专利名称：防治肝病的鲨鱼肝多肽结构及纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种源于鲨鱼肝脏的防治肝病的多肽结构及其纯化方法，具体的讲，其涉及一种从幼龄鲨鱼的新鲜肝脏中提取的纯肝细胞再生刺激因子结构特征及其纯化方法，可用于治疗乙型肝炎、迁慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎等肝脏疾病。
肝病是威胁人类生命和健康的主要疾病之一。国内外学者一般利用陆地生长的动物肝脏研究和开发治疗肝病的药物。自Lebrecque首先从断乳大鼠的肝脏发现肝细胞再生刺激因子(Hepatic Stimulator Substance，简称HSS)，并经临床证实治疗各类肝病有较好疗效以来，国内外有关HSS的基础和临床工作已开展许多，关于HSS的纯化、理化性质、氨基酸组成、作用机理均有相应报道，但不同研究者纯化的HSS性质有所差异，这可能是由于HSS来源不同，提取方法各异及样品不纯等原因所致。如美国Lebrecque等，从断乳大鼠的肝脏中提取的HSS，因为提取过程中采用了乙醇沉淀方法，使得HSS活性降低，且工艺烦琐、收率低，不宜批量生产，所以至今仍停留在实验室研究阶段(DOUGLA R．LABRECQUE etc，Purification and Physical-Chemical Characterization of HepaticStimulator Substance．Hepatology，Vo1．7，No1，pp．100～106，1987)。
国内已在临床上广泛应用的肝细胞活性物质均是从陆地生长的胎、幼动物肝脏中提取的混合物，成份不明确。如鼠、猪、牛、狗等动物的胎、幼肝分离提取的肝细胞活性物质，纯度都较低，虽然在体内外有专一地刺激肝细胞生长的能力，但实验表明，当剂量加大到一定程度后，其抗肝细胞损伤和促进肝细胞生长的作用反而下降(黄才国、彭敏、魏善健等，人肝细胞生长刺激因子的部分纯化及活性测定，第二军医大学学报1996，4月；17(2)184～186)。粗制品中难免含有一些杂质，其抑制肝细胞生长。CN1096053A公开的“低分子量肝细胞生长素的制备方法”，它采用乳猪肝脏为原料，经匀浆、加热、离心沉淀、降解、纯化、冻干等步骤制备，其特征在于用胰蛋白酶降解，用超滤进行纯化，这种方法虽能得到分子量小于1万的活性多肽，但用超滤仍很难准确控制分子量，而且纯度较低，仍然是混合物。我们在中国专利申请CN1250780A中公开了可防治肝病的鲨鱼肝刺激物质及其提取、纯化方法，其除去了抑制肝细胞生长的杂质，纯度较高，活性也较高。但该鲨鱼肝刺激物质的纯度仍不足以确定其精确分子量及其氨基酸组成和N-端氨基酸序列。
本发明的目的是提供治疗乙型肝炎、迁慢性肝炎、免疫性肝损伤等肝病的纯的鲨鱼肝多肽，确定其准确的物理化学性质及结构特征。
本发明的目的还在于提供纯化鲨肝刺激物质的方法，尤其是柱层析的条件。
为解决上述任务，本发明采用的技术方案是一种防治肝病的多肽，其分子量为16950Da，等电点为5．60，紫外特征吸收峰为276nm。
用液相色谱法测氨基酸组成为(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白质N-端测序仪测其N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
该防治肝病的多肽的纯化方法，包括取鲨鱼肝脏，绞碎，离心，超滤，阴离子交换层析，FPLC Mono Q层析，其特征在于将鲨鱼肝刺激物质采用FPLCMono Q色谱进行纯化，层析柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
该多肽的较好的纯化方法，其特征在于将鲨鱼肝刺激物质采用FPLC Mono Q色谱进行纯化，层析柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
该多肽的较好的纯化方法还有，将鲨鱼肝刺激物质采用FPLC Mono Q色谱进行纯化，层析柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
纯鲨鱼肝多肽的制备方法，实际上包括两部分1、先采用CN1250780A中公开的提取纯化方法，获得较纯的防治肝病的鲨鱼肝刺激物质；2、再用本发明提供的纯化方法，得纯的鲨鱼肝多肽。
具体制备纯鲨鱼肝多肽的方法是首先，取经检疫的幼鲨肝脏，去除肝膜及血液，用蒸馏水洗涤，绞碎后，加入蒸馏水在高速捣碎机中制成匀浆。在90℃～100℃水浴中保持5～10分钟，然后在8000rpm-1下离心20分钟，取上清液，弃沉淀以去除杂蛋白。用截留分子量30KD的中空纤维素膜进行超滤，收集滤出液。然后用DEAE-Sephadex A25阴离子交换柱进行阴离子交换层析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS缓冲液洗涤未结合杂蛋白，用含0～0．3mol／LNaCl的PBS缓冲液洗脱鲨鱼肝刺激物质。
用上述CN1250780A专利方法制备的鲨鱼肝刺激物质，经FPLC的Mono Q柱纯化，流动相A0．01～0．03mol／L pH8．0～8．6的Tris-HCl缓冲液，B含1mol／LNaCl的A液，用A液洗涤未结合蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鲨鱼肝的纯多肽。
将鲨鱼肝刺激物质采用FPLC Mono Q色谱进行纯化时，也可选择层析柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4或pH8．2～8．3的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，25min，B(25％～100％)，10min。
纯化后的鲨鱼肝多肽，用质谱测其分子量为16950Da，等电点为5．60，紫外特征吸收峰为276nm。用液相色谱法测氨基酸组成为(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白质N-端测序仪测其N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
体内药效学试验证明纯化后的鲨鱼肝多肽在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内进行的实验治疗中，能有效抑制鸭乙型肝炎病毒的复制。实验采用一日龄北京鸭，静脉注射鸭乙型肝炎病毒，七天后分组，每组5-6只，鲨鱼肝多肽实验用2．5、5．0和10mg／Kg，3个剂量组，腹腔注射1天2次，给药10天(Bid×10)，并与阿昔洛韦(ACV)比较，100mg／Kg作阳性对照，同时设病毒对照组，以生理盐水代替药物。给药前(T0)，给药后第5天(T5)和10天(T10)及停药后3天(P3)取血，分离血清，同时进行斑点杂交，测定鸭血清DHBV-DNA的OD值。计算血清DHBV-DNA抑制率，观察药效。(见表1，表2)结果表明纯鲨鱼肝多肽治疗组能显著降低鸭血清中DHBV-DNA水平。
在对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的治疗作用实验中，用大鼠72只，除正常对照组外，其余大鼠每周sc25％CCl4花生油溶液2．0ml／kg，连续三个月。造型8周时，眼眶取血，分离血清，测定血清ALT、AST的含量，按血清ALT含量，将大鼠随机分组(见表3)，按表中剂量给药，每天一次。结果表明纯鲨鱼肝多肽用药8周，对四氯化碳引起的肝损伤大鼠血清中AST活性的升高、羟脯氨酸含量的升高均有抑制作用，能增加白蛋白含量，降低球蛋白含量，使白／球比有一定的升高。说明鲨肝肽对肝细胞生成胶原纤维的变化有一定抑制，有减轻肝脏纤维化的作用，即对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤有一定的治疗作用。(见表3)(实验方法参见《现代药理实验方法学》，张均田，北大协和联合出版社，1998。)鲨鱼肝多肽在小鼠免疫性肝损伤模型中对肝损伤具有改善作用的实验。用健康小鼠随机分组(具体见表4)(实验方法参见《中药新药与临床药理》1999，9(1)30，清肝冲剂对免疫性肝炎模型小鼠的保护作用及免疫调节作用，林培英，张丹，肖柳英等)。除正常对照组外，其余各组小鼠均予以静脉注射卡介苗1mg／只，次日起环磷酰胺组小鼠以30mg／kg剂量隔天腹腔注射给药，其它给药组于免疫第8天开始腹腔给药，每天一次，连续三天，正常对照和模型对照给予相应体积的生理盐水。至免疫第10天，给药1小时后，除正常对照组外，其余各组均静脉注射内毒素10g／只，攻击后6小时，小鼠眼眶静脉丛取血，分别测AST和ALT。结果表明鲨鱼肝多肽能减轻免疫反应介导的肝细胞损害。
本发明的多肽可以与药物载体组合，或与有生理活性的其它药物成份组合，制成治疗乙型肝炎、迁慢性肝炎、免疫性肝损伤等肝病的药物组合物。这种药物组合物可以通过常用技术配制，载体的形式可以根据所选择的施用途径而变化，常用施用途径有口服、静脉注射、肌肉注射等。表1鲨鱼肝多肽治疗组与病毒感染前鸭血清DHBV-DNA OD值比较表表2鲨鱼肝多肽治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较表表3鲨鱼肝多肽对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的治疗作用(X±S)表表4鲨鱼肝多肽对小鼠免疫性肝损伤的保护作用(x±s)表实例一取经检疫的幼鲨肝脏，去除肝膜及血液，用蒸馏水洗涤，绞碎后，加入蒸馏水在高速捣碎机中制成匀浆。在90℃～100℃水浴中保持5～10分钟，然后在8000rpm-1下离心20分钟，取上清液，弃沉淀以去除杂蛋白。用截留分子量30KD的中空纤维素膜进行超滤，收集滤出液。然后用DEAE-Sephadex A25阴离子交换柱进行阴离子交换层析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS缓冲液洗涤未结合杂蛋白，用含0～0．3mol／L NaCl的PBS缓冲液洗脱鲨鱼肝刺激物质。
取5mg的鲨鱼肝刺激物质，溶于5ml的0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl缓冲液中，经FPLC的Mono Q 1ml柱，层柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl缓冲液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鲨肝纯多肽0．5mg。
纯化后的鲨鱼肝多肽，用质谱测其分子量为16950Da，等电点为5．60，紫外特征吸收峰为276nm。用液相色谱法测氨基酸组成为(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白质N-端测序仪测其N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
药效学见表1～表4。实例二取6mg的鲨鱼肝刺激物质(见专利CN1250780A)，溶于6ml的0．02mol／LpH8．6的Tris-HCl缓冲液中，经FPLC的Mono Q 1ml，层柱温度25℃，流速2ml／min，流动相A0．02mol／L pH8．6的Tris-HCl缓冲液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)5min，B(7％～25％)20min，B(25％～100％)10min，即可得到鲨鱼肝的纯多肽0．60mg。纯化后的鲨鱼肝多肽，用质谱测其分子量为16950Da，等电点为5．60，紫外特征吸收峰为276nm。用液相色谱法测氨基酸组成为(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白质N-端测序仪测其N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
药效学见表1～表4。表1鲨鱼肝多肽治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA OD值比较
*P＜0．05，**P＜0．01表2鲨鱼肝多肽治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较
*P＜0．05，**P＜0．01表3、鲨鱼肝多肽对CCl4致大鼠慢性肝损伤的治疗作用(±SD)
与模型对照相比，*p＞0.05，**p＜0.05表4 鲨鱼肝多肽对小鼠免疫性肝损伤的保护作用( X±S)
与模型对照组相比，*P＜0．05，**P＜0．0权利要求
1．一种防治肝病的多肽，其特征在于其分子量为16950Da，等电点为5．60，紫外特征吸收峰为276nm。
2．根据权利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于氨基酸组成为(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
3．根据权利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
4．一种防治肝病的多肽的纯化方法，包括取鲨鱼肝脏，绞碎，离心，超滤，阴离子交换层析，FPLC Mono Q层析其特征在于将鲨鱼肝刺激物质采用FPLCMono Q色谱进行纯化时，流动相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
5．根据权利要求4所述防治肝病多肽的纯化方法，其特征在于将鲨鱼肝刺激物质采用FPLC Mono Q色谱进行纯化，流动相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
6．根据权利要求5所述防治肝病多肽的纯化方法，其特征在于将鲨鱼肝刺激物质采用FPLC Mono Q色谱进行纯化，流动相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl缓冲液，B为含1mol／L NaCl的A液，用A液洗涤未结合的杂蛋白，多肽的洗脱梯度为B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
7．根据权利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可治疗乙型肝炎、迁慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎。
8．根据权利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可与药物载体组合制成药物组合物。
9．根据权利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可与其它药物活性成份组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种源于鲨鱼肝脏的刺激肝细胞再生的纯的多肽的氨基酸组成和N－端氨基酸序列及其纯化方法,其精确分子量为16950Da,等电点为5.60,紫外特征吸收峰为276nm,该多肽能治疗鸭乙型肝炎病毒感染、减轻四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤、缓解纤维化、保护小鼠免疫性损伤肝脏,其药物组合物可作为治疗乙型肝炎、迁慢性肝炎、肝硬化等严重肝病的有效药物。
文档编号A61K38/10GK1294134SQ0011906
公开日2001年5月9日 申请日期2000年10月24日 优先权日2000年10月24日
发明者吴梧桐, 郭昱, 吴文俊 申请人:中国药科大学