专利名称：防治鱼类水霉病的中草药复方制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治水生动物疾病的药物，尤其是防治鱼类真菌性疾病的药物。
背景技术：
鱼类细菌性和真菌性疾病是我国水产养殖中危害最大的两类鱼病，据统计，北京地区近年来真菌性、细菌性疾病发病率占全年总发病率的65%，直接造成经济损失2000多万元。由于这两类疾病发病广危害大，而目前国内外针对细菌性、真菌性鱼病并发症的有效药物不多，多年来一直采用孔雀石绿等化学药物进行治疗。特别是孔雀石绿，因其价格低廉，具有杀菌等作用，曾广泛用于水产动物的真菌、细菌性(往往出现真菌性疾病并发症) 等疾病的防治。孔雀石绿是一种合成的三苯甲烷类工业染料，自1933年证实孔雀石绿具有抗菌、 杀虫等药效以来，许多国家曾将其广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌等，是药用染料中抗菌效力较强的一类。从1990年代开始，国内外学者陆续研究发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时间长，被确证具有致癌、致畸、致突变等毒副作用。鉴于此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，但由于孔雀石绿抗菌效果好、价格低廉、对其毒副作用的宣传力度不够等原因，在水产养殖中仍有违规使用的情况。2005年6月5日在英国超市出售的鲑鱼体内检出孔雀石绿后，许多国家和地区也相继在水生动物中发现其残留，并迅速做出反应， 孔雀石绿成为继“苏丹红1号”之后食品安全的又一热点问题。因此研究代替孔雀石绿防治水生动物疾病效果的药物迫在眉睫。目前市场上的硫脒杀星和霉病力克虽然对真菌病有一定的疗效，但都不太理想。 因此，研发可代替孔雀石绿的药物势在必行。中草药取自天然的动植物，资源丰富，价格低廉，加工简易方便，无毒无副作用，被作为“绿色渔药”日益广泛地应用在水生动物病害防治上，发展前景广阔。

发明内容
本发明鉴于当前鱼类水霉病防治中化学药物所带来的不良影响，提供一种具有 “绿色药品”的中草药配方制剂，其成分质量比为黄芩22-28%、苦参 22-28%、麻黄 22-28%、辣蓼 22-28%。本发明中采用的中草药均具有杀虫、抑菌、消炎和清热解毒等作用，常用于真菌性疾病的防治。本发明采用将各中草药混合，粉碎，过80目筛网，制成粉剂。使用方法，制成药饵或煎煮后泼洒。用量可以将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2%添加，建议采用1-1. 5%添加， 因为这样成本低且效果不会明显下降；或按照浓度为1. 5-2ppm，计算好制剂重量，加3倍水煎煮，在水开后再煎煮20分钟后，将药液和药渣混合物直接泼洒到水体中，这样成本低且有较好的防治效果。其中2ppm即药剂与水体质量比为2 1000000(百万分之二)。本发明与化学药物相比，具有下列优点一是无毒，使用后无毒副作用；二是由于中草药抗菌作用的协同性和广谱性，所以不会对病菌产生抗药性。
具体实施例方式急性毒力试验取150g的该制剂用蒸馏水浸泡4h，用大火烧开后用中火煎20min，过滤药液后，再煎第二剂，两剂合并经灭菌200目筛绢过滤除去药渣，用三角锥瓶浓缩成100ml，制成浓度为1. 5g/ml的药液。于灭菌的容器内4°C保存备用。试验鱼选用体质健康，没有疾病体重为75士5g的锦鲤，每组10尾，共260尾鱼。试验鱼暂养7天，无死亡出现。在120L的水族箱内注入81L水，曝气48h，试验在20°C恒温下进行。于背鳍基部注射，注射深度为0.2cm左右。在注射后的4d内停食，停气，停水。观察记录24h、48h、72h、96h鱼的死亡情况。制剂设0. 5mlUmlU. 5ml、2ml四个浓度梯度，外加一个注射灭菌生理盐水作为对照组，同时设平行组。试验结果取重复组的平均值，试验组出现死亡时死亡率根据Abbott公式修正P = (Pl-C)/(I-C)试验结果表明制剂的安全浓度为0. 13g/L，即130ppm。制剂浸泡对鲫鱼非特异免疫力的影响1)实验设计将实验鱼分成五个组，正式实验时，将制剂按质量分数加入饲料，配制成0 (对照组)、0.5% (A组)、1.0% (B组)、2.0% (C组)。实验期间的进行虹吸、投饲等管理，在试验进行的第3、7、14、21、28d采血进行非特异性免疫指标的测定，采血方式为鱼尾静脉采血。2)测定指标和方法分别于实验后第3、7、14、21、^d各取样一次，每次每组随机取鲫5条，先用MS-222 快速麻醉，然后用注射器于尾静脉处采血。将每尾鱼的血液分为2份，1份加肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性和NBT阳性细胞检测；1份置于室温下，待凝血后分离血清，供测定血清杀菌、溶菌酶活性测定，同时解剖取脾脏并称重。血清溶菌酶活性溶菌酶活性的测定采取Parry等的方法。用0. 067mol/L PBS(pH = 6. 4)将溶壁微球菌配成0. 2mg/mL的菌悬液，每个样品取3mL菌悬液，吸取40 μ L血清加入到3mL菌悬液中，混合后立即在540nm下测定AO值，然后在水浴中温浴30min，取出后置于4°C水浴终止反应，再测定A值，按U = (AO-A) /A计算溶菌酶活力。血清杀菌活性参照Ainsworth等方法。利用计数板，将嗜水气单胞菌用生理盐水配制成IO6Cfu/ mL的菌悬液。将50 μ L血清加入到等量菌悬液中，22°C孵育证之后，将混合液倍比稀释，不同稀释度各取10 μ L加于平板培养基上，孵育过夜，计数平板菌落数。用50 μ L生理盐水代替50 μ L血清加入等量菌悬液作为阳性对照。结果用杀菌百分率表示。杀菌百分率(<%) = (!-试验组CFU/对照组CFU) X 100%
NBT阳性细胞检测主要根据修改后的Anderson的方法进行。取50 μ L血细胞滴于盖玻片上，于温和中培养30min后，在0.067mol/L PBS (pH = 6. 4)中轻轻洗涤盖玻片以完全去除红细胞，然后在载玻片上滴50 μ L0. 2g/L NBT溶液，将盖玻片反扣在NBT溶液上，于温盒中温育30min， 直接于40 X 10的显微镜下观察结果，计数100各细胞，记录阳性细胞数，呈棕黑色者为阳性细胞，并计算出阳性细胞比率。血液白细胞吞噬活性参照Chen等的方法，在0. 5mL抗凝血中加入0. 2mL金黄色葡萄球菌液液(含菌量为3. OX 109Cfu/mL)，置于25°C培养箱中培养lh，3000r/min离心15min，取沉淀底层物抹片，甲醇固定，姬姆萨氏染液染色，镜检，计数并计算白细胞的吞噬活性。白细胞吞噬百分比(PP)=吞噬葡萄球菌的白细胞数/白细胞总数X 100%脾脏质量指数每次采血后取试验鱼的脾脏，测定其脏器系数。先用吸水纸吸干鱼体表的液体，称量试验鱼体重，再摘取脾脏，用吸水纸吸干表面液体，立即在电子秤上称重。脾脏重量与体重之比即为脾脏质量指数。血清皮质醇浓度采用放射免疫法(RIA)，用试剂盒测定。试剂盒购自北京北方生物技术研究所。实验数据处理采用了SPSS 13. 0 和 EXCEL 2007 软件。3)试验结果血清溶菌酶活性实验开始后第3d，实验组的血清溶菌酶活性显著高于对照组(P < 0. 05)，而实验组间转移不显著(P >0.05)，在第7d，各实验组间差异显著(P <0.05)，随着时间的推移，对照组血清溶菌酶活性维持在稳定水平，实验组均有不同程度的上升，其中C组上升最明显，B组次之，A组最小。整个实验期间，实验组的血清溶菌酶活性显著高于对照组(P
<0. 05)。血清杀菌活性实验的第3d，实验组的血清杀菌活性均高于对照组，只有C组显著高于对照组 (P <0.05)，各实验组间差异不显著(P >0.05)；在第7d，各实验组显著高于对照组(P
<0. 05)，C组显著高于A组(P < 0. 05)而与B组差异不显著(P > 0. 05)，A组与B组差异不显著(P > 0. 05)第14d差异显著性与第7d相同。NBT阳性细胞数目整个实验期间，对照组的NBT白细胞数目几乎没有变化，各实验组的NBT阳性细胞数目是显著高于对照组的(P < 0. 05)，并且随着时间推移，各实验组的NBT阳性细胞数目呈上升趋势，浓度越高越明显。在第3d，A组与B组无显著差异(P >0.05)，C组显著高于A 组(P < 0. 05)；在第7d，各实验组间均差异显著(P < 0. 05)；第14d的显著性水平和第7d 相同。白细胞吞噬活性从实验第3d起，实验组的白细胞吞噬活性显著高于对照组(P < 0. 05)，随着实验的推移，对照组白细胞吞噬活性没有明显变化，各实验组白细胞吞噬活性水平在一定时期内事不断上升的，在21d后有所下降。在第3d，各实验组间差异显著(P <0.05)；在第7d， A组与B组差异不显著(P > 0. 05)，C组显著高于A组和B组；第14d显著性水平与第7d 相同。脾脏指数各实验组间无显著性差异。从上可以得出制剂用量可以将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2%添加，更好采用1-1. 5%添加，因为这样成本低且效果不会明显下降。4、中草药配方中各药物质量比为黄芩25%、苦参25%、麻黄25%、辣蓼25%。投加方式直接泼洒到水体中，浓度为2ppm。在北京市通州区选取池塘分别为对照组393亩、预防组400亩、治疗组407亩。 在同一个养殖场分别设置对照组、预防组和治疗组。对照组和预防组分别选在疾病高发季节尚未发病的池塘。治疗组在试验前进行采样，通过肉眼诊断和镜检确定为真菌性水霉病， 且选取发病率在40-60%以上的池塘。试验结果表明，对照池塘在疾病高发季节，平均发病率为45-60%，死亡率为 16-58% ；预防池塘在疾病高发季节，平均发病率为10%，死亡率为0 ；治疗池塘经过两次药物泼洒后，症状基本消失，体表水霉菌消退恢复为正常的体色，治愈率达到86. 5%以上，有效率100%。预防组的发病率和死亡率低于对照组，治疗组则有显著的治疗效果。5、中草药配方中各药物质量比为黄芩22%、苦参22%、麻黄观％、辣蓼观％。投加方式按照泼洒使用方法，经煎煮后直接泼洒到水体中，浓度为2ppm。在北京市顺义区选取精养草鱼池塘分别为对照组100亩、治疗组120亩。在同一个养殖场分别设置对照组和治疗组。对照组选在疾病高发季节尚未发病的池塘。治疗组在试验前进行采样，通过肉眼诊断和镜检确定为真菌性水霉病，且选取发病率在40%以上的池塘。试验结果表明，对照池塘在疾病高发季节，平均发病率为45-55%，死亡率为 18-45% ；治疗池塘经过两次药物泼洒后，症状基本消失，体表水霉菌消退恢复为正常的体色，治愈率达到80%以上，有效率100%。另外本发明应用到多个区都取得了良好治疗效果，产生了很好的经济效益，甚至对水质改善有一定好处。
权利要求
1.一种防治鱼类水霉病的中草药复方制剂，其特征在于由以下中草药配制而成黄芩、苦参、麻黄、辣蓼。
2.根据权利要求1所述防治鱼类水霉病的中草药复方制剂，其中草药各成分含量质量比为黄芩22-28%、苦参22-28%、麻黄22-28%、辣蓼22-28%。
3.根据权利要求1所述防治鱼类水霉病的中草药复方制剂的应用，其特征在于将上述各中草药混合，粉碎，过80目筛网，制成粉剂，然后将制剂混入饲料中或经过煎煮后泼洒到水体中；将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2%添加， 或将制剂经过煎煮泼洒到水体中，泼洒浓度为1. 5-2ppm。
全文摘要
本发明公开了一种防治鱼类水霉病的中草药复方制剂及其应用，其各成分质量比为黄芩22-28％、苦参22-28％、麻黄22-28％、辣蓼22-28％。本发明与化学药物相比，具有下列优点一是无毒，使用后无毒副作用；二是由于中草药抗菌作用的协同性和广谱性，所以不会对病菌产生抗药性。
文档编号A61K36/704GK102283905SQ20111019158
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者何川, 杨华莲, 殷守仁, 沈钦一, 盛竹梅, 贾丽, 黄文 申请人:北京市水产技术推广站