专利名称：兽医微生物制剂的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明是一种兽医微生物制剂的制备方法及用途，涉及医药制品技术领域。
在现有技术中，对畜禽，尤其是幼龄畜禽，如仔猪患黄、白痢，羔羊及牛犊下痢，雏鸡白痢，雏鸭下痢等的预防和治疗方法，常采用抗菌素，不仅防治效果不好，有时还会产生药物的毒副作用。《江苏农学院学报》1983年4(1)，方定一对“正常仔猪肠道菌群的初步研究”一文中，提出了仔猪白痢可能与肠道菌群失调有关，并用大肠杆菌NY-10制剂口饲新生仔猪，防止黄痢的探讨，但均未制备出具有实用价值的微生物制剂。
本发明的目的是为了避免上述现有技术的不足之处而提供一种对畜禽尤其对幼龄畜禽下痢具有明显防治效果、无毒副作用、制备容易，使用方便的兽医微生物制剂的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术措施来达到将蜡样芽孢杆菌(BacillusCereus)SA38原种菌株接种于PH为7-7.2的普通琼脂斜面上，在35℃-38℃，最好在37℃温度下，培养18-24小时，经镜检鉴定合格后作为生产用菌种。再将生产用菌种接种于PH为7-7，2。含有0.25%的葡萄糖的种子大瓶或种子罐肉汤培养基中，在35℃-38℃，最好在37℃温度下，培养18-24小时，经检验证明纯粹，即可作为种子菌液，并可保存于0℃-4℃下，限三天内使用。将每毫升中含有蜡样芽孢杆菌活菌10-15亿个的种子菌液接种于大罐培养基中，按每100毫升培养基中加入80-100亿个活菌的菌液比例接种，培养基是由在净化的自来水或蒸馏水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏。0.3%的葡萄糖和0.5%的食用盐(按重量%计)组成，PH为7-7.2。在常温下，最好在30℃-32℃温度下，采用大罐深层通气和连续搅拌，罐内通气压力为0.2-0.4公斤，搅拌的速度为每分80-130转，以满足蜡样芽孢杆菌生长繁殖过程中对氧的需要。连续培养36-48小时，当菌液中蜡样芽孢杆菌的芽孢形成数量达到9%以上时，进行每分钟达15000转以上的高速离心5-10分钟，去其上层澄清液，留存下层灰白色菌体，然后按菌体与无水淀粉1∶4的比例(按重量比计)向菌体中加入淀粉，经75℃-85℃干燥、粉碎、过80目筛，即获得每克混合物中含有蜡样芽孢杆菌活菌数至少40亿个的菌粉。再将葡萄糖、菌粉与淀粉按1∶3∶6的比例(按重量比计)混合均匀，即得每克中含有蜡样芽孢杆菌活菌10-15亿个的粉剂。在粉剂中加入适量的水分，压制，即得片剂。每片重量为0.3克，每克含活菌10亿个以上。
按上述方法制备的片剂或粉剂，用于畜禽，尤其是对幼龄畜禽因需氧或兼氧微生物引起的下痢，包括仔猪黄、白痢、羔羊及牛犊下痢，雏鸡白痢，雏鸭下痢等的预防和治疗的微生物制剂。
蜡样芽孢杆菌(BacillusCereus)SA38菌株，是一种已知的可以通过商业渠道获得的菌种，其商品目录见《中国菌种目录》(中国微生物菌种保藏管理委员会编著，轻工业出版社出版，1993年10月)。
一.细菌学特征1.形态与染色为革兰氏染色阳性，杆状，单个或呈短链状排列，大小0.9×2.0u，芽孢居中，胞内β-羟基丁酸盐。用苏丹黑染色，呈黑色颗粒。有鞭毛能运动，无荚膜。
2.培养特性普通肉汤培养24小时，呈混浊生长，菌膜较薄。在普通琼脂平皿上培养18-24小时，菌落园形，边缘整齐，表面低，呈乳脂样不透明，大小为4-5mm。在鲜血营养琼脂上培养24-48小时，不产生β溶血。
3.生化反应对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖产酸，对乳糖、木糖、甘露醇、阿拉伯胶糖不产酸，硝酸盐还原试验(+)，枸椽酸试验(-)，明胶液化(-)，氧化酶试验(-)，淀粉水解(+)，接触酶试验(+)。
4.血清学鉴定用SA38蜡样芽孢杆菌标准菌株免疫家兔，制成效价达640-1280的高免血清，用此血清与SA38菌种试验应产生特异性凝集反应。
5.纯粹试验用普通琼脂斜面、沙门氏斜面、厌气肉肝汤各2支，每支接种0.2毫升，培养3-5天，作革兰氏染色镜检，观察结果应纯粹。
二.产品质量检验1.成品指标
外观呈白色或浅褐色的粉剂或片剂，无特殊气味;水份＜5%;
均匀度变异系数＜7%;
杂菌数每克产品含杂菌数不超过10，000个;
芽孢数每克产品中含活菌芽孢10亿个以上。
2.存活期在室温条件下，菌粉中活菌数在6个月内无变化，7-12个月含活菌90%以上，1-1.5年含活菌80%以上，粉剂或片剂的保存期为1-1.5年。
3.芽孢计数每批(组)随机抽样3个样品，各次1克，用生理盐水稀释100倍，然后10倍递进稀释至10-8，接种鲜血马丁琼脂平皿2个，各0.1毫升，培养计算平均菌数，以3个样品中最低芽孢数为该批(组)制剂的菌数，每克制剂含活芽孢数不得少于10亿个。
4.安全性检验用5-10日龄雏鸡10羽，每天每羽投服制剂1克(不少于2亿个活菌)，连服3天。另取同样条件雏鸡10羽，作为对照。饲养观察10天，应健活;或试验组与对照组合计死亡数不超过3羽，且试验组不超过对照组的死亡数为合格。
用18-22克小白鼠10只。每只腹注制剂0.1克，观察10天，应健活。
三.用法及用量治疗量猪、牛、羊、兔、按每公斤体重0.1-0.15克，雏鸡与雏鸭每只30-50毫克，口服，每日一次，连服3日。预防量减半，连服7日。本品不得与抗菌药或抗菌药物添加剂同时使用。
本发明的工艺流程是菌种培养→一级种子罐培养→生产大罐培养→通气、搅拌→离心→干燥→检验→粉剂或片剂。
本发明下面将结合实施例作进一步详述例一将存活的蜡样芽孢杆菌(BacillusCereus)SA38原种菌株接种于普通琼脂斜面上，在37℃温度，PH为7，培养18小时;再接种于PH为7，含有0.25%葡萄糖的种子罐肉汤培养基中，在37℃温度，培养18小时，成为种子菌液;将种子菌液接种于大罐培养基中，按每100毫升培养基中加入含有90亿个活菌的种子菌液的比例接种，培养基是在净化的自来水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%的葡萄糖和0.5%的食用盐(按重量%计)组成，PH为7，在30℃温度下，采用大罐深层通气和连续搅拌，罐内通气压力为0.2公斤，搅拌每分钟80转培养36小时，当菌液中蜡样芽孢杆菌的芽孢形成数量达到90%以上时，高速离心5分钟，转速每分钟15000转，去其上层沉清液，留存下层灰白色菌体，然后按菌体与无水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌体中加入淀粉，75℃干燥后，粉碎、过80目筛余，得每克混合物中含有蜡样芽孢杆菌活菌至少40亿个的菌粉，再将葡萄糖、菌粉与淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)，均匀混合，即得每克混合物中含有存活蜡样芽孢杆菌约15亿个的粉剂。
例二重复例1的微生物粉剂的制备方法，将获得的粉剂加入适量的水份，压制，得片剂，每片重量为0.3克，每片含活菌数约3亿个。
例三上述粉剂(或片剂)口服，用于治疗猪、牛、羊、兔下痢每公斤体重0.15克;治疗雏鸡下痢，每只50毫克，每天一次，连服3天。预防量减半，连服7天。禁止抗菌药物同时使用。
本发明相比现有技术的优点是1.疗效好。治疗仔猪黄、白痢99，588例，治愈率达94.50%，高于氯霉素等7种抗菌药物平均77.20%的疗效;治疗牛犊下痢56头，治愈率达96.6%，高于用抗生素治疗86.7%的疗效;治疗雏鸡白痢263，196只，治愈率达92.2%，治疗雏鸭下痢106，076只，治愈率为91%，均高于抗菌药物疗效。
2.安全性好。试验6批，用1.5-1.8公斤重的健康家兔作安全试验，结果无不良反应。对人、畜、禽均安全。
3.费用低。易于制造，生产成本低。
4.使用方便。对畜禽可口服，也可饲用。
权利要求
1.一种兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于将存活的蜡样芽孢杆菌(BacillusCereus)SA38原种菌株接种于普通琼脂斜面上，在PH为7-7.2，35℃-38℃温度下，培养18-24小时，成为生产用菌种；再将生产用菌种接种于含有0.25%葡萄糖的种子大瓶或罐内肉汤培养基中，在PH为7-7.2，35℃-38℃温度下，培养18-24小时，成为每毫升含有蜡样芽孢杆菌活菌10-15亿个的种子菌液；将种子菌液接种在大罐培养基中，按每100毫升培养基中加入80-100亿个活菌的种子液比例接种，培养基是由在净化的自来水或蒸馏水中，加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%葡萄糖和0.5%的食盐(重量%)组成，PH为7-7.2，在常温下，采用大罐深层通气和连续搅拌，培养36-48小时；当菌液中蜡样芽孢杆菌的芽孢形成数达到90%以上时，通过高速离心5-10分钟，去其上层清液，留存下层灰白色菌体，然后按菌体与无水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌体中加入淀粉，经75℃-85℃干燥后，粉碎、过80目筛，获得每克混合物中含有蜡样芽孢杆菌活菌至少40亿个的菌粉；再将葡萄糖、菌粉与淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)均匀混合，即得每克混合物中含有存活蜡样芽孢杆菌10-15亿个的粉剂；粉剂加入适量水分，经压制得片剂。
2.如权利要求1所述的兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于生产用菌种或种子菌液的培养温度为37℃。
3.如权利要求1或2所述的兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于大罐内培养的温度为30℃-32℃。
4.如权利要求1或2所述的兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于大罐内深层通气的压力为0.2-0.4公斤，搅拌速度为每分钟80-130转。
5.如权利要求3所述的兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于大罐内深层通气的压力为0.2-0.4公斤，搅拌速度为每分钟80-130转。
6.如权利要求1所述的兽医微生物制剂的制备方法，其特征在于片剂的重量为0.3克，每克中含有蜡样芽孢杆菌活菌10亿个以上。
7.如权利要求1所述的兽医微生物制剂，其特征在于用于预防治疗畜禽腹泻，尤其对需氧或兼氧性微生物引起的幼龄畜禽下痢，包括仔猪黄、白痢羔羊及牛犊下痢，雏鸡白痢，雏鸭下痢有良好效果。
全文摘要
本发明是一种兽医微生物制剂的制备方法及用途涉及医药制品技术领域。它是将蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus)SA38菌株，采用菌种培养，一级种子罐培养、生产大罐培养，然后进行高速离心沉淀，获得灰白色菌体，加入无水淀粉，经干燥、粉碎、过筛，即得每克混合物中含有存活芽孢杆菌10亿个以上的粉剂。将粉剂加入适量的水分，压制，即得片剂。每片重0.3g。作为畜禽，尤其对幼龄畜禽下痢的预防和治疗用生物制剂。
文档编号A61K35/74GK1090202SQ93101239
公开日1994年8月3日 申请日期1993年1月19日 优先权日1993年1月19日
发明者何明清 申请人:四川农业大学