专利名称：一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，更具体地说是癌症治疗药物。
背景技术：
目前认为肿瘤干细胞是肿瘤转移复发和放化疗耐药的根源，也是肿瘤治疗失败和死亡的最主要原因。ABCG2等跨膜转运体能将化疗药有效泵出细胞以避免细胞遭受损害，是导致肿瘤干细胞耐药的关键。寻找并建立能有效杀伤肿瘤干细胞和克服放化疗耐药对于控制肿瘤和改善癌症患者预后有重要意义，对此，迄今为止没有相关文献的公开报导
发明内容
本发明的目的是提供一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物，用于多种放化疗耐药或不耐药实体瘤的有效治疗。本发明为解决技术问题采用如下技术方案本发明能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物的特点是所述药物组成为每100毫升药液含无水乙醇2-10毫升、顺钼40-50毫克和灭菌水90-98毫升。本发明能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物的特点也在于可以用于替代顺钼的是多西紫杉醇、卡莫司汀、奥沙利钼、卡钼和吉西他滨中的一种或多种任意组合。本发明药物在制备治疗肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、腹膜后肿瘤或腹膜后淋巴结转移、贲门癌、胃肠道恶性肿瘤、软组织肉瘤和头颈部肿瘤的各种实体肿瘤及伴有胸、腹、心包腔恶性积液的耐药或不耐药的肿瘤的药物中的应用。本发明药物在制备治疗耐药细菌或真菌或病毒从而使其对抗感染药物重新敏感的药物中的应用。治疗机理肿瘤干细胞是肿瘤转移复发和放化疗耐药的根源，也是肿瘤治疗失败和死亡的最主要原因。ABCG2等跨膜转运体能将化疗药有效泵出细胞以避免细胞遭受损害，是导致肿瘤干细胞耐药的关键。2-10%乙醇能部分或全部灭活肿瘤细胞和肿瘤干细胞膜上的ABCG2跨膜转运体从而阻滞肿瘤细胞内化疗药物被其泵出而使化疗药物积聚在细胞内，从而与化疗药协同发挥杀伤化疗耐药肿瘤细胞或肿瘤干细胞的作用。本发明药物在体外能高效杀伤肿瘤干细胞并能使3只荷瘤裸鼠肿瘤消退及余下荷瘤裸鼠肿瘤生长停滞。生存分析表明，本发明药物能显著延长荷瘤裸鼠生存时间。与已有技术相比，本发明的有益效果体现在I、本发明可以克服各种肿瘤的化疗药耐药和放疗耐受，高效杀伤耐药肿瘤，适用于各种放化疗无效的实体瘤和恶性胸、腹、心包腔积液治疗。2、本发明制备方法操作简便、成本低，非常适合工业化生产。
3、本发明各组分均为国家食品药品管理局允许的肿瘤治疗成分，且各组分间不发生相互作用，可以即刻进入临床应用。


图I为应用流式细胞仪SP分选法分选获得A549/DDP细胞系的SP细胞并证明其富含并可代表肺癌肿瘤干细胞。图2-1和图2-2为流式细胞仪分析肺癌肿瘤干细胞凋亡情况。图3为本发明治疗荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化。图4为四组动物治疗后的生存情况，利用发明治疗荷瘤裸鼠后动物生存时间显著延长。
具体实施方式
以下动物试验对本发明有益效果作进一步说明从A549/DDP分离侧群细胞作为肺癌肿瘤干细胞来验证本发明在体外的杀伤效能。体内试验采用耐顺钼肺腺癌细胞系A549/DDP皮下接种裸鼠建立荷耐化疗药肿瘤动物模型，以研究本发明杀伤耐药肿瘤的体内药效。其方法、结果和结论如下I.材料与方法I. I细胞系和细胞培养人肺腺癌细胞(A549/⑶DP)购自中科院生化细胞所细胞库。人肺腺癌A549/⑶DP细胞培养于含2 μ mo I顺钼(齐鲁医药公司)和10%灭活胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM (Gibco公司)培养液，置于37°C含5% CO 2的培养箱中培养。细胞用O. 25%胰蛋白酶消化传代。1.2 SP细胞分选取对数生长期的细胞制备成单细胞悬液。自培养皿中以O. 25 %胰酶-EDTA消化、收集细胞，1000 r/ min低速离心10 min，用含2%FBS的磷酸缓冲盐溶液(PBS )重悬。调整细胞密度为IO6个/ml,设实验组和对照组。实验组加入Hoechst 33342 (Sigma, StLouis, MO, USA)至终浓度为5 μ g/ml,对照组加入维拉帕米(Sigma, St Louis, MO, USA)至终浓度为50ymol/ml，37°C 5 % C02、95 %湿度孵箱中孵育90 min，I 000 r/ min离心，以含2 %FBS的PBS重悬至I X IO6 / mL，经40 μ m滤网过滤后于4 °C下存放至检测。检测前，加碘化丙啶(PI)染色标记死亡细胞，然后入流式细胞仪FACS Vantage SE(BD Bioscience)检测分选，350 nm波长紫外光激发Hoechst染色，荧光通过405/BP30(Hoechst蓝色)和570/BP20 (Hoechst红色)光学过滤器检测。(将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米缺失区域设定为SP细胞的门)，计算百分比，分选出SP细胞和非SP细胞。SP和non-SP的A549/DDP细胞在经流式细胞仪分选后加入完全RPMI培养基中，并在2小时内为进一步的实验使用。I. 3克隆形成试验用平板克隆形成试验来评估SP和non-SP A549/⑶DP细胞的体外成瘤能力。取生长良好的SP和non-SP A549/DDP细胞用PBS洗I次，O. 1%_0. 2%的胰蛋白酶消化后加入含10%小牛血清的培养液。1000r/min离心IOmin后收集细胞，用含10%小牛血清的培养液制成单细胞悬液，使100个SP和100个non-SP A549/DDP细胞分别培养在6孔培养板上，每组各有3个复孔。培养基每周换2次，10天后每个孔在显微镜下进行克隆计数。按下述公式计算克隆形成率(%CFE)=(克隆数/接种细胞数)X 100，并计算了克隆形成率的对数形式进行比较。I. 4流式细胞技术分析肺癌干细胞凋亡率流式细胞仪分离的侧群细胞经对照、顺钼、2-10%乙醇、2-10%乙醇-顺钼处理3小时后，用2. 5g/L的胰蛋白酶消化收集细胞,用Annexin V-FITC apoptosis detectionkit (BioVision, Mountain View, CA, USA)并用 FACScalibur flow cytometer (BDBioscience)流式细胞仪检测细胞凋亡率(按试剂盒中说明书操作)。I. 5动物和肿瘤生长
Balb/C裸鼠和N0D/SCID鼠均为雌性，6周龄，体质量18_20g，购于中国实验动物学会(CALAS)。取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶消化收集细胞，P B S洗I次，悬浮于生理盐水，取5 XlO6的A549/DDP 0. 2ml单细胞悬液分别接种至N0D/SCID鼠(成瘤试验)或Balb/C裸鼠(肿瘤生长试验)左侧肋部皮下，建立皮下移植瘤模型。荷瘤裸鼠肿瘤体积达0. 6cm3左右后，将48只Balb/C裸鼠随机分为以下4组，对照组、顺钼组、2-10%乙醇组、2-10%乙醇-顺钼组,每组12只，并开始相应治疗，治疗为0. 2ml相应药液瘤内注射，每3天一次，共4周。密切观察皮下肿瘤生长情况，每3天用游标卡尺测量肿瘤大小I次，按公式V= 1/2长径X短径2，计算肿瘤体积，并绘制皮下移植瘤生长曲线。动物生存观察至动物死亡或至125天截尾。I. 6体内成瘤试验24只5周龄的雌性联合免疫缺陷(N0D/SCID)小鼠购于中国实验动物学会(CALAS，北京)培养在无菌环境。小鼠分为8组，每组3只，分别于侧肋皮下注射接种100μ I 含 5 X IO5,1 X IO5,5 X IO4,5 X IO3 SP 细胞，或含 I X IO7,5 X IO6,5 X IO5,5 X IO4 non-SP细胞悬液。密切观察皮下肿瘤生长情况，每周用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式V= 1/2长径X短径2，计算肿瘤体积。成瘤能力比计算按公式成瘤能力比=成瘤所需的non-SP细胞数/成瘤所需的SP细胞数。I. 7统计学分析统计学分析应用SPSS19软件。生存数值表达为均数土标准误，分析采用Kaplan-Meier方法计算。计量资料数值表达为均数土标准差，采用t检验和方差分析进行统计分析。P〈0.05表示差异显著有统计学意义。2.结果2. I肺癌肿瘤干细胞的鉴定经过Hoechst33342染色后的流失细胞分析发现A549/CDDP细胞中存在10%_17%的SP细胞。加入维拉帕米的对照组A549/⑶DP细胞中SP细胞消失了(图I)。克隆形成试验观察了 10天。SP细胞的克隆形成能力较non-SP细胞明显高。SP细胞的LoglO CFE (colony forming efficiency)和non-SP细胞相比有明显统计学差异(I. 544 土 0.150 vs 0.301 土 0.082，Ρ〈0· 05，图 I)。体内成瘤试验发现，接种SP细胞的小鼠只需要5 XlO3个SP细胞便足以成瘤，而接种non-SP细胞的小鼠却需要超过5 XlO6个non-SP细胞才能在体内成瘤(图I)。A549/CDDP细胞分选获得的SP成瘤能力是non-SP细胞成瘤能力的1，OOO倍。其中，各接种5XlO4或5 XlO5个SP细胞的6只小鼠侧肋均有瘤体形成，而各接种5 XlO4或5 XlO5个non-SP细胞的6只小鼠侧肋均无瘤体形成。上述结果表明，FACS分选获得的SP细胞具有肿瘤干细胞的成瘤特性，为富含肺癌肿瘤干细胞的细胞群体，可以代表肺癌肿瘤干细胞用于肿瘤干细胞生物学特性和干预研究。图I中上图最上方A、B两图为应用流式细胞仪SP分选法分选获得A549/DDP细胞系的SP细胞；中左侧图C、D、E和F为分选获得的SP细胞经过体外细胞集落形成试验鉴定SP细胞具有肿瘤干细胞特性；中右侧图G为SP与non-SP的集落形成能力直观比较图，表明SP的集落形成能力显著高于non-SP细胞(P〈0. 01);下图为分选获得的SP细胞经过NOD/SCID鼠体内致瘤实验形成的肿瘤，SP细胞致瘤能力显著强于non-SP,致瘤能力提高1000倍。这表明流式细胞仪分选的A549/DDP SP细胞具有肺癌肿瘤干细胞的成瘤特性。
2.2 2-10%乙醇-顺钼诱导肺癌肿瘤干细胞凋亡与对照组凋亡率(2. 56%±0. 007)相比，2-10%乙醇-顺钼(97. 69%±0. 06)能显著诱导肺癌肿瘤干细胞凋亡(p〈0.01 )，而化疗药顺钼则不能。图2-1散点图为Annexin V染色细胞后流式细胞仪分析凋亡的直接结果图，其中，a为对照肺癌肿瘤干细胞；b为顺钼治疗后的肺癌肿瘤干细胞；c为2-10%的乙醇治疗后肺癌肿瘤干细胞；d为2-10%的乙醇-顺钼治疗后的肺癌肿瘤干细胞。图2-2为四个处理组细胞经流式细胞仪分析后凋亡率直观比较图。从图中可以看出，2-10%乙醇-顺钼能显著诱导肺癌肿瘤干细胞凋亡(P〈0. 01)。2. 3 2-10%乙醇-顺钼能诱导荷化疗耐药肿瘤裸鼠肿瘤消退荷瘤动物治疗四周后，2-10%乙醇-顺钼组动物肿瘤体积(0. 081 + 0. 06 cm3)低于2-10% 乙醇(3. 72±0· 83 cm3)、顺钼(2. 13±0· 31 cm3)和对照组动物(4. 18±0· 48 cm3)，差异均有显著性(P〈0.01)，见图3。其中，2-10%乙醇-顺钼组3只裸鼠肿瘤完全消退，表明2-10%乙醇-顺钼能克服化疗耐药并高效杀伤肿瘤。图3中，处最上方线为对照组动物肿瘤体积随时间增加后的变化线，稍下方为2-10%乙醇治疗后动物肿瘤大小变化线，再下方线为顺钼治疗组动物肿瘤大小变化线，最下方线为2-10%乙醇-顺钼治疗后动物肿瘤大小变化线。从上图可以看出，2-10%乙醇-顺钼治疗后动物肿瘤体积显著缩小(P〈0. 01)。2. 4 2-10%乙醇-顺钼显著延长荷瘤裸鼠生存荷瘤动物经2-10%乙醇-顺钼治疗后，生存时间显著延长。2-10%乙醇-顺钼组动物估计平均生存时间(123. 67±1. 11天)显著长于顺钼组(100. 25±4. 41天)、2_10%乙醇组(91. 08±5· 15天)和对照组(88. 92±7· 52天)，差异均具有显著性(P〈0. 01)。图4中a线为2-10%乙醇-顺钼治疗组生存曲线，b线为顺钼组生存曲线，c线为2-10%乙醇治疗组生存曲线，d线为对照组动物生存曲线。从上图4可以看出，2-10%乙醇-顺钼治疗组动物生存时间显著延长(P〈0. 01)。3.结论综上所述，2-10%乙醇-顺钼可以高效杀伤肺癌肿瘤干细胞和诱导荷瘤裸鼠耐药肿瘤消退并显著延长荷耐药肿瘤动物生存时间。
本发明药物使用方法和用量通过加入2-10毫升无水乙醇、40-50毫克顺钼和90_98毫升的灭菌水制备成100毫升药液。每位实体瘤患者可用上述药液20-30毫升进行肿瘤内局部注射或10 — 20毫升雾化吸入(治疗肺癌)，每周1-2次，连续2-3周治疗为一疗程。对于胸、腹、心包腔恶性积液患者，每例病人取100-500毫升含2-25毫升无水乙醇和10-30毫克顺钼的灭菌水溶液用于恶性胸腹腔和心包腔积液的灌注治疗，每周2-3次，连续2-3周治 疗为一疗程。
权利要求
1.一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物，其特征是所述药物组成为每100毫升药液含无水乙醇2-10毫升、顺钼40-50毫克和灭菌水90-98毫升。
2.根据权利要求I所述的能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物，其特征是可以用于替代顺钼的是多西紫杉醇、卡莫司汀、奥沙利钼、卡钼和吉西他滨中的一种或多种任意组合。
3.权利要求I所述的药物在制备治疗肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、腹膜后肿瘤或腹膜后淋巴结转移、贲门癌、胃肠道恶性肿瘤、软组织肉瘤和头颈部肿瘤的各种实体肿瘤及伴有胸、腹、心包腔恶性积液的耐药或不耐药的肿瘤的药物中的应用。
4.权利要求I所述的药物在制备治疗耐药细菌或真菌或病毒从而使其对抗感染药物重新敏感的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物及其应用，其特征是药物组成为每100毫升药液含无水乙醇2-10毫升、顺铂40-50毫克和灭菌水90-98毫升。本发明药物主要用于肿瘤局部注射或胸、腹、心包腔恶性积液的灌注治疗或肺部肿瘤的雾化吸入治疗，适用于肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、腹膜后肿瘤或腹膜后淋巴结转移、贲门癌、胃肠道恶性肿瘤、软组织肉瘤、胶质瘤和头颈部肿瘤等各种实体肿瘤及伴有胸、腹、心包腔恶性积液的耐药或不耐药的肿瘤治疗。
文档编号A61P31/04GK102772429SQ20121027236
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者李倩 申请人:李倩