专利名称：用于siRNA传递的纳米泡载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及用于SiRNA传递的纳米泡载体。
背景技术：
siRNA中文名称是小干扰脱氧核糖核酸，是基于基因沉默(RNAi)技术而设计的一种核酸活性成分。siRNA是人工合成的双链RNA，是一种小RNA分子Ql-25核苷酸)，由 Dicer (RNAaseIII家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。siRNA无论得到的方法如何，如化学合成、体外转录、用RNAaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA、siRNA表达载体、病毒载体、siRNA表达框架，因为它们的分子结构相同，理化性质也一样，只是产品形式可能有所不同，即保存在什么溶液中。siRNA自发现以来已获得大量关注，但一直没有作为新药上市，最重要的问题是 siRNA作为核酸分子，很容易被体内核酸酶降解，并且siRNA从注射部位到达作用部位要经历很多过程途径，进入细胞后，还有从内涵体或溶酶体中逃逸，进入胞浆，才能发挥作用。 siRNA的特殊性使其制剂研究非常困难。

发明内容
本发明人出乎意料地发现我们设计的一种纳米泡载体，可以在体外和体内传递 siRNA，并且在携带siRNA的纳米泡经过部位或作用部位施加超声手段，可以促进siRNA的释放，并起到相应的药理作用。本发明公开的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质构成外壳，内部充填气体或在正常体温下转化为气体的液体。本发明中的siRNA根据所表达的功能特点而设计核苷酸序列，并通过生物技术公司合成得到。siRNA的功能包括各种疾病的治疗用途，例如各种病毒性肝炎、肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病。本发明中的聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物选自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物，优选的是聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物中聚乳酸羟基乙酸嵌段的分子量范围是1000 20000， 优选的是2000 10000，更优选的是3000 10000 ；聚乙二醇嵌段的分子量范围是500 10000，优选的是1000 5000，更优选的是1500 3000。聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物和聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物可以从市场上购买得到；或根据文献合成方法，也可以自行合成得到。本发明中的阳离子脂质选自1，2- 二油酰-3-三甲基胺基丙烷、双十八烷基二甲基溴化铵、双十烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵、尿嘧啶脂质衍生物、1，4_ 二氢吡啶脂质衍生物、二甲基羟乙基胺丙胺碳酰胆固醇酯、3 β _(N-(N’，N’ - 二甲基氨基乙烷) 碳酰)胆固醇、0，0’_双十四酰-N-三甲基氨基乙酰二乙醇胺盐酸盐、十六烷基三甲基溴化
\铵(CTAB)、苯扎氯胺、鱼精蛋白、硬脂胺、二油酰磷脂酰乙醇胺。这些阳离子脂质都可以从市场上得到。本发明中的气体选自空气、、氮气、氧气、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化
硫ο本发明中的在正常体温下转化为气体的液体是全氟戊烷。全氟戊烷的沸点是 29. 5 C- ο本发明公开的用于SiRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡粒径范围是20 700纳米，优选的是50 500纳米，更优选的是50 300纳米，进一步优选的是50 200 纳米。由于SiRNA的水溶性，SiRNA无法包裹在纳米泡内部，而只能通过静电作用，与纳米泡外壳中的阳离子脂质发生相互作用而进行包裹。本发明基于siRNA和纳米泡的特点还专门设计了用于siRNA传递的纳米泡载体的制备方法如下(1)将聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质溶解在有机溶剂中；(2)将含siRNA的水溶液在搅拌下加入上述溶液中；(3)挥发或透析除去有机溶剂得到含siRNA的胶束溶液；(4)在胶束溶液中加入气体或在正常体温下转化为气体的液体，并持续超声，形成纳米泡。上述制备方法中，有机溶剂优选的是和水互溶的有机溶剂，选自乙醇、甲醇、丙酮、 异丙醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜。加入的siRNA水溶液占分散介质的有机溶液体积的5 80%，优选的是10 50%。


图 1. ELISA 检测 HBsAg OD 值
具体实施例方式实施例1.载siRNA的纳米泡将80mg 聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇(PLGA8000-PEG15000)、IOmgl，2- 二油 酰-3-三甲基胺基丙烷共同溶解于40mL 二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌条件下加入5mg siRNA,转移至截留分子量为7000的透析袋，于4L水中透析48小时，每隔12小时更换新鲜水，透析完成后，取出透析袋内的溶液，在水浴超声条件下，加入气体或在正常体温下转化为气体的液体，并持续超声0. 5小时，形成纳米泡。siRNA可选自各种治疗疾病用siRNA，如针对乙型肝炎病毒(HBV)的序列序列1 :ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdGdGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC序列2 :GCU⑶GCCUUGGGUGGCUUdTdTdTdTCGACACGGAACCCACCGAA序列3 :UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdTdTdTAUGGC⑶CUCAGAUCUGAG还有抗肿瘤siRNA，如针对血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA。
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实验例1.载siRNA的纳米泡的体外转染实验1材料和方法1.1材料和仪器H印G2. 2. 15细胞株(HBV DNAayw亚型转染肝母细胞瘤IfepG2细胞的细胞系，可分泌HBV各种病毒标志物及完整的Dane颗粒)，DMEM混合培养液(含10 %胎牛血清，380 μ g/ mlG418，3%谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)，乙肝病毒表面抗原、核心抗原检测试剂盒。酶标仪，实时荧光定量PCR仪，高速台式离心机，超低温冰箱。载siRNA的纳米泡由实施例1方法制备，siRNA序列为序列1 :ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdGdGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC。采用的是全氟戊烷充填。1. 3HBV 的 siRNA 干扰试验H印G2. 2. 15细胞接种到96孔板，转染前一天换无抗生素培养基培养M小时。设置三组，包括载siRNA的纳米泡、Lipofectamine 2000(阳性对照)、空白未给药组，分别设 3复孔，继续培养至72小时。1. 4ELISA检测表抗与核抗及RT-PCR检测HBV DNA的表达HBV表面抗原和核心抗原的检测，参照试剂盒标准操作程序执行；并用RNA抽提试剂盒分别提取各组转染后的总RNA，进行RT-PCR的检测。2结果与讨论2. 1乙肝表面抗原检测H印G2. 2. 15细胞与载siRNA的纳米泡或其他对照一起孵育72小时，并在加入5分钟后，37°C水浴超声10分钟，双波长450/690nm读取OD值。根据诊断试剂盒的判断标准， 阴性对照OD值< 0. 1且阳性对照OD值> 0. 8时实验正常，否则实验无效，由此判断本实验有效。本发明中载siRNA的纳米泡能明显干扰HBsAg的复制，明显优于阳性对照(图1)。2. 2RT-PCR定量检测HBV DNA的表达参照2. 1的结果对抗HBsAg有效的实验组进行了 RT-PCR检测(表1)。载siRNA 的纳米泡组可见明显的DNA复制被抑制，证明其具有干扰HBV效应，明显优于阳性对照。表1. H印G2. 2. 15细胞中HBV DNA拷贝数
_干扰前_干扰后
阴性对照组2.47X 1051.38X 105
载 siRNA 的 Lipofectamin 1.91 X IO59.21 X IO3
载 siRNA 纳米泡2.06X 1053.82X 103实验例2.载siRNA的纳米泡的体内治疗实验1材料与方法1. 1材料与仪器采用实验例1中的载siRNA纳米泡，HBV转染小鼠模型(C57)，实时荧光定量PCR 仪。高速台式离心机，超低温冰箱。1. 2HBV转染小鼠模型的建立
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取4-8周18_19g的C57小鼠5只，采用水动力转染法静脉快速G 8s)注射含 10 μ gHBV基因组质粒的生理盐水(体积为小鼠体重的10% )，饲养两天待用。1. 3给药方案及血样的制备将小鼠分为三组，每组三只阴性对照，给药组，给药超声组。阴性组不做任何处理，给药组小鼠将载siRNA纳米泡经尾静脉注射给药0. lmL。给药超声组在静脉注射载 siRNA纳米泡完毕30min后，将给药组小鼠肝部位浸入100W超声波清洗器37°C水浴中连续超声30秒，分别于第五天及第十天眼眶取血0. 15mL，静置3小时后于离心机上经5000rpm 离心20分钟，用移液器取血清置于0. 5mL离心管放置超低温冰箱-70°C，待测。1.4血清样品的测定将血清样品用实时荧光定量PCR仪测定含量。2结果与讨论2. IHBV转染小鼠血清中HBV DNA含量变化HBV小鼠血清样品经PCR扩增仪进行扩增，扩增后HBV DNA含量反映药物抑制 HBVDNA复制效果。数值越小表明LAPE自组装体抑制HBV DNA复制效果越好。 表2. HBV转染小鼠血液HBV DNA含量
权利要求
1.一种用于SiRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质构成外壳，内部充填气体或在正常体温下转化为气体的液体。
2.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物选自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。
3.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是气体选自空气、氮气、 氧气、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫。
4.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是在正常体温下转化为气体的液体是全氟戊烷。
全文摘要
本发明公开了一种纳米泡载体，可以在体外和体内传递siRNA，并且在携带siRNA的纳米泡经过部位或作用部位施加超声手段，可以促进siRNA的释放，并起到相应的药理作用。
文档编号A61P1/16GK102441177SQ201110396478
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者杜丽娜, 王双苗, 金义光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所