剂盒包含检测离体组织I3DGFRa表达量的试剂。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示TOGFRa可以作为青蒿素及其衍生物的直接作用靶标；其中，图1a为体外激酶实验，结果显示，青蒿素及其衍生物青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制TOGFRa胞内端(aa550_末端)酪氨酸激酶的活性；图1b为表面等离子共振(SPR)实验，结果显示，双氢青蒿素(DHA)可以与TOGFRa包外端(aa24_524)蛋白相互结合，索拉菲尼(Sorafenib)为阳性对照，已知其可以结合抑制PDGFRa的活性；图1c为生物素-亲和素亲和纯化实验，结果显示，标记生物素的DHA可以与A2780细胞内TOGFRa相互结合，从而被亲和纯化出来；图1d为计算机辅助同型模建及反向对接实验(Computer Assisted Homology modeling and docking),结果显不，双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到TOGFRa包外端TOGF结合位点，同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点，阻断其激酶激活；图1e-图1f显示双氢青蒿素能够有效抑制TOGFR a阳性细胞A2780和0VCAR3中TOGFRa的活性和蛋白表达，而对TOGFRi^的磷酸化和蛋白水平影响不大；图1g-图1i显示双氢青蒿素可以加速TOGFR a的蛋白降解，这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。 图2显示了青蒿素及其衍生物具有抑制TOGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力；其中，图2a显示，给予药物刺激48h后，青蒿素及其衍生物对人正常卵巢上皮细胞10SE144无明显的生长抑制能力，对于SK-0V3细胞毒性较小，但对于I3DGFRa阳性的A2780和0VCAR3具有较强抑制能力，其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著；图2b为细胞迁移实验，结果显示，低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞，青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力，而对于TOGFRa阴性的细胞SK-0V3无明显抑制能力；图2c显示了不同浓度的双氢青蒿素对5种细胞系(10SE144、A2780、0VCAR3、0VCAR5、SK-0V3)的细胞抑制作用；图2d显示了不同浓度的双氢青蒿素对3种细胞系(A2780、0VCAR3、SK-0V3)的细胞迁移的影响；图2e显示了不同浓度的双氢青蒿素对2种细胞系(A2780、0VCAR3)的细胞侵袭的影响。图3显示青蒿素及其衍生物具有抑制TOGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力；其中，图3a显示，在人正常的肝细胞系(7702和L02)和肝癌细胞系0fep3B、HepG2,772U7404、LM3、97L、97M、Huh-7)中，只有H印3B高表达PDGFRa ;图3b显示，低浓度双氢青蒿素(3μΜ)短时(12h)处理H印3B细胞，能够显著抑制其迁移和侵袭能力；图3c为细胞生长实验，结果显示，PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更敏感，而其他细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低。
图4显示双氢青蒿素能抑制小鼠原位卵巢癌模型的生长和转移；其中，图4a显示双氢青蒿素给予治疗小鼠，能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展；图4b显示，与对照组相比，双氢青蒿素治疗组小鼠的肺癌转移的情况大大降低，且随着药量的增加，治疗情况越好；图4c显示不同浓度的双青青蒿素给予治疗小鼠，肿瘤腹腔播散的情况(肺脏、肝脏、肠)得到明显的抑制；图4d为免疫组化实验，结果显示，双氢青蒿素处理的细胞其形态转换过程(EMT)得到抑制；图4e为免疫印迹实验，结果显示，双氢青蒿素能够有效抑制TOGFRa的表达和磷酸化，下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制。图5显示了青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用；其中，图1a为H印G2和Hep3B细胞用青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合吉西他宾处理实验，结果显示，吉西他宾单独作用于H印G2和Hep3B细胞，具有一定的凋亡促进作用，青蒿素联合吉西他宾对HepG2和Hep3B细胞都具有显著凋亡促进作用作用，两药联合表现出协同作用；图5b显示，DHA和CBP联合用药24小时后对0VCAR-3细胞凋亡有增效促进作用，用I μ M的DHA联合500 μ M CBP(1155% )作用后的细胞凋亡率显著高于单独用ΙμΜ DHA (266 %)或500 μ MCBP(528% )的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效应，是一种增效作用，Α2780细胞对联合治疗显示了累加效应；图5c显示，当与DHA联用时，CBP显著抑制了卵巢癌细胞的活力，当细胞暴露于I μ M CBP和ΙμΜ DHA时，Α2780细胞的存活率就降低了 69%，而0VCAR-3细胞存活则减少了 72%，相比之下，10SE144细胞则显得对治疗较不敏感，两种药物均以I μ M合用时存活率只降低了约28% ;图5d为肝癌细胞Hep3B和H印G2裸鼠移植瘤实验，结果显示，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素，青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用；图5e为在卵巢癌细胞A2780和0VCAR3裸鼠移植瘤实验中，结果显示，DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24%和41%的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P < 0.05)，0VCAR-3模型14%和37%肿瘤生长抑制(P < 0.05);只给单一 CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了 56%(A2780)和 46% (0VCAR-3)，联合用药(25mg/kgDHA)组则在 A2780 和 0VCAR-3 动物肿瘤中均产生70%肿瘤生长抑制(P < 0.05)。图6显示I3DGF Ra的表达与卵巢癌病理级别和转移状态的关系；其中，图6a显示，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌病例中，肿瘤细胞及周围的间质细胞I3DGFR α的表达量显著增加；图6b为TOGFRa染色结果，结果显示，在高级别卵巢癌病例中，TOGFRa的表达显著增加。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，发现青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A(H)GFRa )的抑制剂或拮抗剂，此外，青蒿素及其衍生物还可以抑制PDGFRa酪氨酸激酶的活化、抑制TOGFRa的蛋白稳定性、促进TOGFRa泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制I3DGFRa阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭、还可以用于TOGFRa阳性肿瘤治疗的增敏剂。在此基础上完成了本发明。术语
卵巢癌卵巢癌是全世界的妇女健康的巨大威胁。在美国，卵巢癌已成为第四位致死性的女性癌症。虽然被诊断于病发早期的卵巢癌患者的5年存活率可以达到80% -90%，但是被诊断为晚期的卵巢癌患者存活率却只有不到25%，此外，大多数卵巢癌患者在诊断出是卵巢癌是已至晚期。目前卵巢癌患者的死亡率在过去的数十年没有发生太大的改变，因此在肿瘤治疗和预后中，寻找有效的治疗方案，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，和克服肿瘤的耐药性是研究人员和临床实践人员长期以来的目标。肝癌肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，其发病率已上升到恶性肿瘤的第二位。由于肝癌早期症状不明显，因此确诊的大多数病人已处于中、晚期。原发性肝癌的首选治疗是手术切除，随着治疗技术的提高，目前术后5年生存率已提高至50%-60%，但由于手术切除只适用直径不超过5cm、癌灶数目不超过3个的小肝癌。此外，是否适合直接手术切除还取决于癌灶部位的血管富集程度及病人个体差异，这些限制导致90%左右的肝癌不适合手术治疗。即使是可切除肝癌，术后实施以介入化疗为主的综合性治疗也是必要的。然而目前，鲜有药物能够有效抑制肝癌的生长和进一步恶化，肝癌对传统化疗药物的反应率低，毒副作用非常显著，因此化疗的缓慢发展是制约抗肿瘤药物临床应用的主要原因。因此对于肿瘤化疗来说，迫切需要寻求更好的化疗增效剂和更好的治疗方案，从而提高肿瘤对化疗的敏感度，降低其对化疗的耐药性。血小板衍生生长因子及其受体血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor, F1DGF)是一类能够合成并分泌到细胞外基质中的生长因子，具有促进纤维细胞、平滑肌细胞等多重组织的细胞分裂、增殖、迁移、增加细胞的黏附能力，在人胚胎发育和正常生理活动中发挥着重要作用。TOGF以自分泌和旁分泌形式激活血 小板衍生生长因子受体(TOGFR)而发挥作用。PDGFR包含两种结构类似的酪氨酸激酶受体I3DGFR α和TOGFR β，其中I3DGFR α的异常激活与多重疾病密切相关，具体地，I3DGFR相关疾病可以分为三类:1.肿瘤由于H)GFR(特别是TOGFRa )存在于多种肿瘤中，它可能作为一个新的治疗靶点。已经发现，多种肿瘤的发生与H)GFR(特别是TOGFRa )的过度激活相关，如卵巢癌、神经胶质瘤、前列腺癌；此外，在一些肿瘤中存在I3DGFR的突变激活，如隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、Bcr-Abl阴性的慢性髓样白血病、嗜酸细胞增多综合征等等。2.血管性疾病研究发现，PDGF及TOGFR等在多种血管性疾病中存在过量表达和过度激活现象，如动脉粥样硬化和再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管病变等，抑制TOGFR信号通路的激活可以有效缓解上述疾病的症状，增加其治疗效果。3.纤维性病变PDGF-PDGFR信号通路在多种纤维性病变过程中发挥重要的作用，如肺纤维化、肝纤维化和肝硬化、皮肤纤维增生(硬皮病)、肾纤维化、心肌纤维化等等，其中TOGF-PDGFR信号通路介导的间质细胞的增殖是该慢性炎症的共同特征。上述三类疾病中，H)GF-PDGFR信号通路发挥重要的作用，其中TOGFRP主要介导了血管系统病变，而I3DGFRa主要介导了间质细胞和成纤维细胞驱动的病变。(JohannaAndrae, et al.Role of platelet-derived growth factors in physiology andmedicine, Genes Dev.2008 ；22:1276-1312 ;张秀华等，血小板源生长因子受体与肿瘤.生命科学，Vol.18，N0.3 Jun.，2006)青蒿素及其衍生物青篙素是从中药青篙中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，由于青蒿素是复杂的大分子，化学全人工很难合成，因此目前主要是生物合成和人工提取。青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行，途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步:由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素，具体为:FPP — 4，
11-二烯倍半萜一青蒿酸一二氢青蒿酸一二氧青蒿酸过氧化物一青蒿素。青蒿素和本领域几种常见的青蒿素衍生物的化学式见下:
权利要求
1.青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途PDGFRa阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。
2.一种青蒿素及其衍生物的用途，其特征在于，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRa)的抑制剂或拮抗剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂或拮抗剂还用于 (i)抑制TOGFRa酪氨酸激酶的活化；和/或 ( )抑制I3DGFRa的蛋白稳定性；和/或 (iii)促进I3DGFRa泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或 (vi)抑制TOGFRa阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。
4.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述的青蒿素衍生物选自下组蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。
5.一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(TOGFRa)活性的方法，其特征在于，包括步骤将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A (PDGFR a )。
6.一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括 (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和 (II)含吉西他宾或卡钼的制剂， 其特征在于，所述制剂组合用于制备 (a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或 (b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为TOGFRa阳性肿瘤。
8.一种预防和/或治疗I3DGFRa相关疾病的方法，其中所述疾病与TOGFR a的过表达或活性过高有关，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。
9.一种方法，所述方法用于体内或体外抑制I3DGFRa酪氨酸激酶的活化、抑制TOGFRa的蛋白稳定性、促进I3DGFRa泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制TOGFR a阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，其特征在于，所述方法包括步骤给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。
10.一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测离体组织PDGFR a表达量的试剂。
全文摘要
本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用，具体地，青蒿素及其衍生物直接作用于肿瘤的分子靶标血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)，与细胞膜上的PDGFRα结合，抑制PDGFRRα胞内段的酪氨酸激酶的活化，抑制PDGFRα的蛋白稳定性，促进泛素依赖的蛋白酶体介导的降解过程，对于高表达PDGFRα的肿瘤细胞具有剂量依赖的细胞生长抑制和迁移侵袭抑制作用，也可以抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活化。
文档编号A61P17/00GK103251585SQ201210034078
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者王慧, 李晓光, 陈培战 申请人:中国科学院上海生命科学研究院