专利名称：芒果苷元对ptp1b的抑制活性及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)的抑制活性、改善胰岛素抵抗作用，及在制备治疗II型糖尿病、肥胖等代谢综合 征、肿瘤和其他PTPlB相关疾病的药物中的应用。
背景技术：
蛋白酪氨酸的磷酸化水平是细胞内信号转导的重要调节因素，它由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase, PTK)和蛋白酪氨酸憐酸酶(Protein tyrosinephosphatase, PTP)共同调控,PTPlB (Protein tyrosine phosphatase IB, PTP1B)属于 PTP家族，是胰岛素信号通路中重要的负调控因子并参与瘦素、多种生长因子、催乳素、整合素、血小板凝集素等的信号转导过程，与糖尿病、肥胖的胰岛素抵抗和瘦素抵抗均有密切关系，与胰岛素抵抗、肥胖、血脂代谢紊乱和高血压等4个代谢综合征主要危险因素显著相关，在代谢综合征的发生、发展中起重要作用。PTPlB基因敲除小鼠胰岛素敏感性显著提高，而且能维持很好的糖稳态。另外，PTPlB还能够抑制肿瘤细胞的转移，与肿瘤细胞凋亡、血管生成有关，在乳腺和上皮细胞中催乳激素-泌乳刺激素的信号转导中起负调控作用。PTPlB已成为治疗II型糖尿病、肥胖症、乳腺癌等多种疾病新型、重要的药物靶点，在防治代谢综合征、肿瘤等疾病中起重要作用，对其抑制剂的研究也已经成为目前的研究热点。芒果苷兀(norathyriol,NL),全称 1,3,6,7-四轻基口山酮(1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone)，其化学结构式如下
0OH
Η 丫、.Z 夏丫,S
HO"" ''C、、,入、、#. " '、Η现代药理研究表明，芒果苷元具有多种生理作用，如抗抑郁、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、抗氧化及抑制结核杆菌生长等作用，其中抗炎作用的研究较为深入。但目前尚未见其抑制PTPIB、提高胰岛素敏感性方面的研究报道。

发明内容
本发明的目的是致力于研究芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，为人们提供一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制剂，并通过研究芒果苷元对蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，进一步扩展芒果苷元的药物用途。为实现上述目的，申请人从以下几个方面进行了研究I、建立蛋白酪氨酸磷酸酶抑制活性检测的反应体系，根据PTPlB水解pNPP的磷酸基团而产生颜色反应来检测化学小分子对PTPlB的抑制活性，并用来测定芒果苷元抑制活性包括IC5tl值和抑制剂类型。通过上述体外试验，申请人发现芒果苷元可显著抑制PTPlB活性，是一种新型PTPlB抑制剂，其抑制类型为竞争性抑制；2、通过小鼠的体内试验，申请人发现芒果苷元可显著改善C57BL/6正常小鼠和以胰岛素抵抗为特征的ob/ob糖尿病肥胖模型小鼠的胰岛素敏感性，降低实验动物血糖。基于上述研究和试验，申请人首次证实了芒果苷元是活性较好的新型PTPlB竞争性抑制剂，在体内可增加胰岛素敏感性，改善实验动物的高血糖症状，可以用于制备提高胰 岛素敏感性、降血糖的药物，能成为潜在的治疗II型糖尿病、肥胖等代谢综合征、乳腺癌药的物，并可作为潜在的先导化合物进行抗糖尿病、肥胖等代谢综合征、肿瘤和其他与PTPlB相关疾病的药物进行开发，并可以借助芯片技术等进一步研究代谢相关的信号通路。


图I :偏矾酸钠对PTPlB抑制率曲线图。测定不同浓度的阳性对照物偏矾酸钠(NaVO3)对重组人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率，相对浓度作图，得到NaVO3的IC5tl为O. 32 μ Μ。图2 :芒果苷元对PTPlB抑制率曲线图。测定不同浓度芒果苷元对重组人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率曲线，相对浓度作图，其IC5tl为9.2 μ M。图3 :芒果苷元对PTPlB抑制的双倒数图。在酶存在的条件下，固定抑制剂的浓度，改变底物的浓度，用Lineweaver-Burk法，以Ι/s为横坐标、1/V为纵坐标作图得到五条回归直线，这五条直线交于Y轴，从而判断芒果苷元对PTPlB的抑制类型为竞争性抑制。图4 :芒果苷元对正常小鼠ip.胰岛素的血糖变化图。数据用ANOVA法进行统计学处理(η = 11)，其中各组血糖水平与对照组相比，NL(5、40mg/kg)在30、60、90、120 min四个时间点有显著性差异*p < O. 05。图5 :芒果苷元对ob/ob小鼠ip.胰岛素的血糖变化图。数据用ANOVA法进行统计学处理(η = 5)，其中各组血糖水平与对照组相比，NL(40mg/kg)在60、90、120 min三个时间点有显著性差异*p < O. 05。
具体实施例方式通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。材料与来源试剂芒果苷元；重组人源PTPlB(Merck);对硝基苯磷酸二钠pNPP(Sigma);偏帆酸钠(Sigma) ；M0PS(Sigma) ；DTT(Sigma);胰岛素(江苏万邦生化医药股份有限公司);C57BL/6小鼠(军事医学科学院实验动物中心)，ob/ob小鼠(Jackson Lab)。器材XFL0UR4酶标仪；恒温培养箱；强生稳豪血糖仪实施例I芒果苷元对PTPlB的抑制活性测定(IC5tl值的测定)芒果苷元用少量DMSO溶解后用MOPS缓冲液稀释，取10 μ I加入至100 μ I反应体系中(pH7. 0,25mM mops, ImM EDTA, 2mM DTT，0. IM NaCl)，使其终浓度分别为 1500、150、15,1. 5,0. 15“] ，加入底物？咿？至16mM，加入重组人PTPlB 5ng后置于37°C反应30min。加10 μ I IM NaOH终止反应，置酶标仪上测定405nm波长条件下的吸收值A，以偏矾酸钠(NaVO3)作为阳性对照，以不加PTPlB为空白对照，计算抑制率。用抑制率对浓度做图，得到芒果苷元IC50为9. 2 μ M，偏矾酸钠IC50为O. 32 μ Μ。实施例2芒果苷元对PTPlB的抑制动力学测定
分别配制不同浓度的pNPP(32、16、8、4、2mM)和不同浓度的NL溶液(I. 25,2. 5、5、10、20 μ M)。每个NL浓度对应5组pNPP浓度做抑制活性测定，根据0D405的变化求出V，对应的底物浓度为S，根据L-B方程分别作图。结果表明，各条直线交于Y轴，故可判断NL为PTPlB的竞争型抑制剂。实施例3芒果苷元在改善正常小鼠胰岛素敏感性方面的作用C57BL/6小鼠随机分为5组，每组11只，分别为对照组、NL不同剂量给药组(100、60、40、15 mg/kg)。给药组分别灌胃给予不同浓度的NL (用O. 5 % CMC-Na水溶液混悬)，对照组灌胃给予O. 5% CMC-Na水溶液。连续给药7天，末次给药后禁食12h，按lU/kg腹腔注射胰岛素，分别于0、15、30、60、90、120min取血测量血糖值。胰岛素耐量实验(InsulinTolerance Test, ITT)实验显示，NL(5、40mg/kg)可显著改善C57BL/6小鼠胰岛素敏感性，降低其血糖，在后四个时间点有显著性差异(P
<0. 05)。实施例4芒果苷元在改善ob/ob小鼠胰岛素敏感性方面的作用ob/ob小鼠随机分为2组，每组5只，分别为对照组和给药组，给药组灌胃给予40mg/kg NL溶液(用0. 5% CMC-Na水溶液混悬)，对照组灌胃给予0. 5% CMC-Na水溶液。连续灌胃7天，末次给药后禁食12h，按lU/kg腹腔注射胰岛素，分别在0、15、30、60、90、120min取血测量血糖值。ITT实验显示,40 mg/kg剂量NL可显著改善ob/ob小鼠胰岛素敏感性，降低其高血糖症状，在后三个时间点有显著性差异(P < 0. 05)。
权利要求
1.一种芒果苷元的用途，其特征在于，用于制备提高胰岛素敏感性的药物的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述芒果苷元还用于制备蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂为竞争型抑制剂。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述芒果苷元还用于治疗肥胖症，或用作治疗肥胖症的药物。
5.一种芒果苷元的用途，其特征在于，用于制备通过抑制PTPlB从而治疗肥胖症的药物。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种四羟基酮芒果苷元(norathyriol)，对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制活性测定、改善胰岛素抵抗作用及在治疗PTP1B相关疾病药物中的应用。通过体外酶抑实验证明，本发明证实芒果苷元是重组人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B的竞争型抑制剂，IC50值为9.2μM；芒果苷元可使C57BL/6正常小鼠、ob/ob糖尿病模型小鼠对胰岛素的敏感性明显改善，降低实验动物血糖。说明芒果苷元是PTP1B的新型抑制剂，可作为潜在的先导化合物，在制备治疗胰岛素抵抗相关抗糖尿病和肥胖症等代谢综合征、肿瘤和其他与PTP1B相关疾病的药物中应用。
文档编号A61K31/352GK102657640SQ20121010408
公开日2012年9月12日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者何凤霞, 吴冬冬, 周平, 张昊, 张艳, 张辰宇, 徐琛, 李佳, 李金波, 邓小达 申请人:南京大学