专利名称：含硼的肽衍生物及其制备和治疗学上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含硼的肽衍生物及其制备和在治疗学上的应用。
本发明化合物具有式(Ⅰ)结构 (Ⅰ)其中R代表氢、直链或支链的(C1-C4)烷基、直链或支链的-CO(C1-C4)烷基、或者直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基，R1代表苯基或环己基，R2代表 ，其中R5是氢或(C1-C4)烷基，并且R3和R4或者各自代表氢，或者一起代表二羟化合物的残基例如象丁-2，3-二醇、2，3-二甲基丁-2，3-二醇或(1α，3α，5α)-2，6，6-三甲基双环[3.1.1]庚-2，3-二醇[(+)-α-蒎烷二醇(pinanediol)]的残基。
根据取代基R3和R4的定义，本发明化合物具有3或7个不对称中心。
本发明化合物可以纯的或混合物形式的光学异构体或几何异构体的形式存在，所有这些形式均构成本发明的一部分。
根据本发明，优选的具有3个不对称中心的化合物是[2(R)]构型的D-丙氨酰-L-脯氨酰胺衍生物，而优选的具有7个不对称中心的化合物是[3aS，[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]构型的D-丙氨酰-N-[(4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂(benzodioxaborol)-2-基)甲基]-L-脯氨酰胺衍生物。
本发明化合物可以游离碱形式或者可药用的酸和碱加成盐的形式存在，所有这些形式均构成本发明的一部分。
在本发明化合物中，优选的化合物是其中R2代表 的化合物，此处R5是氢或(C1-C4)烷基。
在所述化合物中，更优选的化合物是其中R代表氢或者直链或支链的(C1-C4)烷基、R1代表苯基并且R3和R4各自代表氢的那些化合物。
最后，本发明最优选的化合物是(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸以及其可药用的酸和碱的加成盐。
按照反应路线1，可以合成其中R2代表 的本发明化合物。
反应路线1
在溶剂例如二噁烷中，使式(Ⅱ)的三肽硼化合物(其中R1如前所定义，R3和R4一起代表如前所定义的二羟化合物的残基，当R7代表直链或支链的-CO(C1-C4)烷基时R5代表氢，或者当R7代表氢或者直链或支链的(C1-C4)烷基时R6代表直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基)与式(Ⅲ)化合物(其中R5是氢或(C1-C4)烷基反应，制得式(Ⅰa)化合物。然后，如果需要制得式(Ⅰb)化合物(其中R、R1和R5如前所定义)，可使式(Ⅰa)化合物与盐酸或三氯化硼反应。
按照反应路线2，可以合成其中R2代表 的本发明化合物，此处R5是氢或(C1-C4)烷基。
反应路线2
反应路线2(续)
反应路线2(续) 在溶剂例如丙酮中使式(Ⅳ)的[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂与碘化钠反应，制得式(Ⅴ)的[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂，再使之与式(Ⅵ)化合物(其中R5如前所定义)缩合，制得式(Ⅶ)化合物;该反应在溶剂例如四氢呋喃中于-78℃～+20℃的温度下进行。然后按Mattheson在Organomettallics，(1984)，3，614中所述的类似的方法，在溶剂例如四氢呋喃中于-100～+20℃的温度下使式(Ⅶ)化合物与二氯甲基锂在氯化锌存在下反应，制得式(Ⅷ)化合物，使该化合物与二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂反应;该反应在溶剂例如四氢呋喃中于-78～+20℃的温度内进行。将得到的化合物在溶剂例如二噁烷中用盐酸处理，并且将所得的式(Ⅸ)的盐酸盐水解，制得式(Ⅹ)的(R)-α-氨基-丁基硼酸二盐酸盐，使该二盐酸盐与式(Ⅺ)的二醇(其中R3和R4一起代表如前所定义的二羟化合物的残基)反应，制得式(Ⅻ)的盐酸盐;然后将式(Ⅻ)化合物与式(ⅩⅢ)的二肽活化形式(其中R1如前所定义，当R7代表直链或支链的-CO(C1-C4)烷基时R6代表氢，或者当R7代表氢或者直链或支链的(C1-C4)烷基时R6代表直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基，并且X代表吡咯烷-1-基-2，5-二酮或者2-甲基丙氧羰基)缩合，将制得的化合物用盐酸处理，得到式(Ⅰc)化合物。然后，如果需要制备式(Ⅰd)化合物(其中R、R1和R5如前所定义)，可将式(Ⅰc)化合物与盐酸或三氯化硼反应。
起始原料可在市场上买到，或者在先有技术中有所描述，或者可按已描述过的方法或本领域技术人员熟知的方法制备。
同样地，欧洲专利申请No.0293881中描述了式(Ⅱ)的三肽。Kettner等人在J.Biol.Chem.(1990)，265，18289中描述了N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸、[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-溴-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺和1-[N-[(1，1-二甲基乙氧基]-D-苯丙氨酰]-L-脯氨酸。欧洲专利No.0293881中描述了[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂。Ngochindo在J.Chem.Soc.Perkin Trans.(1990)，1，1645中描述了2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺。法国专利申请FR 9404287中描述了式(Ⅻ)化合物的制备。按类似于Bajusz在J.Med.Chem.，(1990)，33，1729-1735中所述的方法，由相应的式(ⅩⅢ)化合物(其中R7代表氢)作原料，可制备式(ⅩⅢ)化合物(其中R6代表直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基并且R7代表直链或支链的(C1-C4)烷基)。
下列实施例说明了某些本发明化合物的制备。微量元素分析及IR和RMN光谱证实了所得化合物的结构。例举的化合物的编号相应于后文表中化合物的编号。括号中的比率表示碱∶酸的摩尔比率。
实施例1(化合物1)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)1.1.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基-六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺将3g(4.8mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-溴-1-(3a，5，5-三甲基-六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺和0.902g(9.6mmol)1H-咪唑溶解在10ml二噁烷中。于80℃加热6小时然后真空蒸发溶剂。将残余物重新溶解在50ml二氯甲烷中然后连续用5%碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤有机相。用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。经硅胶柱色谱法纯化，用甲醇∶二氯甲烷(5∶95)混合液洗脱，制得1.2g油状产物。
产率41%。20D＝-77.5°(c＝1.5;氯仿)。
1.2.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)将1.2g(1.97mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基-六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺溶解在3ml氯仿中并将该溶液冷却至0℃。加入20ml0.1N的盐酸/异丙醇溶液，在0℃下搅拌15分钟，真空浓缩。经五氧化磷干燥后残余物用乙醚研制。得到1g无定形固体状的产物，熔点99℃。
产率78%。20D＝-90.4°(c＝1.1;氯仿)。
实施例2(化合物2)(R)-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[1-(二羟硼基)-4-(1H-咪唑-1-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)将700mg(1.2mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-1-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐溶解在6ml无水二氯甲烷中。将该溶液冷却至-78℃并在15分钟内逐滴加入5ml(5mmol)1M三氯化硼的二氯甲烷溶液。于-78℃搅拌15分钟并于0℃搅拌45分钟，然后慢慢加入15ml水。将该溶液于0℃搅拌30分钟然后加入10%乙酸溶液。分离各相，用3×10ml乙醚萃取水相并蒸发至干。残余物经Biogel P2 柱色谱法纯化，用10%乙酸洗脱。浓缩含有产物的级份并在乙醚中研磨残余物，得到白色粉末状产物。将该产物用2ml水稀释，得到的溶液经Biorad AG 1W8 (OH型)柱色谱法纯化，用水和1N盐酸溶液洗脱。浓缩含有产物的级份并在乙醚中研磨残余物，制得50mg产物。
熔点168～175℃(分解)产率10%。20D＝-118.5°(c＝0.6;水)。
实施例3(化合物3)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)3.1.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的盐酸盐(1∶2)3.1.1[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂将37g(122mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-溴丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂和72.7g(488mmol)碘化钠在500ml丙酮中的溶液在回流温度下保持24小时。蒸发溶剂，并将残余物重新溶解在500ml乙醚和100ml含有1g亚硫酸钠的水的混合液中。有机相用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。制得40g产物，该产物在后续步骤中直接应用。
产率95%。
3.1.2[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-4(5)-[3-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丙基]-1H-咪唑-1-磺酰胺将70.5g(244mmol)2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺溶解在250ml四氢呋喃中。将该反应介质冷却至-78℃并加入152ml(244mmol)1.6M正丁基锂的己烷溶液。于-78℃搅拌1小时然后加入40g(115mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-(3-碘丙基)-3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂在100ml四氢呋喃中的溶液。将反应介质在-78℃～+20℃搅拌1小时然后在20℃搅拌2小时。将反应介质倒入350ml含有14.5g(121mmol)硫酸氢钠的冰-水混合液中。用3×100ml乙醚萃取水相，合并醚相，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物经硅胶柱色谱法纯化，用20%乙酸乙酯/己烷溶液洗脱，制得45g产物。
产率73%20D＝+12.5°(c＝1.9;氯仿)。
3.1.3.[3aS-[2(S)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氯-4-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺将8.3g(98mmol)二氯甲烷在100ml四氢呋喃中的溶液冷却至-100℃。加入39.1ml(98mmol)2.5M正丁基锂的己烷溶液。在该温度下保持15分钟然后加入45g(89mmol)[3aS-(3aα，4β，6β，7aα)]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-4(5)-[3-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丙基]-1H-咪唑-1-磺酰胺在50ml四氢呋喃中的溶液。将反应混合物在-100℃下保持15分钟并加入9.8g(70mmol)氯化锌在50ml四氢呋喃中的溶液。在16小时内恢复至+20℃。真空蒸发并将残余物重新溶解在200ml二氯甲烷和50ml水的混合液中。分离各相，用100ml二氯甲烷萃取水相。合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。所得的有色残余物经硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯∶己烷(20∶80)混合液洗脱。制得40g无色油状产物。
产率“80%。20D＝+15.9°(c＝2.65;氯仿)。
3.1.4[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氨基-4-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺的盐酸盐(1∶1)
配制12.6g(78mmol)1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷在80ml四氢呋喃中的溶液并加入31ml(78mmol)2.5M正丁基锂的己烷溶液。在-78℃下保持1小时并加入40g(71mmol)[3aS-[2(S)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氯-4-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-2-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺在80ml四氢呋喃中的溶液。在-78℃下搅拌1小时并在+20℃下搅拌16小时。将反应介质冷却至-78℃，加入78ml(312mmol)4N盐酸的二噁烷溶液并在-78℃搅拌1小时和在+20℃搅拌2小时。真空蒸发，并将残余物重新溶解在200ml氯仿中。过滤并蒸发，得到32g油状产物，将该产物用乙醚研制，得到固体状的产物。
产率89%熔点90～92℃[α]20D＝+11°(c＝1;甲醇)。
3.1.5.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的盐酸盐(1∶2)将32g(70mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-4(5)-[4-氨基-4-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-N，N-二甲基-1H-咪唑-1-磺酰胺的盐酸盐在200ml4N盐酸中的溶液回流3小时。用4×100ml乙醚萃取该溶液并蒸发至干。将残余物重新溶解在100ml甲醇中并加入11.9g(70mmol)[1R-(1α，2α，3α，5α)]-2，6，6-三甲基二环[3.1.1]庚-2，3-二醇。在20℃下搅拌16小时并蒸发至干，得到27g油状产物，将该油状物用乙醚研制，得到固体状产物。
熔点75～80℃。
3.2.N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸与1-羟基吡咯烷-2，5-二酮的酯将6g(20mmol)N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸悬浮在100ml乙酸乙酯和5ml二甲基甲酰胺的混合液中。加入2.53g(22mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮并冷却至0℃。然后分小批量加入4.53g(22mmol)固态1，3-二环己基碳二亚胺。在20℃下搅拌20小时，并过滤该悬浮液。将滤液连续用20ml5%碳酸氢钠溶液和氯化钠饱和溶液洗涤，并用硫酸镁干燥。用乙醚研制所得残余物，得到8g透明产物，该产物在后续步骤中直接应用。
3.3.[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)将2.4g(6.4mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的盐酸盐溶解在20ml二氯甲烷中，加入2.5g(6.4mmol)N-乙酰-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸与1-羟基吡咯烷-2，5-二酮的酯并将混合物冷却至-30℃，滴加入3.6ml(25.6mmol)三乙胺并在-30℃～+20℃搅拌2小时然后在+20℃搅拌2小时。然后加入20ml5%碳酸氢钠水溶液，再用2×20ml二氯甲烷萃取水相。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。
将残余物重新溶解在10ml异丙醇中并在0℃用64ml 0.1N盐酸的异丙醇溶液处理。蒸发后，将残余物用骨炭在乙酸乙酯中脱色并经Sephadex LH-20柱纯化，用甲醇洗脱。蒸发，残余物用乙醚研制，得到2g无色固体状产物。
熔点130～135℃，产率51%[α]20D＝-112.1°(c＝1;氯仿)。
实施例4(化合物4)(R)-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[1-(二羟硼基)-4-(1H-咪唑-4(5)-基)丁基]-L-脯氨酰胺的盐酸盐(1∶1)配制2g(3mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-N-乙酰-D-苯丙氨酰-N-[4-(1H-咪唑-4(5)-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]-L-脯氨酰胺在30ml二氯甲烷中的盐酸盐溶液。将该溶液冷却至-78℃，逐滴加入12ml 1M三氯化硼的二氯甲烷溶液。将该混合物在-78℃保持15分钟然后放置在冰浴中并于0℃搅拌45分钟。向反应介质中加入30ml水，分离各相。用2×25ml的10%乙酸溶液萃取有机相，水相用3×25ml乙醚萃取。合并水相，浓缩，将残余物稀释在10ml甲醇中并蒸发。残余物经Bio-gel P2柱色谱法纯化，用10%乙酸溶液洗脱，然后经Bio-gel P2柱色谱法纯化，用1mM盐酸溶液洗脱，得到800mg产物。
熔点155～160℃，产率52%[α]20D＝-98.5°(c＝0.65;水)。
实施例5(化合物5)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯的盐酸盐(1∶1)在环境温度下，将7.2g(7.2mmol)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-D-苯丙氨酰-L-脯氨酸在30ml四氢呋喃中的溶液用2.3ml(21mmol)N-甲基吗啉处理。将反应介质冷却至-20℃并加入2.72ml(21mmol)氯甲酸异丁酯。将混合物在-20℃搅拌15分钟，加入7.5g(20mmol)[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-α-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)-1H-咪唑-4(5)-丁胺的盐酸盐在10ml氯仿中的溶液和5.6ml(40mmol)三乙胺。将混合物在-20℃下搅拌30分钟然后在环境温度搅拌24小时。用300ml乙酸乙酯稀释并连续用200ml水和200ml氯化钠饱和溶液洗涤。用硫酸钠干燥，将溶剂蒸发至干并将残余物重新溶解在50ml二氯甲烷中。加入20ml异丙醇/0.1N盐酸溶液以制备所述盐酸盐，经Lichroprep RP18柱色谱法纯化，用乙腈/0.02N盐酸(20%→100%)进行梯度洗脱，得到5g盐酸盐形式的产物。
熔点115～120℃，产率45%[α]20D＝-106°(c＝1;氯仿)。
实施例6(化合物6)(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸的盐酸盐(1∶3)按实施例4中所述的操作方法，从698mg(1mmol)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯的盐酸盐开始制备，经Lichroprep RP18柱色谱法纯化，用乙腈/0.02N盐酸梯度洗脱，制得300mg所需化合物。
熔点194℃[α]20D＝-131°(c＝1.3;水)。
实施例7(化合物7)[3aS-[2[R[S(R)]]，3aα，4β，6β，7aα]]-[2-[2-[[[4-(5-甲基-1H-咪唑-4-基)-1-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)丁基]氨基]羰基]吡咯烷-1-基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]氨基甲酸1，1-二甲基乙酯的盐酸盐(1∶1)按实施例5中所述的方法，从[3aS-[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]]-5-甲基-α-(3a，5，5-三甲基六氢-4，6-亚甲基-1，3，2-苯并二氧杂硼杂茂-2-基)-1H-咪唑-4-丁胺的盐酸盐开始制备，得到600mg产物。
熔点85～90℃[α]20D＝-53.2°(c＝0.86;甲醇)。
后续的表中说明了本发明某些化合物的化学结构和化学性质。在“R1”栏中，-C6H5代表苯基并且-C6H11代表环己基。在“盐”栏中，“HCl”代表盐酸盐，括号中的比率代表碱∶酸的摩尔比。在“F(℃)”栏中，“(d)”表示分解点。



下列试验中测试了本发明化合物对于凝血酶和胰蛋白酶的作用1.牛凝血酶对人纤维蛋白原的沉淀作用在人纤维蛋白原的生理盐水溶液(200μl，2mg/ml)中于37℃下将待测试的化合物或其载体(10μl)培养2分钟。
然后加入溶解在蒸馏水中的牛凝血酶(200μl)。该凝血酶的最终浓度为0.5 NIH单位/ml。搅拌混合物，记录形成了明显纤维蛋白网络的时间，用秒表示。通过计算100%增加沉淀时间的化合物浓度来定量纤维蛋白形成的抑制作用(CA100)。
2.人凝血酶对人纤维蛋白原的沉淀作用在人纤维蛋白原的生理盐水溶液(200μl，2mg/ml)中于37℃下将待测试的化合物或其载体(10μl)培养2分钟。
然后加入溶解在蒸馏水中的人凝血酶(200μl)。该凝血酶的最终浓度为2 NIH单位/ml。搅拌混合物，记录形成了明显纤维蛋白网络的时间，用秒表示。通过计算100%增加沉淀时间的化合物浓度来定量纤维蛋白形成的抑制作用(CA100)。
3.牛凝血酶对大鼠血浆的凝固作用用戊巴比妥钠(60mg/kg，0.1ml/kg)麻醉重150～200g的雄性CD大鼠。从后眶窦(sinusrétro-orbital)抽血置于3.8%柠檬酸三钠中(1vol/9vol血)。于室温在3600g离心力下离心15分钟，制备血浆。将待测试的化合物或其载体(10μl)与200μl血浆一起在37℃培养2分钟，然后加入200μl牛凝血酶溶液。该凝血酶的最终浓度为0.75NIH单位/ml。记录凝血时间，用秒表示。
通过计算100%增加凝血时间的化合物浓度来定量凝血酶的抑制作用(CA100)。
4.人凝血酶诱发的兔血小板聚集经心脏穿刺术抽血，置于3.8%柠檬酸三钠中(1vol/9vol血)。在250g离心力下离心10分钟。移取如此得到的血小板富集的血浆(P3P)并将血小板计数。
向P3P中加入2ng/ml溶解在冷冻tris缓冲液(pH9.0)中的前列腺环素溶液。将混合物在110g离心力下离心10分钟并倾析。再加入前列腺环素在50mM氢氧化钠(pH 12)中的溶液，使得最终浓度为200ng/ml。再在800g离心力下将P3P离心10分钟。转移贫血小板血浆并将该沉淀物悬浮在含有200ng/ml前列腺环素的一体积tyrode溶液中，该体积等于P3P的初始体积。将该悬浮液在800g下离心10分钟。在相同条件下再次重复进行上述操作，即将沉淀物置于悬浮液并离心。将最终的沉淀物重新悬浮在无前列腺环素的tyrode溶液中并静置2小时以使得前列腺环素完全除去。用人凝血酶诱发这些血小板聚集至最终浓度为0.3 NIH单位/ml。用agrégomètre à 4 canaux记录光密度的变化。将待测试的化合物或其载体加到血小板悬浮液中(加入的最大体积为3μl)，2分钟后加入凝血酶。测定抑制50%聚集作用的化合物浓度(CI50)。
5.对牛胰蛋白酶的活性室温下将待测试的化合物或其载体(50μl)与溶解在trisHCl缓冲剂(pH8.0)中的50μl牛胰蛋白酶溶液一起培养5分钟。胰蛋白酶的最终浓度是229单位/ml。加入底物Na-苯甲酰-L-精氨酸-4-硝基苯胺(50μl，最终浓度50μM)，触发反应。将反应混合物在室温培养20分钟并在405nm处测量释放的4-硝基苯胺的光密度。在减去“空白”(100μl缓冲液+50μl底物)的光密度后，用校正曲线来计算4-硝基苯胺的浓度。测定抑制50%酶活性的化合物浓度(CI50)。
类似地测试了本发明化合物在体外对大鼠血浆的凝血作用。在抽血前用待测试的化合物或其载体经静脉、口服或皮下途径处理动物。如上文3中所述测定凝血酶时间。
本发明化合物是凝血酶抑制剂，CA100和CI50值在10-8～10-6M之间。本发明化合物对牛胰蛋白酶没有或几乎没有抑制活性，这说明了本发明化合物的特异性。
本发明化合物在1mg/kg(静注)剂量以下抑制大鼠血浆的凝固，并且经口服和皮下途径也是有效的。
本发明化合物可用于与血栓形成有关的全部临床适应症或者其中可能会涉及血栓形成并发症的所有临床适应症。
为此目的，本发明化合物可与合适的赋形剂一起制成任何合适的剂型，例如片剂、糖丸剂、包括明胶胶囊的胶囊剂、可饮用或注射用的悬浮剂或溶液剂等，用于口服、非胃肠途径或静脉内给药，每位患者可施用的日剂量可以是1～1000mg，分1次或多给药。
权利要求
1.纯的或混合物形式的、光学或几何异构体形式的式(Ⅰ)化合物以及其可药用的酸和碱加成盐， 其中R代表氢、直链或支链的(C1-C4)烷基、直链或支链的-CO(C1-C4)烷基、或者直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基，R1代表苯基或环己基，R2代表 ，其中R5是氢或(C1-C4)烷基，并且R3和R4或者各自代表氢，或者一起代表二羟化合物的残基例如丁-2，3-二醇、2，3-二甲基丁-2，3-二醇或(1α，3α，5α)-2，6，6-三甲基二环[3.1.1]庚-2，3-二醇[(+)-α-蒎烷二醇]的残基。
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于根据R3和R4的定义，所述构型是[2(R)]或[3aS，[2(R)，3aα，4β，6β，7aα]。
3.根据权利要求1和2的任一权项的化合物，其特征在于R2代 ，其中R5是氢或(C1-C4)烷基。
4.根据权利要求3的化合物，其特征在于R代表氢或直链或支链的(C1-C4)烷基，R1代表苯基并且R3和R4各自代表氢。
5.(R)-[1-[(D-苯丙氨酰-L-脯氨酰)氨基]-4-(1H-咪唑-4-基)丁基]硼酸以及其可药用的酸和碱加成盐。
6.制备权利要求1所述的其中R2代表 并且此时R5为氢或(C1-C4)烷基的式(Ⅰ)化合物的方法，该方法的特征在于将式(Ⅱ)的三肽硼化物与式(Ⅲ)化合物反应， 其中R1如权利要求1中定义，R3和R4一起代表如权利要求1中所述的二羟化合物的残余，当R7代表直链或支链的-CO(C1-C4)烷基时R6代表氢，或者当R7代表氢或者直链或支链的(C1-C4)烷基时R6代表直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基， (Ⅲ)其中R5如权利要求1中定义，制得式(Ⅰa)化合物， (Ⅰa)然后如果需要制备式(Ⅰb)化合物，将式(Ⅰa)化合物与盐酸或三氯化硼反应 (Ⅰb)其中R、R1和R5如权利要求1中定义。
7.制备权利要求1所述的其中R2代表 并且此时R5为氢或(C1-C4)烷基的式(Ⅰ)化合物的方法，该方法特征在于将式(Ⅻ)的盐酸盐与式(ⅩⅢ)二肽的一种活化形式缩合， (Ⅻ)其中R3和R4一起代表如权利要求1中所述的二羟化合物的残基，R5如权利要求1中定义， (ⅩⅢ)其中R1如权利要求1中定义，当R7代表直链或支链的-CO(C1-C4)烷基时R6代表氢，或者当R7代表氢或直链或支链的(C1-C4)烷基时R6代表直链或支链的-CO2(C1-C4)烷基，X代表吡咯烷-1-基-2，5-二酮或者2-甲基-丙氧羰基，制得的化合物经盐酸处理，形成式(Ⅰc)化合物， (Ⅰc)然后如果需要制备式(Ⅰd)化合物，将式(Ⅰc)化合物与盐酸或三氯化硼反应， (Ⅰd)其中R、R1和R5如权利要求1中定义。
8.药物，其特征在于所述药物含有权利要求1～5中任一权项所述的化合物。
9.药物组合物，其特征在于所述组合物含有权利要求1～5中任一权项所述的化合物和与之结合的任何合适的赋形剂。
全文摘要
纯的或混合物形式的、光学或几何异构体形式的式(I)化合物以及其可药用的酸和碱加成盐，以及其在治疗学上的应用，其中R、R
文档编号A61K38/05GK1113493SQ95103889
公开日1995年12月20日 申请日期1995年4月11日 优先权日1994年4月12日
发明者S·马拉特, G·拉萨勒, T·A·佩塞尔, J·C·穆勒 申请人:合成实验室公司