专利名称：：预防性结核疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基于结核分枝杆菌复合群(complex)毒力株细胞壁片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗结核的药物中的应用。
背景技术：
：结核是由结核分枝杆菌复合!^(MrB-C廣弓胞的一种慢性感染性疾病，戶腿结核分枝杆菌复合群目前包括结核分枝杆菌(M/w6ercw/a^J、牛分支杆斷MBo—、田鼠分支杆菌(M附/cro^^^瞎'卜l:^支杆菌(AfW/c麵附入根据世界卫生组织，世界范围内每年记录感染该疾病的新增病例约为8,000,000例，约3，000，000人死亡。认为世界范围内现有皿2,000，000，000的人感染，每年产生新的感染数约为9千万-l亿。现有用于预防治疗结核的疫苗是基于菌株BCG(卡介節的，其是牛分支杆菌的一种减毒变体。现有技术中描述了多种基于分枝杆菌属毒力株或无毒力株的细胞壁片段的抗结核疫苗。还描述了用于该疫苗组合物中的佐剂显著地影响其效果。E.Ribi等,Nature1963，198,1214-1215页描述了4顿包含无毒力BCG株的细胞壁片段和矿物油的组合物进行的免疫测定。所述片段通过在矿物油中匀浆所述菌株的培养物获得。该组，比传统的疫苗(BCG)更为有效。然而，在同一篇文章中提到在水中并且不存在矿物油的条件下匀1时，其不能引起倒可免疫反应。D.P.Pal等，IndianJ.MedRes.1977，65,340~345页，描述了用H37Rv毒力株的细鹏片段和矿物油制备的疫苗。在这种情况下，戶腿细M片段M将死细胞妇細中匀浆获得，随后向组合物中加入矿物油。其同样描述了该7K相中的细胞断段是非免疫原性的，矿物油的存，于疫苗的效力来说是必须的。GK,Khuller等，FoliaMicrobiol.,1992，37,407412页，描述了用Freund不完全佐剂制备的结核分枝杆菌H37Ra无毒力,胞壁的不同片段的，效果，其同样包括了矿物油。RM.Agger等,Scand.J.Immunol"2002，56，443氺7页，描述了包含H37Rv毒力株的细胞壁片段的疫苗，当其包含阳离子表面活性剂二甲基双十八铵溴化物作为佐剂时是有效的。其同样描述了在鼠模型观啶中，使用不含有戶舰佐剂的匀浆的结核分枝杆菌并不会产對结核的抗性水平。I.M.OrmeVaccine,2006，24,2-19页(其为关于抗结核新疫苗的近期综述文章)，描述了常规的BCG疫苗在if[^人结核中基本上是无效的。在同一篇文章中还说明，对接受不同类型疫苗(蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒组合疫苗、重组株疫節的若干个候选行了领l賦，并且预期了新的发展。因此，需要一种预防性疫苗来预防由结核分枝杆菌弓胞的感染，其比基于减毒BCG株的当前疫苗更为有效。发明目的本发明的目的是包含MTB"C毒力胞壁片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗由结核分枝杆菌弓l起的感染的药物中的用途。发明详述专利申请ES2231037-A1公开了一种制备包含结核分枝杆菌复合ll(Mra-C)毒力株的细胞壁片段的免疫治疗剂的方法。其同样公开了含有该治疗剂的组合物以及其用于与其他药物联用治疗结核的治疗应用。本发明人发现了戶腿免疫治疗剂在审恪预防性治疗结核的药物中的用途。因此，本发明的目的在于包含结核分枝杆菌复合^(MTB-C)毒力糊鹏片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗结核的药物中的用途，其中戶脱治疗剂舰包含下述步骤的方法获得-培养MTB"C毒力株等于或大于3周，随后-在非离子表面活性剂的雜下匀魏胞歸物。戶，毒力株可以是MTB"C的樹可毒力株。本领域研究人员最常用的毒力fe—被称为H"Rv，其可以在国家标准菌^(NationalCollectionofTypeCulture)(NCTC)，伦敦，英国免费获#(皿号NC007416)o戶;M毒力株可以在本领域公知的培养基中接种培养，例如Mddlebraok7H10或7H11琼月旨，Sauton培养基或Proskauer-Beck線基。在等于或大于3周的期间JW毒力株，包含3周至4周。培养的，维持在34"38。C之间。一旦培养结束，采用诸如专利申请ES2231037-A1中描述的技术分离细胞。活细胞的匀浆在非离面活性剂存在下，,在中性pH(例如在pH6-8之间)缓冲介质中进行，例如由PBS缓冲銜磷離缓冲銜麟。可以通M声处理的方法进行匀浆，或Mii约lmm直径的小爽例如zm化誠二氧化锆/二氧化硅珠)和机械匀桨器的方法进行。可采用的机械匀浆器例如为BioSpecBeadBeate漲型。通过该匀浆方法裂解MTB-C⑧细胞，获得细胞壁小片段。该匀浆方法中4顿的非离子表面活性剂tt^自縫酚乙氧掛七物、山梨聚糖酯乙氧基化物及其混合物。更雌的，所述非离子表面活性剂选自雜酚乙tt化物。更雌的，舰包含7-8摩尔的环氧乙烷成分的辛基酚乙氧^f七物，该表面活性剂可以TritonX-l14⑧的名称在市场上找到。在匀浆步骤中，所述非离子表面活性齐啲含量雌占匀浆物总重量的1%-10%M，更雌在3%-6%重量之间。舰常规处理分离含有细^段的匀浆物，并弃去非片段飾胞和可溶的成分。例如可应用如专利申请ES2231037-A1中描述的在不同速度下的离心和缓冲溶液的洗涤。所職化步骤后，获得含有细胞壁片段的沉淀物。将戶腿沉淀物分散于PBS缓冲液中，进行常规处理保证在片段化和纯化步骤后还可能保持活性的MTB-C细胞的完全失活。所述的处理可以是化学方法，例如用甲醛处理，或物理方法，例如ilii高压灭菌或巴斯德灭菌处理的施。可以冻干灭活处理后在PBS缓冲液中的细M片段的分散齐似利于存储。最后戶腿分散剂可分輕小瓶中，在-15至-25'C之间冻干，真SS为0.1-0.5mbar。冻干步骤后获得的小瓶含有包含MTB-C细片段的免疫治疗剂，其通常储存在很低的鹏下，例如-7(TC。如前所述，本发明的目的是包含MIB-C毒力片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗结核的药物中的用途，艮P，在制滅结核疫苗中的用途。该预防性治疗结核的药物包含基于细胞壁片段的免疫治疗剂以及任选的可药用稀释剂、佐剂和/^W剂。臓药物可以是磷酸缓冲忠K、7jC溶液、乳剂劍旨质体的形式。该药物雌为脂质体的形式。可采用常规辅助脂质和本领域技术人员公知的狱，例如在专利申请ES2231037-A1中公开的另卩些，来形^B^脂质体。该脂质体通常包括带中性和/或阴性净电荷的磷脂，以及甾醇类。所4顿的糊旨可以是，例如磷脂醐旦碱、磷脂,氨酸和磷脂鹏醇。戶m脂质体的主要成分通常为磷脂miM碱，其可以合成m天然来源分离。常用的商业产品^u^衍生的卵磷脂，其为包括磷脂翻旦碱在内的a^的磷脂混合物。用于制备脂质体的甾醇类可以是胆固醇和胆盐。戶腿脂质体im^大豆衍生的卵磷脂和胆酸钠的混合物形成。劍旨质体任选的含有改善其稳定性的添加剂，例如维生素E，其作为脂质抗氧化剂起作用。获得柳旨质体通常具有这样的大小分布99.9%小于1。所述脂质体可进行冻干，以获得冻干脂质体形式的免疫治疗剂。该药物可以作为单剂或多剂的形式以一定的时间间隔重复施用，优选的两次给药间隔2-5周，优选间隔34周。该药物可以经粘膜给药，例如，经眼、鼻内、口腔、胃、肠道、阴it^t粘膜，或胃肠外给药，例如经皮下、皮内、肌内、静S;WM内。优选胃肠外给药。合适的剂量于^个参数，包括给药的方法和所治疗的，，但的剂量是1pg至1000pg之间，更优选为25-700昭，更优选为50-200呢。戶，包含MTB-C毒力胞壁片段的药物可与其它结核的预防'|苗1^施用，例如在S.H.E.Kaufinann^NatureRev.Immunol.2006，6，699-704中蹈lj的那些，例如诸如BCG疫苗、亚单位疫苗或重组BCG疫苗。戶，疫苗的组合可同时施用，或间隔一定的时间分开接种两次完成。接种之间的时间甚至可以皿数年。在分开接种的情况下，皿首先施用抗结核的预防性疫苗，而随后施用作为首次接种疫苗再剌激(增强浏的包含MTB-C毒力糊SK)t段的药物。令人惊讶的发现，施用戶;M包含基于廳-c毒力鄉!Wt段的免疫治疗齐啲药物會,诱导TM型干扰素Y产生针对结核分枝杆菌特异餓原的应答。戶;f^C原包括Ag85B和Ag85A，其为Ag85复合物的--部分，该复合物由在细生物合成中起决定性作用的低肝量蛋白家族《賊并且在细菌培养对数期大M^生。已观察到传统的BCG疫苗不产生针对复合物Ag85抗原的免疫做应答，其可能代表了较低的，能力。同样发现接种戶舰免疫治疗剂后用毒力株H37Rv感染的小,市中的存活菌数目低于对照小鼠组中的存活菌数目，并且戶皿数目与接种常规BCG疫苗的小鼠中的情况相当。以下实施例用于向本领域技术人员提供本发明特定实施方案的详细解释。实施例1免疫治疗剂作为针对结核分枝杆菌引起感染的预防性疫苗的效果。本例中使用的免疫治疗剂按照专利申请ES2231037-Al中实施例2描述的方法制备。所述基于MTB-C毒力株细鹏片段的免疫治疗齐啲媒在6-8周龄且赚定病原体的C57BL/6型睢性小鼠中进行测定。小鼠被分成3组，每组12只，按下述接种方案进行1)无接种(对照组)，2)在微的第3周和第6周皮下接种两剂的专利申请ES2231037-A1实施例2中获得的285Mg免疫治疗剂，3)在1^第0周时皮下接种2><106形,位的BCG丹麦菌銜Statens血清研究所，丹麦)。使用在Praskauer-Beck培养基中培养至对数中期的结核分枝杆菌的毒力株(H37RvPasteur)感染，将其以lml的等分存储在-7(TC下备用。在试验的第9周将小鼠置于Mddlebrook气雾剂感染仪中用所述毒力株的气雾剂感染，其在小鼠肺中微了约10-50存活菌的接种物。在动物被气雾剂感染后3周(微的第12周)后，聊市匀浆的系列稀释液在Middlebrook7H11琼脂中于37'C下培养4周，测定肺中的存活菌数。肺在lml双蒸7乂存在下匀浆。表I的结果,御市中鉴定的每，^^形成单位(CFU)的对数表I小鼠组疫苗Log10CFU/ml1无(对照组)6,42±0242月旨质体包裹的免疫治疗剂5.72±0.303BCG5.71±0.58未接种小鼠组和接种组结^L间的差异是统计学显著性的。可以观察到，在接种脂质体包裹的免疫治疗剂的小鼠组中，检测至啲肺部存活菌劍氐于未接种小鼠中的情况，与接种常规BCG疫苗的小鼠中的数目基料目同。因此，接种基于MTB-C毒力鄉胞断段的免疫治疗剂实现了对由结核分枝杆菌弓I起的感染的保护作用。实施例2免疫治疗剂产生针对结核分枝杆菌引起感染的特异性Thl应答的有效性本实施例中^ffi的免疫治疗剂按照专利申请ES2231037-Al中实施例2描述的方法制备。所述基于MTB"C毒力株细胞壁片段的免疫治疗剂的有效性在6-8周龄且，定病原体的C57BL/6型雌性小鼠中进行体外i微测定。小鼠被分成4只一组，按下述接种方^S行1)在试验的第3周和第6周皮下接种盐水(对照组)，2)在试验的第3周和第6周皮下接种两齐抟利申请ES2231037-A1实施例2中获得的285Mg免疫治疗剂，3)在微第0周时皮下接种2xl()6離形鹏位的BCG丹麦菌銜Statens血清研究所，艘)，在微的第3和第6周接种舫乂。4)在试验第3周时皮下接种2xl06菌落形成单位的结核分枝杆菌的毒力株(H37RvPasteur)，在微的第6周接种lbJC。小鼠在第7周处死，取其脾脏，浸泡在含有5mlL-谷氨i^-RPMl(Gibco)的试管中。试管保留在冰中直至微结束。机械裂解脾脏，用直径70拜的尼龙筛过滤悬浮液，随后在300g下离心10併巾。沉淀物用15mlTris和氯化铵的双蒸水溶液重构，对细Kffi豫解。8射中后用20mlL-谷氨Sfcfl安-RPM1洗涤，在300g下离心10分钟。将获得的沉淀再悬浮于5mlL-谷氨St^-RPMl中，悬細直径70拜的尼龙筛过滤。用Neubauerchamber计数细胞。将来自小鼠脾脏的细胞以lxl()5细胸孔的比例接种于培养皿中，用200m1由补充有灭活的胎牛血清、舰西林、鶴素、丙酮,和2-巯基乙醇的L谷胺E^-RPMI纟賊的完全培养與CCM)或200Ml补充结核分枝杆菌，(10ng/ml的抗原PPDXstatens血清研究所，iW)和5ng/ml的ESAT-6、Ag85A和Ag85B(LionexDiagnosticsandTTier^euticsGmbH,德意志联邦共和国)的完全培养萄CCM)蹄。这些细胞在37。C下于5^的c02气氛中孵育。％小时后，培养皿在300g下离心10颁，麟它们每一个的上清液。冷冻上清液，^EB^状态保留至少24小时后，用双夹心ELISA技术采用对鼠干扰素y特异性的单克隆抗^iaclone)分析干扰素Y成分。表n显示了以1og,op^ml表示的平均千扰素Y浓度，M每一组小鼠中针对结核分枝杆菌抗原而被诱导。表n<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)组2和组3之间的统计学显著差异(2)组2和组4之间的统计学显著差异(3)组3和组4之间的统计学显著差异表n的结果显示，細基于结核分枝杆菌毒力胸胞壁片段的脂质体爐的免疫治疗剂接种2次會^诱导产生针对结核分枝杆菌特异'鹏原的干扰素Y。这表示其诱导了Thl型保护'腿答。特别的，由接种针对抗原PPD、Ag85B和Ag85A的脂质体爐的免疫治疗剂的小鼠组诱导的应答与接种结核分枝杆菌H37RV毒力株的小鼠组的应答之间没有显著差异。戶腿应答比接种BCG菌銜常规疫節的小鼠组反应更好，因为后者仅诱导针对PPD而不针对Ag85B和Ag85A的应答。只有接种戶皿毒力株的小鼠组能诱导针)m原ESAr-6的应答。因此，基于结核分枝杆菌毒力胸鹏片段的免疫治疗剂能诱导针对结核分枝杆菌特异性抗原的Thl型^^'腿答，表明其可有效用于预防由结核分枝杆菌弓胞的感染。权利要求1、包含结核分枝杆菌复合群(MTB-C)毒力株细胞壁片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗结核的药物中的用途，其中所述治疗剂通过包含以下步骤的方法获得一培养所述MTB-C毒力株等于或大于3周的时间，以及随后一在非离子表面活性剂的存在下匀浆该细胞培养物。2、权利要求1的用途，其特征在于培养时间在34周之间。3、权利要求1或2的用途，辦征在于臓非离子表面活性剂选自'^S酚乙竊化物、山梨聚糖酯乙氧,物及其混合物。4、权利要求3的用途，辦征在于戶腿非离豫面活性剂选自雜酚乙氧靴物。5、权利要求4的用途，赚征在于戶腿非离子表面活性剂选自含有7-8摩尔环氧乙烷成分的酚乙氧,物。6、权利要求1-5任一戶;M的用途，，征在^3桨在中性pH值的缓冲介质中进行。7、权利要求1-6任一戶脱的用途，其特征在于戶雄方法进一步包括下列步骤—i!31离心分离未片段化的细胞和溶解的成分，—对细鹏片段级鄉行化学或物理处理，灭活最终含有的最终毒力胸胞，以及一Mil冻干的方^B喿获得的免疫治疗剂。8、权利要求l-7任一戶腿的用途，其特征在于戶腿药物为脂质体的形式。9、权利要求1-8任一戶腐的用途，其特征在于以单剂或多齐啲形用戶腿药物。10、权利要求9的用途，^T征在于以双剂的形式施用戶舰药物。11、权利要求10的用途，其特征在于戶腿的双剂以2-5周的间隔絲施用。12、权利要求1-11任一戶腿的用途,嫌征在于与其它抗结核的预防性疫苗齢施用舰药物。13、权利要求12的用途，其特征在于戶腿疫苗在时间上分开的两次接种中齢施用。14、权利要求13的用途，其特征在于首先鹏抗结核的预防性疫苗，随后施用包含MTB-C毒力胞壁片段的药物。全文摘要本发明涉及含结核分枝杆菌复合群(MTB-C)毒力株细胞壁片段的免疫治疗剂在制备预防性治疗结核的药物中的用途，其中所述试剂通过包含以下步骤的方法获得培养所述MTB-C毒力株等于或大于3周，以及随后在非离子表面活性剂的存在下匀浆该细胞培养物。文档编号A61K39/04GK101600455SQ200780040568公开日2009年12月9日申请日期2007年10月17日优先权日2006年10月30日发明者I·阿马特列拉,P·J·卡多纳伊格莱西亚斯申请人:阿尔西维尔法尔玛公司