专利名称：牛衣原体病灭活疫苗及其制备与检验方法
技术领域：
本发明涉及一种防治牛传染病的灭活疫苗的制备方法，以及这种疫苗和制备过程中的相关检验方法。
背景技术：
牛衣原体病是牛的一种传染性疾病，它对养牛业危害最严重的是牛衣原体性流产，该病是由鹦鹉热衣原体感染牛引起的一种地方流行性的接触性传染病，以妊娠母牛流产、早产、死产或产无活力犊牛为主要特征。该病的同义名有牛流行性流产、牛地方流行性流产、牛新立克次体性流产。由于奶牛衣原体性流产给奶牛场造成的损失不仅仅是胎儿夭折，更严重的是产奶量与正常分娩牛相比，大幅度减产，同时造成饲料、人力巨大浪费和巨额医药费开支。国外报道，一个平均拥有60头经产奶牛和20头初产母牛的牧场，每年因衣原体感染引起的产奶量下降、奶质量下降、流产和不孕而造成的经济损失达4万欧元。目前，我国奶牛存栏1000万头左右，最保守按10％的奶牛感染衣原体病，每年造成的经济损失高达4亿5千万欧元(约折合人民币45亿元)。另外，鹦鹉热衣原体感染人，引起人的鸟疫症。牛源鹦鹉热衣原体是否也危害人类健康，也是人们关注的一个问题。
早在二十世纪二十年代，美国人首先报道了牛地方流行性流产综合征；到1956年，德国人采用血清学实验和细胞培养技术，证明原联邦德国牛流行性流产是由衣原体感染所致。以后欧洲许多国家，加拿大、前苏联、日本、印度也相继报道牛衣原体性流产。中国从八十年代，一些省区陆续报道该病，湖北省(1983)从患地方流行性流产的奶牛群的流产胎犊和乳汁分离出衣原体；用补体结合试验(CFT)检查6个牛群衣原体抗体阳性率为10％。1988年，中国农业科学院兰州兽医研究所在国内首次发现牦牛衣原体性流产，用CFT检测衣原体抗体阳性率为29.03％(45/155)，并从流产胎儿分离到8株鹦鹉热衣原体。1991年陕西对西安市6个奶牛场进行衣原体病血清学调查，阳性检出率达28.31％，并从流产胎儿分离到衣原体。1997-1998年，兰州兽医研究所用用间接血凝试验(IHAT)对采自山东、河北、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海和四川等8个省区的肉用牛、肉役兼用黄牛和牦牛血清642份检测衣原体抗体，结果肉用牛平均阳性检出率为32.6％；肉役兼用黄牛15.2％；牦牛为18.7％。2001年，兰州兽医研究所对采自广西、安徽和江苏12个县的343份水牛血清IHAT检测，发现各县水牛群均程度不同地存在衣原体感染，阳性检出率最低的为3.3％，最高为39.3％。2002-2004年，陕西和宁夏一些地区的奶牛场怀孕牛流产问题比较严重，兰州兽医研究所用血清学和病原学方法再次证明鹦鹉热衣原体是引起奶牛流产的重要病原之一。衣原体病对养牛业的危害不可低估。
目前，用四环素、金霉素等抗生素进行牛衣原体病的预防和治疗，费用昂贵，由于大量或长期使用抗生素会导致产生新的抗药株，使防治效果明显降低或无效果，病的复发率上升。同时，服药奶牛体内的药物残留升高，乳汁中药物残留升高，食用抗生素高残留牛奶或肉将严重危害人民的身体健康。因此，各国都禁止在饲料中添加各类抗生素来防治家畜的细菌性传染病，而提倡采用以疫苗免疫为主的综合性措施防治家畜的细菌性传染病。
各国都在进行相关疫苗研究，但是截止今天，没有见到任何有关牛衣原体病疫苗研制成功的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种牛衣原体病预防用灭活疫苗的制备方法，以及这种疫苗和制备过程中的相关检验方法。
本发明的牛衣原体病灭活疫苗的制备方法是将牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX种毒用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液或生理盐水10000倍稀释，接种于37℃孵化6～7天的且无鹦鹉热衣原体感染的健康鸡胚，收获接种72小时以后死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，将抗原用组织捣碎机捣碎后过滤，然后将滤液用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)20倍稀释，按稀释后抗原量的0.2％加入浓度37％的甲醛，容器严格密封好，充分摇均匀，于4℃环境灭活72小时，用消毒的206佐剂或11号食用白油作为佐剂，将灭活抗原与油佐剂按1∶1比例混合、摇均匀，用高压均质机乳化，得疫苗。
对于在超低温冰箱长期保存的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX制苗菌株(种毒)，在制苗时可先将菌株接种于无衣原体感染的种鸡群所产的经37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代进行复苏，特别是采用2代复苏。复苏方法是将长期超低温保存的制苗菌株SX5或NX用灭菌生理盐水10倍稀释，接种6-7日龄鸡胚，在无菌条件下收取接种第4-6天死亡的鸡胚的卵黄膜，将其粉碎后用0.1MpH7.2的磷酸液缓冲液(PBS)或等渗盐水1000倍稀释后，再将其按前述的方法接种于二代鸡胚上，再在无菌条件下收取接种第4-6天死亡的第二代鸡胚的卵黄膜作为制取制苗抗原的种毒。
本发明所述的牛衣原体病灭活疫苗指前述制备方法所制备的疫苗。
本发明的牛衣原体病灭活疫苗制备中的检验方法是a)种子毒检验将-70℃长期保存的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX制苗菌株接种无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7目龄鸡胚，传1-2代，可使全部接种鸡胚在接种72小时以后规律地死亡，取死亡鸡胚的卵黄膜涂片姬姆萨染色镜检，只看见大量紫红色的衣原体原生小体(E)，而没有任何其他杂菌污染，并且其毒力效价为10-11-10-13ELD50，此鸡胚培养物可以作为繁殖疫苗抗原的种(子)毒。
b)抗原繁殖检验收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，其中含有大量的衣原体原生小体，而细菌检查为阴性，效价检测≥10-8ELD50为合格；c)抗原灭活检验抗原灭活72小时后，无菌抽取样品，分别接种人工培养基和6-7日龄鸡胚培养，人工培养基内无任何细菌生长，鸡胚发育正常无死亡，说明抗原灭活合格，可以用于制苗；d)抗原乳化检验乳化抗原呈乳白色，不分层。乳化型为水包油包水，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圆形，并且云雾状散开为合格；e)疫苗检验随机取样，每瓶受检疫苗分别接种人工培养基和小白鼠，进行无菌检验、安全检验和效力检验，试验组5只小鼠接种本疫苗后21天攻毒，从所有小鼠均检不出衣原体，接种小鼠生长发育正常，同时无菌检验为阴性的为疫苗效检合格。
本疫苗制备和产品质量检验步骤包括牛源鹦鹉热衣原体制苗株的抗原鸡胚繁殖和收获；制苗抗原滴度检测(≥10-8ELD50)；制苗抗原无菌检验；制苗抗原的灭活与检验；灭活抗原的乳化；疫苗分装；疫苗的无菌检验、安全检验和效力检验。按该步骤在GMP条件下生产出的牛衣原体病灭活疫苗，给适繁牛在配种前或配种后1个月肌肉或皮下注射5ml/头可以有效地预防由鹦鹉热衣原体感染引起的流产、死产；给犊牛肌肉或皮下注射2ml/头，可以有效地预防由鹦鹉热衣原体感染引起的犊牛肺炎-肠炎，多发性关节炎，结膜炎等。本疫苗-一次免疫保护期达10个月以上。大量试验证明该疫苗的安全性良好。
本发明的有益效果在于1)采用本发明可制备牛衣原体病灭活疫苗，将其给牛群接种可以有效地预防各种症状的牛衣原体病，可以使免疫牛体内产生高水平的衣原体特异性抗体，产生坚强的免疫力，有效抵抗衣原体感染，相应的试验表明，一次接种其保护期达可10个月，可以基本保证妊娠牛能正常分娩和高产泌乳期的到来；并有效保护犊牛免受衣原体感染。
2)本发明制苗时采用先将菌株接种于37℃孵化6～7天的无鹦鹉热衣原体感染的健康鸡胚，传1-2代进行复苏，特别是传2代进行复苏，再用复苏后的菌株为种毒制苗的方法，可以使超低温冰箱长期保存的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX菌株毒力复活，克服直接使用在超低温长期保藏的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX菌株制苗，产生的因其分离菌株毒力不够强，或毒力遗传性状不稳定，在鸡胚或细胞连续传几代其毒力效价明显降低，而降低疫苗的效价的不足。实验证明采用本发明的方法可以使制苗菌株SX5或NX对6-7日龄SPF鸡胚的毒力效价为10-11-10-13ELD50，鸡胚连续传代20代以内毒力保持不变。
3)本疫苗的应用，不必再服用抗生素类化药预防衣原体感染，从而使奶牛体内药物残留大大降低，可以有效保证奶牛源的食品安全，维护人民饮食的安全。另一方面也可以大大降低牛饲养的成本，提高经济效益。
具体实施例方式
以下提供本发明的一个实施例a)种毒的复苏与检验将-70℃长期保存的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX制苗菌株接种于无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代，可使全部接种鸡胚在接种72小时以后规律地死亡，取死亡鸡胚的卵黄膜涂片姬姆萨染色镜检，只看见大量紫红色的衣原体原生小体(E)，而没有任何其他杂菌污染，此鸡胚培养物可以作为繁殖疫苗抗原的种(子)毒。
b)抗原繁殖与检验将衣原体抗体阴性产蛋种鸡群所产的种蛋表面清洗消毒后，放入专用孵化机37℃孵化6-7天，将种毒用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液或生理盐水10000倍稀释在无菌环境里，经卵黄囊途径接种鸡胚，接种剂量0.4ml/鸡胚。收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，其中含有大量的衣原体原生小体。细菌检查为阴性，效价检测≥10-8ELD50为合格，可用于制苗。
c)抗原灭活与检验将b)检验合格的抗原(卵黄膜)用组织捣碎机捣碎后过滤，然后将滤液用0.1M pH7.2 PBS稀释20倍，按稀释后抗原量的0.2％加入浓度37％以上的市售甲醛，充分摇均匀，容器严格密封好，于4℃环境灭活72小时，每天要摇容器2-3次，每次振荡5分钟。抗原灭活72小时后，无菌抽取样品，分别接种人工培养基和6-7日龄鸡胚培养，人工培养基内无任何细菌生长，鸡胚发育正常无死亡，说明抗原灭活合格，可以用于制苗。
d)抗原乳化与检验选用矿物油佐剂(206佐剂或11号食用白油)高压消毒。将灭活抗原与油佐剂按1∶1比例混合、摇均匀。用高压均质机乳化，乳化时压力调到35-40Pa，乳化抗原呈乳白色，乳化型为油包水包油，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圆形，并且云雾状散开。疫苗分装入疫苗瓶。
e)疫苗检验按照国家生物制品检验的规定，随即取样，每瓶受检疫苗分别接种人工培养基和小白鼠，进行无菌检验、安全检验和效力检验。效力检验攻毒所用的种毒为原制苗菌株。试验组5只小鼠接种本疫苗后2l天攻毒，从所有小鼠均检不出衣原体(组织常规涂片染色检查或PCR检查为阴性)；对照组5只不接种本疫苗，同期攻毒，从所有小鼠均可以检出衣原体(组织常规涂片染色检查或PCR检查为阳性)。此为疫苗效检合格。试验组5只小鼠接种本疫苗后生长发育正常。同时无菌检验为阴性。生产的此批疫苗为检验合格。
本发明的效力试验数据见表1表1 奶牛疫苗效力试验

表l说明用本发明的3批奶牛衣原体病灭活疫苗(疫苗批号为040113、040210、040317)分别免疫3组衣原体抗体检查阴性奶牛，每组3头，免疫剂量5ml/头，免疫后2l天攻毒，结果3个试验组有l头发病，其保护率分别为3/3，2/3，3/3；本次试验的总保护率为8/9(88.9％)。对照组2头奶牛不接种本疫苗，攻毒后2/2发病，保护率为0/2。
本发明用于奶牛进行疫苗免疫期试验的数据见表2表2奶牛疫苗免疫期试验

表2说明用本发明的3批奶牛衣原体病灭活疫苗(疫苗批号为030312、030327、030403)分别免疫3组衣原体抗体检查阴性奶牛，每组3头，免疫剂量5ml/头，免疫后10个多月攻毒，结果3个试验组全保护，保护率分别为3/3，3/3，3/3；对照组2头奶牛不接种本疫苗，攻毒后2/2发病，保护率为0/2。
犊奶牛疫苗免疫安全性试验、怀孕奶牛疫苗免疫安全性试验，以及奶牛田间免疫安全性试验结果见表3-1、3-2和3-3。
表3-1 犊奶牛疫苗免疫安全性试验(30-40日龄)

表3-2怀孕奶牛疫苗免疫安全性试验(怀孕2个月左右)

表3-3奶牛田间免疫安全性试验

表3(1-3)说明实验室3批试验表明本发明的奶牛衣原体病灭活疫苗对犊牛、怀孕2个月左右的成年奶牛均十分安全。田间免疫奶牛5180头没有发生1头死亡，注射部位和饮食无明显异常改变，打疫苗后，泌乳量基本正常。
权利要求
1.牛衣原体病灭活疫苗的制备方法，其特征在于将牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX种毒用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液或生理盐水10000倍稀释，接种于37℃孵化6～7天的且无鹦鹉热衣原体感染的健康鸡胚，收获接种72小时以后死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，将抗原用组织捣碎机捣碎后过滤，然后将滤液用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)20倍稀释，按稀释后抗原量的0.2％加入浓度37％的甲醛，容器严格密封好，充分摇均匀，于4℃环境灭活72小时，用消毒的206佐剂或11号食用白油作为佐剂，将灭活抗原与油佐剂按1∶1比例混合、摇均匀，用高压均质机乳化，得疫苗。
2.根据权利要求1所述的牛衣原体病灭活疫苗的制备方法，其特征在于制苗菌株SX5或NX(种毒)，使用时先接种于37℃孵化6～7天的无鹦鹉热衣原体感染的健康鸡胚，传1-2代进行复苏，复苏方法是将长期超低温保存的制苗菌株SX5或NX用灭菌生理盐水10倍稀释，接种6-7日龄鸡胚，在无菌条件下收取接种第4-6天死亡的鸡胚的卵黄膜粉碎后作为第一代种毒，将种毒粉碎后用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)或等渗盐水1000倍稀释再将其按前述的方法接种于二代鸡胚上，再在无菌条件下收取接种第4-6天死亡的第二代鸡胚的卵黄膜粉碎后作为制取制苗抗原的种毒。
3.根据权利要求2所述的牛衣原体病灭活疫苗的制备方法，其特征在于制苗菌株SX5或NX(种毒)，使用时先接种于37℃孵化6～7天的无鹦鹉热衣原体感染的健康鸡胚，传2代进行复苏。
4.根据权利要求1或2或3所述的牛衣原体病灭活疫苗的制备方法所制备的疫苗。
5.牛衣原体病灭活疫苗制备中的检验方法，其特征是a)种子毒检验将-70℃长期保存的牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX制苗菌株接种无衣原体感染的种鸡群所产的37℃孵化的6-7日龄鸡胚，传1-2代，可使全部接种鸡胚在接种72小时以后规律地死亡，取死亡鸡胚的卵黄膜涂片姬姆萨染色镜检，只看见大量紫红色的衣原体原生小体(E)，而没有任何其他杂菌污染，并且其毒力效价为10-11-10-13ELD50，此鸡胚培养物可以作为繁殖疫苗抗原的种(子)毒。b)抗原繁殖检验收获接种后72小时死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，其中含有大量的衣原体原生小体，而细菌检查为阴性，效价检测≥10-8ELD50为合格；c)抗原灭活检验抗原灭活72小时后，无菌抽取样品，分别接种人工培养基和6-7日龄鸡胚培养，人工培养基内无任何细菌生长，鸡胚发育正常无死亡，说明抗原灭活合格，可以用于制苗；d)抗原乳化检验乳化抗原呈乳白色，不分层。乳化型为水包油包水，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圆形，并且云雾状散开为合格；e)疫苗检验随机取样，每瓶受检疫苗分别接种人工培养基和小白鼠，进行无菌检验、安全检验和效力检验，试验组5只小鼠接种本疫苗后21天攻毒，从所有小鼠均检不出衣原体，接种小鼠生长发育正常，同时无菌检验为阴性的为疫苗效检合格。
全文摘要
本发明涉及一种防治牛传染病的灭活疫苗的制备方法，以及这种疫苗和制备过程中的相关检验方法。本发明的制备方法是将牛源鹦鹉热衣原体SX5或NX种毒用磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释，接种于37℃孵化6～7天的且无鹦鹉热农原体感染的健康鸡胚，收获接种72小时以后死亡鸡胚的卵黄膜和尿囊液作为制苗用抗原，再将经捣碎的抗原用稀释后加入甲醛灭活，再将灭活抗原与油佐剂按1∶1比例混合、摇均匀，用高压均质机乳化，得疫苗。
文档编号A61K39/118GK1698892SQ20051004261
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者邱昌庆, 程淑敏, 周继章, 曹小安, 高双娣 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所