专利名称：信号调节蛋白α在制备预防和治疗肿瘤的巨噬细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物工程技术领域。具体的说，本发明涉及一种信号调节蛋白 α (SIRPa)在制备预防和治疗肿瘤的巨噬细胞中的应用。
背景技术：
肿瘤中浸润的巨噬细胞又称肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)是浸润的炎性细胞的主要成分。研究表明肿瘤细胞通过分泌细胞因子、趋化因子等从外周血中募集单核细胞到达肿瘤局部，诱导分化形成肿瘤相关巨噬细胞。 肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤细胞的增殖、存活、浸润和转移中起重要作用，主要包括形成慢性炎症的微环境，降解细胞外基质，肿瘤细胞浸润，进入血管，促进血管生成，在远隔部位种植等0 (John Condeelis, Jeffrey W. Pollard. Macrophages :0bligate Partners for Tumor Cell Migration，Invasion, and Metastasis. Cell. 124 :263-266.)信号调节蛋白α (SIRPa)属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，是一类主要表达在骨髓细胞和神经元细胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌细胞、血管内皮细胞等也有少量表达。 SIRPa胞外区由三个免疫球蛋白超家族结构域(IgSF)组成，通常被高度糖基化，结构学研究显示它与抗原受体如TCR和BCR在非常类似，提示SIRPs家族分子可能是机体免疫系统进化的重要一环，参与调节免疫细胞活化。SIRPa胞质区在人、大鼠和小鼠之间高度保守， 具有富含酪氨酸残基的免疫受体抑制基序(ITIMs)，可以被蛋白激酶如Src蛋白磷酸化，进而与含有SH2结构域的蛋白如酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2结合，抑制免疫细胞的激活。 目前普遍认为SIRPa是一类抑制性受体。已有文献报道SIRP α可以抑制LPS刺激引起的巨噬细胞活化，抑制中性粒细胞的迁移等。然而一部分研究证明SIRP α亦可以发挥正性调节作用，例如巨噬细胞SIRPa与配体结合后可以促进JAK-STAT的活化并促进NO的形成。 (Jacqueline Alblas. Signal Regulatory Protein Ligation Induces Macrophage Nitric Oxide Production through JAK/STAT-and Phosphatidylinositol 3-Kinase/Racl/NAPDH 0xidase/H202-Dependent Pathways. MOL CELL BIOL. 25 :7181-7192)慢病毒载体指以人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)来源的一种病毒载体，能够稳定高效的将外源基因整合到宿主染色体上，实现持续性表达。慢病毒载体可以克服脂质体转染效果差，持续时间短等缺点，已广泛应用与生物学研究中。

发明内容
本发明的目的在于提供信号调节蛋白α的新用途，特别是提供一种通过慢病毒载体介导上调巨噬细胞信号调节蛋白α (SIRPa)的表达，调节肿瘤相关巨噬细胞的功能， 达到预防和治疗肿瘤的作用。本发明提供了信号调节蛋白a (SIRPa)在制备预防和治疗肿瘤的巨噬细胞中的应用。具体是通过构建SIRPa过表达的慢病毒载体，体外转染分离获得的巨噬细胞，获得过表达SIRPa的巨噬细胞，用于预防和治疗肿瘤。本发明的技术方案主要包括以下几个方面1、慢病毒表达质粒的构建LV-WT-SIRP α、LV-microRNA-SIRP α、LV-GFP2、表达质粒与包装质粒共转细胞，包装慢病毒，滴度检测；3、分离培养外周单核细胞，骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)，肿瘤局部的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)；4、慢病毒转染细胞；5、体外观察肿瘤细胞共培养条件下SIRP α过表达与干扰的巨噬细胞(a)细胞表型的改变-流式检测MHC II ;(b)迁移粘附到肿瘤局部-Transwell能力，细胞骨架改变，粘附相关分子表达；(c)表达分泌肿瘤炎症与免疫相关分子-Real-Time与ELISA检测IL-6、 TNFa、IL-12、IL-10等；(d)微环境中生存能力的改变-PI/Annexin V染色，Caspase相关分子的改变。6、体外观察肿瘤细胞共培养条件下SIRP α过表达与干扰的肿瘤相关巨噬细胞 (TAMs)研究内容同5 ；7、体外观察SIRP α过表达与干扰的巨噬细胞对肿瘤细胞的调节(a)巨噬细胞表面分子的改变-流式检测TRAIL、FasL ； (b)肿瘤细胞凋亡-PI/Annexin V染色，Caspase相关分子改变。(c)肿瘤细胞增殖-CCK-8检测；8、体内观察SIRPa过表达与干扰的巨噬细胞对肿瘤的影响在预防和治疗肿瘤模型中定期注射慢病毒载体介导的SIRPa过表达与干扰的巨噬细胞，观察对肿瘤大小和小鼠生存时间的影响。本发明提供了信号调节蛋白α (SIRPa)的新用途。实验结果表明1)如图2所示，巨噬细胞SIRPa负性调控其向肿瘤细胞的迁移。与无H印al_6 细胞条件相比，巨噬细胞与ifepal-6细胞共培养时向!fepal-6迁移的能明显增强，低表达 SIRPa促进巨噬细胞的这种迁移能力。2)如图3所示，巨噬细胞SIRP α负性调控肿瘤炎症微环境。图3_1与3_2说明肿瘤微环境刺激巨噬细胞分泌IL-6、TNF a、ILl β等炎性因子，低表达SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力强于对照组，。图3-3说明SIRP α调控BMDMs与炎症和免疫相关的信号通路。3)如图4所示，巨噬细胞SIRP α负性调控细胞存活。低表达SIRP α的BMDMs在相应刺激下PARP与Caspase-3剪切体的表达低于对照组。4)如图5显示，巨噬细胞SIRP α负性调控肿瘤的生长。图5_1显示高表达SIRP a 的巨噬细胞培养上清明显抑制B16F10肿瘤的生长，图5-2显示回输慢病毒载体介导的高表达SIRP α的BMDMs抑制B16F10的生长。图5_3显示回输慢病毒载体介导的高表达SIRP a 的巨噬细胞抑制H印al-6的生长。实验结果证明巨噬细胞SIRPa负性调控肿瘤的发生发展。本发明提供了一种利用慢病毒载体针对肿瘤相关巨噬细胞的方法，可以用于预防和治疗小鼠肝癌、黑色素瘤等肿瘤，进而可以预防和治疗哺乳动物肿瘤，特别是与巨噬细胞相关的肿瘤如肝癌、乳腺癌等。本发明为SIRPa的临床应用提供了新的思路。本发明提供了一种新型的肿瘤治疗方案。


图1是慢病毒表达质粒的构建、鉴定及包装、感染。SIRP α表达特异性检测。其中图1-1 为 Western-Blot 检测 LV-WT-SIRP α、LV-miRNA-SIRP α、LV-GFP 质粒包装的慢病毒的感染效果；图1-2为Wfestern-Blot检测LV-miRNA-SIRP α包装的慢病毒的不同滴度的感染效果以及肿瘤细胞Hepal-6表达SIRP α的情况。图2是SIRP α与巨噬细胞迁移到肿瘤局部的能力其中图2-1是利用Transwell方法，光镜下观察BMDMs KD Control组与!fepal-6 细胞共培养10hr、20hr后的迁移能力；图2_2是对图2_1的各组细胞计数后进行统计分析。图3是SIRP α调节巨噬细胞在肿瘤微环境中的表型其中图3-1为高低表达SIRP α的巨噬细胞与肿瘤细胞细胞共培养后IL_6、TNF α、 IL10、IL12等细胞因子的表达情况；图3-2为ELISA检测高低表达SIRP α的巨噬细胞与肿瘤细胞细胞共培养后IL-6、TNFa、IL10、IL12的水平；图3_3为高低表达SIRP α的巨噬细胞与肿瘤细胞细胞共培养后相应信号通路的改变。图4是SIRP α调节巨噬细胞存活的能力其中图4-1是干扰SIRP α表达和对照的巨噬细胞在IFN γ诱导下发生凋亡情况。 分别检测了参与凋亡途径的caSpaSe3和PARP剪切情况；图4-2是干扰SIRP α表达和对照的巨噬细胞在TNF+CHX的作用下发生凋亡情况，实验分别检测了 CaSpaSe3和PARP剪切情况。图5是SIRP α调节肿瘤细胞体内生长的能力其中图5-1为高低表达SIRP α的巨噬细胞共培养上清与B16F10肿瘤生长的能力；图5-2为体内回输高低表达SIRP α的巨噬细胞与B16F10肿瘤生长的能力；图5_3为高低表达SIRP α的巨噬细胞与!fepal-6细胞皮下接种C57小鼠后瘤体生长的能力。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1 :SIRPa表达载体的构建、鉴定及干扰序列的合成、鉴定；SIRP α特异性表达检测材料1) SIRP α慢病毒表达载体与干扰载体和包装载体Lenti-Linker、VSVG, PACK,线性化载体 pcDNA6. 2-Gff/miR 购自 hvitrogen 公司；2)克隆引物为鼠源SIRP α mRNA开放阅读框起始和终止引物序列，委托上海生工合成。3)克隆过程使用限制性内切酶和Τ4连接酶购自NEB公司。4) 293Τ, Hepal-6细胞系购自上海市中科院细胞所。
5) M-CSF等细胞因子购自P^rotech公司6)转染试剂 PEI 购自 Polyplus-transfection 公司。7)兔抗鼠多克隆抗体SIRPa由本实验室自行制备(参见Kharitonenkov A. Afamily of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 1997Mar 13 ；386 (6621) :181-6.)。方法1)慢病毒表达载体与干扰载体构建、鉴定1. 1构建干扰慢病毒载体LV-miRNA-SIRP α构建慢病毒干扰载体LV-microRNA-SIRP α，设计干扰引物，引物序列如下上游TGCTGTCTATGAGCAGATGAGTTCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGAACTCCTGCTCATAG(SEQ ID NO 1)下游 CCTGTCTATGAGCAGGAGTTCACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTGAACTCATCTGCTCATAGAC(SEQ ID NO 2)引物于95 °C退火5min，冷却至常温形成二聚体。T4连接酶连接至pcDNA6. 2-Gff/miSIRP α制备干扰质粒。再以该质粒为模版，通过上游引物 GGACTAGTGCAGATATCAACAAGTTTG(SEQ ID NO 3)(带 Spe 1 酶切位点)，和下游引物 GGACT AGTCTGCGGCCGCACCACTTTGTACAAGAAAGTCGG(SEQ ID NO 4)(带 Spel 酶切位点)PCR 扩增 GFP-miSIRP α片段，得到约900bp的片段，经Spel单酶切后连入NheI和SpeI双酶切的 pLenti-linker1. 2构建过表达慢病毒载体LV-WT-SIRP α以小鼠cDNA为模版，设计相应引物PCR获得目的片段。引物序列如下上游GGATCCATGGAGCCCGCCGGCCCG(SEQID NO 5)(带 BamHI 酶切位点)下游GCTAGCTCACTTCCTCTGGACCTGGACACT(SEQID NO 6)(带 NheI 酶切位点)使用高保真KOD酶体系扩增获得全长序列约1500bp，BamHl与NheI双酶切表达载体和目的片段，酶切鉴定后，用T4连接酶连接至表达载体。幻慢病毒包装，滴度检测细胞在IOcm培养皿中培养至70%汇合度，采用磷酸钙法(参照分子克隆，第三版，1282-1287页)共转慢病毒表达质粒与包装质粒，60hr后收集培养上清，测定病毒滴度，具体方法如下传四31~细胞IX IO5于M孔板，用无血清培养基稀释病毒原液1 10、 1 100、1 1000加入M孔板，感染体积为200 μ 1。感染60hr后，收集细胞经流式计数鉴定。病毒滴度公式计算为滴度(/ml)比例％ X(IXlO5)X稀释倍数/培养体积ml。3)干扰效果检测分离小鼠骨髓细胞，M-CSF 100ng/ml培养7天，分化成熟形成巨噬细胞(BMDMs)， 1 X IO6/孔传至6孔板，使用干扰SIRP α慢病毒，选定MOI值为50，80，感染8hr后换液，感染60hr后观察感染效率，Western-Blot检测效果。4) SIRP α特异性表达检测本发明中肿瘤模型建立在H印al-6等肿瘤细胞模型基础上，因此flfestern-Blot检测H印al-6细胞SIRP α的表达情况。结果如图1所示，通过flfestern-Blot检测，LV_WT_SIRP α包装的过表达慢病毒能够有效的提高巨噬细胞SIRP α的表达，同时LV-miRNA-SIRPa包装得到的慢病毒能下调巨噬细胞SIRP α的表达。如图1-2所示，当MOI =40时，巨噬细胞可以获得较好的干扰效果，因此以下实验建立在此干扰效率的基础上。同时图1-2显示，与BMDMs相比，!fepal-6细胞的 SIRPa表达量很低，说明SIRPa主要表达于BMDMs，具有较好的特异性。实施例2 =SIRPa与巨噬细胞迁移到肿瘤局部能力材料DTranswell 24 孑L板，0. 8 μ m，购自 Corning 公司2)0. 结晶紫、0.4%多聚甲醛购自国药公司3)!fepal-6细胞购自上海市中科院细胞所4) C57/BL6小鼠购自中科院方法分离培养C57小鼠的BMDMs，肿瘤细胞Hepal-6种植于Transwell下室，BMDMs SIRPaKD, Control组细胞种植于细胞上室，加入无血清DMEM培养基，培养10hr、20hr后 0.4%多聚甲醛固定BMDM细胞15min，0. 结晶紫染色15-30min，生理盐水洗净后镜下观察，每孔在100X视野条件下随机选取5个视野，计数细胞总数取均值为该孔细胞数。结果如图2-1与图2-2所示，无肿瘤细胞存在条件下，差异表达SIRPa的BMDMs迁移能力没有明显差别。在与ifepal-6细胞共培养时，巨噬细胞向ifepal-6迁移的能明显增强， SIRPa抑制巨噬细胞向肿瘤细胞的迁移。说明SIRPa负性调节巨噬细胞向肿瘤局部迁移的能力。实施例3 =SIRP α调节巨噬细胞在肿瘤微环境中的表型材料l)mIL_6、mTNFa、mILlO、mIL12 等引物由生工公司合成，2) Sybr-Green 购自 TaKaRa 公司3)mIL-6、mTNFa、mILlO、mIL12 等 ELISA 试剂盒购自达科为公司4)B16细胞购自中科院5) TRIZOL 购自 Invitrogen 公司6) M-MLV逆转录体系购自Promega公司7)p-statl、p-stat3、IkBa、N0S2 等抗体购自 Cell signaling technology 公司方法1)H印al_6、B16 细胞与 BMDMs SIRP α KD，Control 细胞共培养 12M36hr，收取培养上清进行ELISA检测，同时收取BMDMs的RNA，逆转录得到相应cDNA，通过Real-Time检测相关细胞因子的表达。2) BMDMs与!fepal-6细胞细胞共培养0、l、3Jhr，收取蛋白，Western-Blot检测相关分子的表达情况。结果图3-1与图3-2分别从mRNA与蛋白水平显示肿瘤微环境能够刺激巨噬细胞分泌 IL_6、TNFa、ILli3等炎性因子，低表达SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力强于对照组， 提示低表达SIRPa可以促进肿瘤炎症环境。
图3-3显示SIRP α调控BMDMs细胞与炎症和免疫相关的信号通路，低表达SIRP α 可以增强乂&13、11^(1的磷酸化与，抑制Matl的磷酸化与N0S2的表达，提示SIRP α可以抑制巨噬细胞肿瘤相关的免疫功能。实施例4 =SIRP α与巨噬细胞存活的关系材料1) mTNF α、mIFN γ 订购自 ρ印rotech 公司2) Caspase-3、PARP 抗体购自 CST 公司方法DBMDMs SIRP α KD 和 Control 组细胞 CHX lng/ml 预处理过夜，TNF α 10ng/ml 刺激 0、6、12hr，收取蛋白 Western-Blot 检测 Caspase-3、PARP 的表达；2) IFNy 100ng/ml 朿Ij 激 BMDMs SIRP α KD Control 组细胞 0243648hr， Western-Blot 检测 Caspase-3> PARP 的表达。结果如图4-1 所示，低表达 SIRP α 的 BMDMs 在 CHX+TNF α 刺激下，PARP 与 Caspase-3 剪切体的表达低于对照组，提示SIRP α促进CHX+TNFa引起的细胞凋亡。图4-2显示低表达SIRP α的BMDMs抑制IFN γ诱导的PARP与Caspase-3剪切体的表达，提示SIRP α促进IFN γ引起的细胞凋亡。以上结果提示，SIRPa负性调节有害刺激引起的细胞凋亡。实施例5 =SIRPa与肿瘤体内生长的关系材料l)C57/BL6、Balb/c 小鼠购自中科院2)Hepal-6,B16F10细胞系购自中科院细胞所方法1)B16F10 细胞 5\105接种8&让/(；小鼠腹腔，同时收集B16F10 与 BMDMs SIRPa KD, Control细胞共培养上清，待肿瘤接种5天后，腹腔注射KD、Control上清250ul/只/天， 连续12天后，小鼠活体成像检测肿瘤大小；2) B16F10细胞5 X IO5接种Balb/c小鼠腹腔，同时体外分离小鼠BMDMs，干扰 SIRPa表达，待肿瘤接种5天后，将BMDMs SIRP a KD，Control 2 X IO6回输小鼠体内，待12 天后活体成像检测肿瘤大小；3)!1印&1-6细胞与腦01^ SIRP a KD，Control 细胞 1 :1 共 5 X IO6 皮下注射 C57/BL6 小鼠，并在相应时间测量肿瘤的大小。结果图5-1显示，低表达SIRPa的巨噬细胞培养上清能够明显促进B16F10肿瘤的生长，图5-2显示低表达SIRP α的BMDMs与B16F10共培养后亦能促进B16F10的生长。图 5-3显示，低表达SIRPa的巨噬细胞能促进H印al_6的生长。结果提示，低表达SIRPa的巨噬细胞能够促进肿瘤的体内生长。
权利要求
1.信号调节蛋白α在制备预防和治疗肿瘤的巨噬细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的信号调节蛋白α在制备预防和治疗肿瘤的巨噬细胞中的应用，其特征在于通过构建SIRP α过表达的慢病毒载体，体外转染分离获得的巨噬细胞，获得过表达SIRP α的巨噬细胞。
全文摘要
本发明属于医学生物工程技术领域。肿瘤中浸润的巨噬细胞又称肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是浸润的炎性细胞的主要成分。研究表明肿瘤细胞通过分泌细胞因子、趋化因子等从外周血中募集单核细胞到达肿瘤局部，诱导分化形成肿瘤相关巨噬细胞。信号调节蛋白α(SIRPα)属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，是一类主要表达在骨髓细胞和神经元细胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌细胞、血管内皮细胞等也有少量表达。本发明的目的在于提供信号调节蛋白α的新用途，具体是通过构建SIRPα过表达的慢病毒载体，体外转染分离获得的巨噬细胞，获得过表达SIRPα的巨噬细胞，用于预防和治疗肿瘤。
文档编号A61P35/00GK102335427SQ20111030380
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者潘宇飞, 王红阳, 董立巍, 谈冶雄 申请人:中国人民解放军第二军医大学