专利名称：斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及斑点叉尾鮰疾病预防用疫苗，具体涉及肠套叠灭活疫苗的制备方法与免疫方法。
背景技术：
斑点叉尾鮰{Ictaclurus punctatus)隶属It形目，鮰科鱼类,又称沟餘、河餘。其原产地为美国密西西比河，是一种大型淡水性鱼类，最大个体可达35kg以上。该鱼具有食性杂、抗病力强、适应性广、生长快、肉质细嫩、营养丰富、经济价值高等特点。斑点叉尾鮰含肉率为56. 14%，其中粗脂肪占2. 99%，粗蛋白占16. 31%，其肌肉干物质中氨基酸含量为 79. 17%，其中鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨基酸、甘氨酸、丙氨酸)占总氨基酸的6. 36%，具有滋补和催乳功能，深受消费者欢迎。斑点叉尾鮰于八十年代引入我国，在湖北、湖南、四川、重庆、贵州等30多个省市形成了较大规模的养殖。近年来，随着网箱养殖的规模扩大和养殖密度加大，一些地区养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，暴发性死亡时有发生，给养殖户造成了重大的经济损失。斑点叉尾鮰肠套叠是近年来发现的发病频率较高的急性传染性疾病。这种传染性疾病具有发病突然，来势凶猛，传染快，呈流行性等特点。目前这种疾病在我国相当严重。多年来，这种疾病的防治主要依赖抗菌药物，但随着社会的发展，这将受到越来越严厉的限制，因此疫苗的开发与使用已成为必然趋势。实际上，在过去的10-20年间，接种疫苗预防养殖鱼类传染性疾病已经取得巨大成功。如A. salmonicida、Virbrio sp. , Yersinia sp.等多种疫苗已商业化。而且不久的将来，巴斯德菌病(Pasteurellosis)和链球菌病(Streptococcosis)也有望通过免疫预防得到控制。Ahydrophila感染的免疫预防虽也取得不同程度的成功，在基因工程改良的弱毒疫苗、亚单位疫苗等方面有所突破，但试验中的疫苗，以单价苗居多，多联疫苗少见。鉴于斑点叉尾鮰肠套叠可能因多种细菌感染所致，所以研制斑点叉尾鮰肠套叠二联或多联灭活疫苗非常必要。

发明内容
本发明的目的在于提供预防斑点叉尾鮰肠套叠的暴发和传播的疫苗，提供一种斑点叉尾鮰肠套叠的二联灭活疫苗的制备方法。利用从病鱼体内分离的毒力强的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌制成的灭活疫苗，对斑点叉尾肠套叠起到有效的保护作用，能有效缓解斑点叉尾鮰的抗药性和提高斑点叉尾鮰的产量。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落园形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，如溶血素、组织毒素、坏死毒素、肠毒素和蛋白酶等。在具有典型出血性肠套叠症状的斑点叉尾鮰肠道中可以分离得到致病性强的嗜麦芽寡养单胞菌和嗜水气单胞菌，用于制备灭活疫苗。该菌的分离、鉴定等方法前人已有研究。斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的免疫方法，主要是采用下述方法
A、疫苗的抗原为嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌，将灭活完全的菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗；
B、用二联疫苗对斑点叉尾鮰鱼体浸泡接种或注射接种免疫。其菌种包括从发病斑点叉尾鮰体内分离出来的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌。 斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法，按以下步骤进行
(1)将嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到无菌TSA上，30±0.5°C培养24小
时；
(2)分别将步骤(I)培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0. 5°C，摇床速度280 300r/min，培养时间为24小时；
(3)将步骤(2)中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用无菌的O. 85%的生理盐水稀释菌体到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步骤(3)中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为O. 3% (V/V)，32±0. 5°C下灭活 72 小时；
(5)根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4°C冰箱内储藏。斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法，也可按以下步骤进行
(1)在具有典型出血性肠套叠斑点叉尾鮰病鱼体内分离出嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌，将两菌分别接种到TSA中，30 ± O. 5°C培养24小时；
(2)分别将步骤(I)培养好的菌体接种到已经高压灭菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0. 5°C，摇床速度280 300r/min，培养时间为24小时；
(3)将步骤(2)中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液。用高压灭菌的O. 85%的生理盐水稀释菌体到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步骤(3)中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为O. 3% (V/V)，在 32±0· 5°C下灭活 72 小时；
(5)根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活疫苗以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4°C冰箱内储藏。斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的免疫方法，可采用浸泡接种或注射接种
A、浸泡接种，取二联疫苗于容器中，加入蜂胶佐剂，再加入无菌水，使疫苗稀释200倍，佐剂的最终浓度为O. lmg/ml，搅匀后将鱼投入容器内浸泡接种疫苗15 30分钟；
B、注射接种，将二联疫苗用O.85%的无菌生理盐水稀释5倍，加入蜂胶佐剂，使其最终浓度为O. 01mg/ml，溶解摇匀后，用注射器向鱼体腹腔注射，用量为8 10厘米的鱼种O. I O. 3ml/ 尾。为了得到良好的预防效果，该疫苗具有嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌的灭活菌体，其灭活菌体的浓度为IO7 10lclCFU/ml或IO9 10lclCFU/ml。固体培养基配比蛋白胨IOg,牛肉膏3g, NaCl 5g,蒸懼水1000ml,琼脂条20g,pH 7· 2 7· 4 ;121°C 灭菌 30min。
肉汤培养基配比蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7. 2
7.4 ;121°C 灭菌 30min。胰酪胨大豆琼脂(TSA)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氢钾2. 5g，葡萄糖2. 5g,氯化钠5g,琼脂20g,加蒸懼水至1000ml,调pH值至7. 3,121°C灭菌30min。胰酪胨大豆肉汤(TSB)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2. 5g,氯化钠5g,加蒸懼水至1000ml,调pH值至7. 3,121°C灭菌30min。蜂胶佐剂称取14g蜂胶，剪碎并砚成粉末，放入棕色广口瓶中，溶于4倍量95%乙醇中；置25°C水浴24h，其间不断搅拌；取出后5000r/ min离心lOmin，吸上清液即为蜂胶乙醇浸液；过滤去杂质，用PBS缓冲液(pH7. 2,0. lmol/ L)将所配制的蜂胶稀释为30mg/ml，4°C避光保存待用。
具体实施例方式实施例I :菌种的分离
(O从具有典型出血性肠套叠症状的斑点叉尾鮰中分离出致病菌嗜水气单胞菌a、采取发病或濒死斑点叉尾鮰的肝、脾、肾，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28°C培养24h，挑取单个菌落获纯培养物后，转接于普通营养琼脂斜面培养基上保存，供鉴定用。普通营养琼脂平板上典型菌落为圆形，无色或浅黄色，半透明，表面光滑，湿润，边缘整齐，无水溶性色素。b、取上述斜面上纯培养菌，制成涂片标本，经革兰氏染色镜检细菌形态。普通光学显微镜镜检结果为革兰氏阴性短小杆菌，菌体两端钝圆或平直，多数单个排列，少数2个排列，无荚膜，无芽孢。再分别接种于血琼脂平板上，28°C培养24h，可见血营养琼脂平板上细菌生长旺盛，典型菌落中I. 5 2. 0mm，菌落圆形、湿润、光滑、无色、透明，呈露水珠样，边缘整齐，菌落周围有透明溶血环，呈明显的β溶血。C、选取分离菌株接种于普通营养琼脂平板上，28°C培养18 24h，用法国梅里埃产API细菌鉴定条进行生化鉴定(见表I)。表I分离嗜水气单胞菌菌株生化试验鉴定结果
项目I结果I项目I结果I项目I结果
甲基红 +_VP反应_+_柠檬酸盐_+_
硫化氢试验 +_水解脲素-_精氨酸双水解酶 +_
明胶水解 +_海藻糖_+_赖氨酸脱羧酶 +_
乳糖_+_麦芽糖_+_P-甘露醇_+_
P-山梨醇 -_水杨苷_+_酒石酸_-_
氧化酶 ^ 梓檬酸-甘油+
运动性—+ ~爾廢盐还原 ^~ D-木糖^~
π引哚试验 I+ Id-葡萄糖产气 I+ Id-葡萄糖产酸 I+ —
注“+”表示为阳性表示为阴性。d、先进行16SrRNA基因序列测定,然后通过经比对，同源性为99%。e、根据细菌形态、培养及理化特性测定的结果，并结合16SrRNA基因序列测定的结果，判定供试菌种为嗜水气单胞菌。(2)从具有典型出血性肠套叠症状的斑点叉尾鮰中分离出致病菌嗜麦芽寡养单胞菌
a、无菌采取发病或濒死斑点叉尾鮰的肠、肝、脾、肾，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28°C培养24h，挑取单个菌落获纯培养物后，转接于普通营养琼脂斜面培养基上保存，供鉴定用。普通营养琼脂平板上典型脂菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边缘整齐的半透明菌落。b、取上述斜面上纯培养菌，制成涂片标本，经革兰氏染色镜检细菌形态。普通光学显微镜镜检结果为革兰氏阴性，菌体直或稍弯，单个或成对存在，为无荚膜，无芽孢，极生多鞭毛的G_杆菌。再分别接种于血琼脂平板上，28°C培养24h，出现明显的溶血环，且溶血环 呈草绿色。C、选取分离菌株接种于普通营养琼脂平板上，28°C培养18 24h，用法国梅里埃产API细菌鉴定条进行生化鉴定(见表2)。表2分离嗜麦芽寡养单胞菌菌株生化试验鉴定结果
权利要求
1.斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于 A、疫苗的抗原为嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌，将灭活完全的菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗； B、用二联疫苗对斑点叉尾鮰鱼体浸泡接种或注射接种免疫。
2.根据权利要求I所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述菌种包括从发病斑点叉尾鮰体内分离出来的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌。
3.根据权利要求I所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于其制备方法按以下步骤进行 (1)将嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到TSA，30±0.5°C培养24小时； (2)分别将步骤(I)培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0. 5°C，摇床速度28(T300r/min，培养时间为24小时； (3)将步骤(2)中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用无菌的O. 85%的生理盐水稀释菌体到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步骤(3)中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下灭活 72 小时； (5)根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4°C冰箱内储藏。
4.根据权利要求I所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于按以下步骤进行 (1)在具有典型出血性肠套叠斑点叉尾鮰病鱼体内分离出嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌，将两菌分别接种到无菌TSA上，30±0. 5°C培养24小时； (2)分别将步骤(I)培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0. 5°C，摇床速度280 300r/min，培养时间为24小时； (3)将步骤(2)中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用经无菌的O. 85%的生理盐水稀释菌体到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步骤(3)中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下灭活 72 小时； (5)根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4°C冰箱内储藏。
5.根据权利要求I所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，其特征在于所述的浸泡接种或注射接种为 A、浸泡接种，取二联疫苗于容器中，加入蜂胶佐剂，再加入无菌水，使疫苗稀释200倍，佐剂的最终浓度为O. lmg/ml，搅匀后将鱼投入容器内浸泡接种疫苗15 30分钟； B、注射接种，将二联疫苗用O.85%的无菌生理盐水稀释5倍，加入蜂胶佐剂，使其最终浓度为O. 01mg/ml，溶解摇匀后，用注射器向鱼体腹腔注射，用量为8 10厘米的鱼种O. I O. 3ml/ 尾。
6.斑点叉尾鮰肠套叠的免疫方法，其特征在于将灭活完全的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的应用。
全文摘要
本发明从具有典型出血性肠套叠症状的斑点叉尾鮰上分离纯化得到致病菌嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌。两株病原菌通过菌体活化，液体扩大培养，然后进行灭活处理，等比例混合得到二联灭活疫苗。该发明制备的二联灭活疫苗制备工艺简单，成本低，能工厂化生产，且其免疫保护率能达到70%。该疫苗可通过浸泡或者腹腔注射接种斑点叉尾鮰，能有效预防斑点叉尾鮰肠套叠的暴发，且不污染水域环境，可在斑点叉尾鮰养殖中使用。
文档编号A61K39/116GK102641498SQ201210143659
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者何艳林, 刘小燕, 戴振炎, 李权生, 王荣华 申请人:安化县移民开发局, 湖南农业大学