专利名称：含有氨基酸加合盐的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以氨基酸加合盐，其溶剂化物或其生理上可接受的盐为活性成分的药物组合物以及该组合物在治疗栓塞性疾病和癌转移中的应用。
血栓性疾病(例如中风、脑卒中、心肌梗死和半身不遂)的发生率和死亡率均居各种疾病之首。由癌细胞转移形成的继发性癌引起的癌症病人死亡大约占癌症病人死亡人数的80％。目前，应用药物抗栓和溶栓仍然是治疗血栓性疾病的主要手段。由于现有药物尚难以满足临床需要，研究开发疗效更好的新药成为研究者努力的方向。以粘附受体为靶点设计和寻找新的优秀抗血栓药物，是当前使用的一种有效方法。
由于血小板活化在血栓形成中起重要作用。纤维蛋白原中的RGD序列与活化的血小板表面受体结合是血栓形成的共同通路(Andrieux，A.，Hudry-Clergeon G.，Ryckewaert J.J.，et al.，Amino acid sequences infibrinogen mediating its interaction with its platelet receptor，GP IIb/IIIa，J.Biol，Chem.1989，264(16)，9258-9265)。国内外一些研究人员以阻断该通路为目标，进行了一系列含RGD多肽药物的筛选工作(PlowE.F.，Pier-schacher M.D.，Ruoslahti K.，et al.，The effect of Arg-Gly-Asp-containing peptides on fibrinogen and von willebrand factor bindingto platelets，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，8057-8061；Lender A.，Yao W.Q.，Sprengeler P.A.，Design and synthesis of sulfur-free cyclichexapeptides which contain the RGD sequence and bind to the fibrinogenGP IIb/IIIareceptor，Int.J.Peptide Protein Res，1993，42，509-517；Lucchessi B.R.，Rote W.E.，Driscoll E.M.，et al.，Prevention ofthrombosis and rethrombosis and enhancement of the thrombolyticactions of recombinant tissue-type plasminogen activator in the canineheart by DMP 728，a glycoprotein IIb/IIIaantagonist，Br.J.Pharmacol.，1994，113，1333-1343；Nichols A.J.，Vasko J.A.，Valocik R.E.，et al.，The in vitro pharmacological profile of SK&106760，a novel GP IIb/IIIaantagonist，Throb.Res.1994，75(2)，143-156；彭师奇，赵明，王超等，心血管活性多肽以及它们的合成和在医学中的应用，发明专利申请公开说明书，95106340.5，中华人民共和国专利局，1997年4月2日)。这些研究带有两个明显的特点，一是筛选的化合物都需要静脉给药，二是通过抑制活化的血小板聚集达到阻断血栓形成最后通路的目标。αIIbβ3受体由α和β两条跨膜亚链聚集构成，通过“活化”或信号“外化”介导它们对配体的亲和度(Williams M.J.，Maghes P.E.，O’toole T.E.，et al.，Trends Cell Biol.，1994，4，109-112；SchwartzM.A.，Schaller M.D.，Gimsberg M.H.，Annu.Rev.Cell Biol.，1995，11，549-599)。信号“外化”可以包括由αIIbβ3胞浆区到细胞外区的构象变化的增殖，导致高亲和性的配基结合(O’toole T.E.，Loftus J.C.，Du X.et al.，Cell Regul.，1990，1，883-893；Sims P.J.，Ginsberg M.H.，Plow E F.，et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，7345-7352)。α和β亚单元的胞浆区享有类似的近膜机构，该机构在膜-胞浆界面之后有非极性残基顺序地连接极性残基的序列，α亚基为GFFKR，β亚基为LLv-iHDR(高度保守的残基大写，低保守的残基小写，破折号为不保守的残基)。无论是去除α亚单元还是β亚单元的胞浆区的这些残基，都会“活化”整合素，把整合素锁定在高亲和状态(O’Toole T.E.，Mandelman D.，Forsyth J.，et al.，Science，1991，254，845-847；O’TooleT.E.，Katagiri Y.，Faull R.J.，et al.，J.Cell Biol.，1994，124，1047-1059；Hughes P.E.，O’Toole T.E.，Ylanne Y.，et al.，J.Biol.Chem.，1995，270，12411-12417；Crowe R.，Kern A.，Marcantonio E.E.，Mol.Biol.Cell，1995，6，997-1010)。研究整合素的组装表面，发现在α亚单元和β亚单元胞浆区的近膜部分存在一种相互作用(Briesewitz R.，KernA.，Marcantonio E.E.，Mol.Biol.Cell，1994，269，14411-14418)，这种相互作用是通过α的R995和β的D723之间形成盐桥来实现的(Hughes P.E.，Diaz-Gonzalez F.，Leong L.，et al.，J.Biol.Chem.，1996，271(12)，6571-6574)。这种盐桥破坏时，整合素进入活化状态。保持盐桥的稳定性，可以维持血小板的静息状态。
已见文献报道的抗血栓多肽药物设计的共同点是，血小板活化之后以拮抗作用的多肽竞争αIIbβ3受体，抑制作用发生在整合素进入活化状态之后。本发明的发明者发现，保持α亚单元的R995和β亚单元的D723之间形成盐桥的稳定状态，使整合素不发生活化，保持与配基的低亲和状态，是抗血栓多肽药物设计的新途径。从化学观点看，中和-D(723)·+R(995)盐桥的电性或置换盐桥的任一离子，均可造成-D(723)·+R(995)盐桥的解体。只要在受体附近提供一种缓冲环境，缓冲任何中和盐桥电性的倾向，或消除置换盐桥基团的企图，都可以保持盐桥的稳定性，抑制血栓形成。
本发明筛选了一系列与-D(723)·+R(995)性质类似的盐类作为盐桥稳定剂，发现氨基酸复盐具有盐桥稳定化作用，其中氨基酸加合盐显示优秀的抗血栓作用。本发明提供了具有以下结构的氨基酸加合盐，其溶剂化物或其生理上可接受的盐AA·BA其中AA代表L型或D型氨基酸如天冬氨酸，谷氨酸等，BA代表L型或D型氨基酸如精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸，色氨酸等，本发明典型的化合物如下
(分子量307)氨基酸加合盐目前是作为普通的化学试剂应用的(SIGMA公司的化学试剂手册)，未见用于药物的报道。
本发明提供的氨基酸加合盐，其pH为中性，不影响体内前列环素(PGI2)的水平，对胃粘膜无刺激性、既不会造成胃粘膜局部缺血和坏死，也不会引起血栓反弹，显示了良好的应用前景。
本发明提供的氨基酸加合盐及其药物组合物是用通用的方法制备的。
本发明提供的氨基酸加合盐药物组合物可以包括多种剂型，如片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，溶液剂，酏剂，栓剂，透皮剂，喷雾剂和注射剂以及各种缓释，控释，填埋剂型等，上述剂型的药物组合物可以包括任何药物可接受的载体，这些药物可接受的载体可以是常用的赋形剂、稀释剂，适合这些制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括以下物质填料和增量剂，例如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它的纤维素衍生物，藻酸盐，明胶和聚乙烯吡咯烷酮；增湿剂，例如甘油；崩解剂，例如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；延缓溶解的试剂，例如石蜡；加速再吸收剂，例如季铵化合物；表面活性剂，例如十六烷醇、甘油单硬脂酸酯；吸附载体，例如高岭土和膨润土；以及润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙和镁、固体聚乙二醇等。
以下实施例用于说明本发明，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制，实施例中的氨基酸加合盐均为天冬氨酸和精氨酸的加合盐。实施例1氨基酸加合盐的制备7.39g(55.56mmol)L-Asp，9.67g(55.56mm01)L-Arg及20ml蒸馏水于室温下搅拌2小时，得到的均相溶液过滤，滤液减压浓缩，得到16.38g(98％)白色结晶型产物。飞行时间质谱176[Arg+1]+。
HPLC检测，HP1090液相色谱仪，C18反向柱，水(100％-35％)/乙腈(0％-65％)梯度洗脱，流速为1ml/min，洗脱时间30分钟，最高柱压250Bar，单峰，样品纯度不低于99％，保留时间为6.868min。红外吸收光谱(IR)用Perking-Elmer983红外吸收光谱仪测定，扫描方式3，噪音滤器1，分辨率5.0，纵坐标％T，纵坐标低点15，扫描范围4000-600cm-1，吸收度0.50，样品制备方法KBr压片。主要吸收峰3000cm-1(宽带，ν+NH3)，1610cm-1(宽带，δ+NH3)，1520cm-1(宽带，δ+NH3)，1600cm-1(VC＝O，不对称)，1410cm-1(VC＝O，对称)。
实施例2血液流变学实验30只雄性Wistar大鼠(体重220-260g)，随机分为三组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC中，4ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于CMC中，4ml/只)，每天灌药1次，连续灌8天，第九天灌药后1小时用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)经腹主动脉取血，用R80 VISCOMETER型血流变仪(北京世帝科学仪器公司产，锥板式)检测各流变学参数，结果见表1。表1.血流变测值(n＝10)检验项目检验结果空白对照组阳性对照组 用药组全血高切值 8.74±1.475.82±0.545.44±1.13(CP)100全血中切值 10.45±2.056.74±0.526.51±1.58(CP)10全血中切值(CP)312.69±2.957.93±0.507.93±2.23全血低切值(CP)116.76±4.80 10.07±0.51 10.51±3.50ESR血沉(mm/h) 2.20±0.923.90±0.884.50±1.90红细胞压积(％) 47.40±2.22 43.70±1.70 43.30±2.26全血高切还原粘 16.44±3.11 11.07±1.24 10.17±2.32度全血低切还原粘34.59±10.2120.84±1.3121.70±7.17度红细胞聚集指数 1.93±0.261.74±0.11 1.88±0.31血沉方程K值 9.90±4.38 18.40±4.38 21.20±9.64表1的数据表明，与阿司匹林一样，氨基酸加合盐可以改善大鼠的血流变状况。实施例3抗血小板聚集实验30只雄性Wistar大鼠(体重220-260g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，每天灌药一次，连续灌8天，第九天灌药后1小时先用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，然后用硅化注射器(其中装有1/9血量的3.8％枸橼酸钠溶液)经腹主动脉取血，取得的血浆以1000转/分离心5分钟，取上层PRP。余下的血浆以4000转/分离心10分钟，取上层PPP调节PRP中的血小板数，使血小板数在60万-70万/μl。将调好的PRP装入比浊管中，加入终浓度为1mmol/l的ADP作诱导剂，用Born氏比浊法测定5分钟内的血小板最大聚集率。仪器为BS631型血小板聚集仪(北京生化仪器厂出品)。结果见表2。表2.氨基酸加合盐抗ADP诱导的血小板聚集作用组别 空白对照组 阳性对照组 用药组最大聚集率 32.88±6.62 16.88±5.67**10.75±3.62**#(％X±S)聚集抑制率 -48.40±14.06**65.00±12.59**#(％X±S)
n＝10；**与空白对照组比较，p＜0.01；#与阳性对照组比较，p＜0.05结果表明，阿司匹林和氨基酸加合盐相比，虽然都能有效地抑制ADP诱导的血小板聚集(p＜0.01)，但氨基酸加合盐比阿司匹林更优秀(p＜0.05)。实施例4抗血小板粘附实验1.30只雄性Wistar大鼠(体重220-260g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，4ml/只)，每天灌药一次，连续灌8天，第九天灌药后1小时用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，注射(3mg/kg)肝素抗凝，采用玻璃球柱法测定抗血小板粘附作用。结果见表3。
表3.氨基酸加合盐的抗血小板粘附作用组别 空白对照组 阳性对照组 用药组粘附数 121.48±23.5893.70±42.74 59.10±18.30#(103/mm3)粘附率(％) 30.50±6.47 22.80±10.20 14.50±4.72#n＝10；#与阳性对照组比较，p＜0.05结果表明，与阿司匹林不同，氨基酸加合盐有明显的抗血小板粘附作用。实施例5凝血象实验30只雄性Wistar大鼠(体重220-260g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，4ml/只)，每天灌药一次，连续灌8天，第九天灌药后1小时用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，腹主动脉取血(3ml，0.3ml 3.8％枸橼酸钠溶液抗凝)，用Thromboscreen 400C全自动分析仪(德国产)测定凝血象，结果见表4、表5和表6。
表4.凝血酶(原)时间(秒)组别 空白对照组阳性对照组用药组血浆复钙时间 128.40±25.31 130.80±27.85 143.70±65.46凝血酶时间 47.98±10.3548.37±8.5641.14±7.97凝血酶原时间21.92±3.3121.35±3.5017.48±3.12部分凝血活酶时 26.80±3.9729.68±4.2029.38±4.65间n＝10表5.FP含量组别 空白对照组 阳性对照组用药组含量(X±S) 251.68±125.60 191.01±63.85 279.60±126.32*n=10；*与阳性对照组比较，p＜0.05表6.优球蛋白溶解实验组别空白对照组阳性对照组用药组结果-----++ -------- +--+---+-- -- +-
n＝10结果表明，氨基酸加合盐与阿司匹林一样对凝血象无明显影响。实施例6出血时间和凝血时间实验(1)30只雄性Wistar大鼠(体重220-260g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于CMC，4ml/只)，每天灌药一次，连续灌8天，第九天灌药后1小时测定出血时间和全血凝固时间，结果见表7。
表7.出血时间和凝血时间(秒)组别 空白对照组 阳性对照组 用药组出血时间 43.00±11.30 61.00±15.17**80.90±11.89**##凝血时间100.10±19.56139.00±35.20**185.80±37.43##n＝10；**与空白对照组比较，p＜0.01；##与阳性对照组比较，p＜0.01结果表明，虽然氨基酸加合盐与阿司匹林一样，都可明显延长小鼠尾动脉出血时间及全血凝固时间，但氨基酸加合盐更优秀。
(2)30只昆明种雄性小白鼠(体重18-20g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(0.25ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，0.25ml/只)，用药组氨基酸加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，0.25ml/只)，一次给药，用药前禁食4小时，自由饮水，给药后1小时测定小鼠尾动脉出血时间，结果见表8。
表8.出血时间(秒)组别 空白对照组阳性对照组 用药组出血时间 211.40±51.44 322.30±146.12*540.80±289.74**#n＝10；*与空白对照组比较，p＜0.05；**与空白对照组比较，p＜0.01；#与阳性对照组比较p＜0.05结果表明，一次服用氨基酸加合盐对小鼠尾动脉出血时间的延长优于与阿司匹林。实施例7.血栓形成实验(1)30只雄性Wistar大鼠(体重380-410g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组DR加合盐灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，每天灌药一次，连续灌8天，第九天灌药后1小时用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，仰卧位固定，分离气管，气管中插入一塑料套管供必要时吸出气管分泌物用，分离右颈总动脉及左颈外静脉。在外径2mm的硅油化聚乙烯管中加入准确称重的6cm长4号手术缝合线，聚乙烯管中充满肝素生理盐水溶液(50u/ml)。将聚乙烯管的一端插入颈外静脉，往静脉内准确注入肝素(50u/kg)抗凝，再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹，使血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静脉。血流持续15分钟后中断血流，迅速取出带血栓的丝线称重，用减重法计算血栓湿重。带血栓丝线在干燥器中放置4天，再用减重法称重计算血栓干重。结果见表9。
表9.丝线血栓重量(mg)组别 空白对照组阳性对照组 用药组血栓湿重(X±S) 7.12±1.60 4.90±0.96**3.75±0.82**血栓干重(X±S) 1.60±0.35 0.99±0.20*0.83±0.18*n＝10；*与空白对照组比较，p＜0.05；**与空白对照组比较，p＜0.01(2)30只雄性Wistar大鼠(体重370-400g)，随机分为3组，空白对照组用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，阳性对照组用阿司匹林灌胃(36mg/kg，悬浮于0.2％CMC，4ml/只)，用药组DR加合盐灌胃(122mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，一次给药，灌药前禁食4小时，自由饮水。灌药后1小时用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，仰卧位固定，分离气管，气管中插入一塑料套管供必要时吸出气管分泌物用，分离右颈总动脉及左颈外静脉。在外径2mm的硅油化聚乙烯管中加入准确称重的6cm长4号手术缝合线，聚乙烯管中充满肝素生理盐水溶液(50u/ml)。将聚乙烯管的一端插入颈外静脉，往管内准确注入肝素(50u/kg)抗凝，再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹，使血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静脉。血流持续15分钟后中断血流，迅速取出带血栓的丝线称重，用减重法计算血栓湿重。带血栓丝线在干燥器中放置4天，再用减重法称重计算血栓干重。结果见表10。
表10.丝线血栓重量(mg)组别空白对照组阳性对照组用药组血栓湿重(X±S) 27.23±8.80 15.41±2.95**15.54±5.11**血栓干重(X±S) 5.69±1.233.00±0.60**3.29±1.46**n＝10；**与空白对照组比较，p＜0.01结果表明，DR加合盐和阿司匹林一样均可有效地抑制血栓形成。
权利要求
1.含有氨基酸加合盐，其溶剂化物或其生理上可接受的盐的药物组合物，所述氨基酸加合盐用如下通式表示AA·BA其中AA代表L型或D型氨基酸，BA代表L型或D型氨基酸。
2.权利要求1的药物组合物，其中AA代表L型或D型酸性氨基酸，如天冬氨酸，谷氨酸，BA代表的L型或D型碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸，色氨酸，
3.权力要求2的药物组合物，其中的氨基酸加合盐为下式化合物
(分子量307)
4.权利要求1的药物组合物，作为蛋白粘附受体抑制剂用于治疗或预防血栓性疾病。
5.权力要求1的药物组合物，作为蛋白粘附受体抑制剂，用于治疗或预防各类癌转移。
6.权力要求1的药物组合物，含有药物可接受的载体。
7.权力要求1的药物组合物，包括AA·BA与一种或几种抗血栓药物或溶栓药物组成的复方药物组合物。
8.权力要求1的药物组合物，包括AA·BA与一种或几种抗癌药组成的复方药物组合物。
9.可以通过口服，注射，透皮，舌下，直肠或呼吸道给药的权利要求1的药物组合物，
10.权利要求1的药物组合物，包括片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，溶液剂，酏剂，栓剂，透皮剂，喷雾剂和注射剂。
全文摘要
本发明提供了含有氨基酸加合盐,其溶剂化物或其生理上可接受的盐的药物组合物:AA·BA,其中:AA代表L型或D型氨基酸,BA代表L型或D型氨基酸,该组合物可用于治疗或预防血栓性疾病。
文档编号A61K31/185GK1242192SQ98103040
公开日2000年1月26日 申请日期1998年7月21日 优先权日1998年7月21日
发明者彭师奇, 王超, 赵明, 李春波, 毛伟, 吕志强 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂