专利名称：人工骨骼材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于骨损伤修复的人工骨骼材料。
背景技术：
近年，整形外科等领域中普遍使用人工骨骼材料进行对各种疾患产生的骨损伤进行修复。作为人工骨骼材料，主要使用磷酸二氢钙类陶瓷。磷酸二氢钙类陶瓷材料具有优异生物相容性、良好的骨传导能力，并有作为骨形成基础的作用。但骨损伤严重时，单独使用磷酸二氢钙类陶瓷材料很难进行修复，所以，对于这样的病例只能移植自身的骨骼，但受采骨量限制，很难对骨损伤进行修复。
基于这样的背景，骨损伤严重的病例，期待着具有更高骨形成能力的材料，即具有骨诱导活性的移植用材料。以此为背景，以上述磷酸二氢钙类陶瓷材料为载体，培养骨髓细胞，进行了植入细胞型人工骨骼材料的研究。
吉川等将人培养骨髓细胞和多孔羟磷灰石混合，在骨形成培养基中培养3周后，将其移植到裸鼠腹腔内，2个月后摘除，进行组织学评价，证明骨形成明显。(日整会志，73(3)，S672)。
在多孔陶瓷中植入培养骨髓细胞的人工骨骼存在如下课题。
首先，要使骨髓细胞侵入到多孔陶瓷的中心。使用的多孔陶瓷的型号变大时，骨髓细胞很难进入到中心部分。另外，即使细胞侵入到多孔陶瓷的中心部分，血管也不能到达中心部分，氧分压低，还有不能发挥作为成骨细胞的功能的问题。
其次，作为植入细胞的载体的多孔材料存在如下课题。具体如下。成为载体的材料需要满足如下条件载体必需有高的生物相容性，并且不影响培养细胞的活性，还要有骨传导能力，并且在移植后进行骨形成的同时载体本身可被吸收。作为载体的骨胶原或聚乳酸乙醇酸等具有生物降解能力，虽然能满足作为载体条件的分解吸收性，但是骨传导能力差，所以不是优选的材料。
另一方面，磷酸二氢钙类陶瓷的骨传导能力优异，从这点出发优选这类材料。但是最常见的作为人工骨骼的HAP的磷酸二氢钙很难在生物体内被吸收，因此，从吸收性的角度出发，则不是优选的材料。而β-磷酸钙(β-TCP)具有良好的吸收性，并且具有骨传导能力，是作为载体的最理想材料。
从所述观点出发，以往β-TCP单独作为骨补充材料使用。但是，Altermatt等在出版物(Eur.J.Pediatr.Surg.2，180～182)中报道了经观察，多孔β-TCP应用于骨囊肿时，作为材料，在补充部位最长可以存在7年。β-TCP虽然具有可被吸收的性质，但还有长期存在的情况，β-TCP不是根本意义上的理想材料。
实际使用中β-TCP的纯度也是个问题。β-TCP一般的制作方法有干式的通过使碳酸钙和磷酸钙发生固相反应的方法，湿式的使钙离子和磷离子反应的方法。
但是，干式方法因为反应不是均质的，残留一定的未反应物，生成的粉末缺乏烧结特性。湿式方法中必需精确的控制温度和pH，Ca和P的比例与化学理论量略有不同就会含有微量的副产物。原料的性质受制造工艺的影响很大，其制造工艺差会导致在使用阶段出现所不希望的结果，而以往对所述影响完全没有研究。并且形成多孔β-TCP的气孔形状也是影响骨传导能力和吸收性的因素。

发明内容
基于以上事实，本发明的目的是通过复合β-TCP和培养骨髓细胞，提供促进骨形成的理想人工骨骼材料。
为了达到上述目的，权利要求1的发明的人工骨骼材料的特征为，在β-磷酸钙形成的多孔陶瓷的内部植入骨髓细胞。
权利要求2的发明是如权利要求1所述的人工骨骼材料，其特征为，所述骨髓细胞中还复合了提供骨形成的细胞增殖因子。
权利要求3的发明是如权利要求1所述的人工骨骼材料，其特征为，所述多孔陶瓷的气孔率为60～90％，具有多个气孔连同的50～1000μm大小的巨型气孔和2μm以下的微型气孔。
权利要求4的发明是如权利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征为，所述多孔陶瓷使用通过机械化学方法合成的β-磷酸钙粉末作为原料，成形后烧结处理形成。
权利要求5的发明是如权利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征为，所述骨髓细胞是从患者身上采取培养的培养细胞。
权利要求6的发明是如权利要求5所述的人工骨骼材料，其特征为，在培养中对所述培养细胞给予电或/和机械刺激。
权利要求7的发明是如权利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征为，所述培养细胞通过下述(a)～(c)中的至少一种方法或组合的方法播种到多孔陶瓷的内部。
(a)减压或加压下播种培养细胞。
(b)反复减压和加压播种培养细胞。
(b)利用离心力播种培养细胞。
具体实施形式本发明的人工骨骼材料是，通过播种，在由β-TCP形成的陶瓷内部植入骨髓细胞的物质。多孔陶瓷的形状可以是块状或颗粒状。
使细胞侵入到多孔陶瓷的中心部分过程中，向多孔陶瓷材料播种培养骨髓细胞时，为了有效地播种，可以在减压或加压的情况下进行，或在反复减压和加压的情况下进行，或利用离心力的作用进行。这样可以使骨髓细胞进入到多孔陶瓷的中心部分。此时，组合几个所述的方法可以更加有效。
另外，通过细胞培养中施加电或机械刺激，例如施加电场、增加各向同性压力，增加冲击波等，可以增加细胞的增殖性，从而可以维持细胞活性。
通过将VEGF等血管新生的诱导因子复合在骨髓细胞上，使多孔陶瓷的内部的血管新生成为可能。此时，优选通过使用VEGF的表达载体导入基因进行复合。
另外，除了培养细胞，不仅复合VEGF，还复合提供骨形成的细胞增殖因子，从而可以更好的实现骨形成。例如，通过使用BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF等提供骨形成的细胞增殖因子可以确保骨形成。
复合β-TCP形成的多孔陶瓷和培养骨髓细胞的人骨骼材料以促进骨形成。该人工骨骼材料中，作为β-TCP，使用高纯度的具有优异骨传导能力和吸收性的材料。
由β-TCP形成的多孔陶瓷具有多个气孔连通的巨型气孔和比此巨型气孔小的微型气孔，其气孔率优选60～90％。作为巨型气孔，大小优选在50～1000μm，更优选在100～500μm。作为巨型气孔，优选容积率为全部气孔的30～70％左右。该巨型气孔可以提供骨髓细胞向陶瓷内侵入和血管新生的空间。
微型气孔优选大小在2μm以下，更优选在1μm以下。另外，微型气孔优选容积率占全气孔的10～40％左右。该微型气孔具有促进使吸收容易的化学作用。
高纯度的β-TCP是利用湿式粉碎的机械化学法制造的，其可以作为用于骨组织的代替材料的材料成分。所述机械化学法具体如下所述，称取碳酸钙和磷酸氢钙二水合物，Ca和P的摩尔比为1.5，采用湿式粉碎，将该粉末在球磨机中粉碎，得到泥浆状混合物，将该泥浆状混合物干燥，然后在720℃～900℃焙烧，得到β-TCP。通过该方法可以在原料的称量上控制Ca和P的比例，得到纯度高且烧结性优异的β-TCP。
由具有优异的骨传导能力和吸收性的β-TCP形成的多孔陶瓷的方法如下所述。向通过湿式粉碎方法得到的β-TCP粉末中加入表面活性剂(散凝剂)，湿式发泡成型后干燥处理，于950℃～1050℃焙烧成多孔体。通过该方法可以得到气孔率为60～90％，具有多个气孔连通的50～1000μm大小的巨型气孔，其容积率为总气孔的30～70％，并且具有2μm以下的微型气孔，其容积率为总气孔的10～40％的多孔陶瓷。
复合由上述的β-TCP形成的多孔陶瓷和培养骨髓细胞制成的人工骨骼材料可以作为很好的促进骨形成的人工骨骼材料。
实施例1称取摩尔比为1∶2的碳酸钙粉末和磷酸氢钙二水合物，并与纯水一起投入到球磨机钵中，用球磨机混合粉碎约1天。在约80℃干燥得到的泥浆状混合物，然后在750℃焙烧。得到的粉末是烧结性优异、纯度高的β-TCP陶瓷。
向该粉末中加入纯水和丙烯酸铵类散凝剂与聚氧乙烯烷基苯基醚类表面活性剂，混合搅拌，配制发泡泥浆。干燥该发泡泥浆，然后在150℃焙烧，得到β-TCP多孔陶瓷。该多孔陶瓷的气孔率为75％，气孔孔径分布在100～500μm和1～0.1μm的2个范围。
实施例2以实施例1制作的β-TCP多孔陶瓷作为基础材料，播种来源于骨髓的成骨细胞的第一代培养细胞，体外培养，形成骨形成种子的骨组织，植入生物体，从植入的组织形成大量的骨组织。具体方法如下所述。
采取骨髓细胞，接种到培养瓶中，MEM培养基中加入10～15％的FBS(牛胎儿血清)，5％CO2下，在37℃培养10天左右。然后通过胰蛋白酶处理，从培养瓶中分离细胞，接着播种到由β-TCP形成的块状多孔陶瓷中。培养基使用加入10～15％的FBS(牛胎儿血清)的MEM培养基。
对5mm×5mm×5mm的块状多孔陶瓷播种时，细胞浓度为1cc的培养基中含有100万个或100万个以上的细胞。在5％CO2下，于37℃恒温培养1-3小时后，更换培养基，在加有10-15％FBS(牛胎儿血清)的MEM培养基的基础上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗坏血酸，每2日进行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒温培养2周左右。然后将各多孔陶瓷块植入生物体内。
其后，从fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培养该骨髓液，播种到由β-TCP多孔陶瓷形成的块料上，培养2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通过HE染色研究证明骨形成良好。
实施例3使实施例1制作的β-TCP多孔陶瓷上吸附细胞增殖因子进行播种。作为细胞增殖因子，分别使用VEGF、BMP、FGF、FGF-β、IGF、PDGF。体外培养，形成骨形成种子的骨组织，植入生物体，从植入的组织形成大量的骨组织。具体方法如下所述。
分别采取上述细胞增殖因子，接种到培养瓶中，MEM培养基中加入10～15％的FBS(牛胎儿血清)，在5％CO2下，在37℃培养10天左右。然后通过胰蛋白酶处理，从培养瓶中分离细胞，接着播种到由β-TCP形成的块状多孔陶瓷中。培养基使用加入10～15％的FBS(牛胎儿血清)的MEM培养基。
播种时，各细胞增殖因子的播种方法分别采用减压下播种、加压下播种和反复减压加压下播种的方法，同时采用利用离心力作用的播种方法，制作各播种条件的试验体。
对5mm×5mm×5mm的块状多孔陶瓷播种时，细胞增殖因子的浓度为1cc的培养基中含有100万个或100万个以上的细胞。在5％CO2下，于37℃恒温培养1-3小时后，更换培养基，在加有10-15％FBS(牛胎儿血清)的MEM培养基的基础上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗坏血酸，每2日进行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒温培养2周左右。然后将各多孔陶瓷块植入生物体内。
其后，从fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培养该骨髓液，播种到由β-TCP多孔陶瓷形成的块料上，培养2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通过HE染色研究证明骨形成良好。
如上所述，通过本发明，在β-TCP多孔陶瓷中植入骨髓细胞可以提供能够很好地促进骨形成的人工骨骼材料。另外，通过各向同性压力等机械刺激或复合VEGF等细胞增殖因子，可以确保骨形成，从而进一步提高实用性。
权利要求
1.一种人工骨骼材料，其特征为，在β-磷酸钙形成的多孔陶瓷的内部植入骨髓细胞。
2.如权利要求1所述的人工骨骼材料，其特征为，所述骨髓细胞中还复合了提供骨形成的细胞增殖因子。
3.如权利要求1所述的人工骨骼材料，其特征为，所述多孔陶瓷的气孔率为60～90％，具有多个气孔连通的50～1000μm大小的巨型气孔和2μm以下的微型气孔。
4.如权利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征为，所述多孔陶瓷使用通过机械化学方法合成的β-磷酸钙粉末作为原料，成形后烧结处理形成。
5.如权利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征为，所述骨髓细胞是从患者身体采取培养的培养细胞。
6.如权利要求5所述的人工骨骼材料，其特征为，在培养中对所述培养细胞给予电或/和机械刺激。
7.如权利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征为，所述培养细胞通过下述(a)～(c)中的至少一种方法或组合的方法播种到多孔陶瓷的内部(c)减压或加压下播种培养细胞；(b)反复减压和加压播种培养细胞；(d)利用离心力播种培养细胞。
全文摘要
在由β－磷酸钙形成的多孔陶瓷内部植入骨髓细胞，提供人体相容性良好的有利于骨形成的人工骨骼材料。
文档编号A61L27/56GK1501818SQ02807099
公开日2004年6月2日 申请日期2002年3月22日 优先权日2001年3月23日
发明者袴塚康治, 入江洋之, 井上晃, 増渕良司, 冈部洋, 植村寿公, 之, 公, 司, 康治 申请人:奥林巴斯株式会社, 独立行政法人产业技术综合研究所