专利名称：绿原酸在制备增加骨髓细胞功效药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及绿原酸的新用途，具体来说是绿原酸在制备具有升高白细胞和增加骨髓细胞功效药物的用途。
背景技术：
绿原酸广泛存在于各种药用植物如金银花等中，目前对它的化学结构研究已经清楚，已有人对其进行药用研究，报道了绿原酸可以应用于治疗肿瘤等疾病。尽管如此，我们通过药理实验又进一步发现它还具有许多其他新的医疗功效，而这些新的医疗功效在现有文献中还从来没有报导过。

发明内容
本发明的一个目的是提供绿原酸在制备具有增加骨髓细胞功效药物的用途。
本发明的又一个目的是提供绿原酸在制备具有升高白细胞功效药物的用途。
经过实验，发现绿原酸可升高白细胞；可刺激犬骨髓细胞增生，包括对骨髓干细胞的增加作用，并且绿原酸对60Co-γ射线致小鼠脾脏造血干细胞损伤有显著地保护作用。
机体的造血过程是一个活跃的细胞增殖、分化、成熟与释放的过程。它是由多潜能造血干细胞的自我更新维持其数量的恒定，并由多潜能造血干细胞到各系定向祖细胞，再进一步增殖、分化、释放到外周血循环。药物可通过影响造血干细胞、祖细胞的增殖分化等多种环节影响造血过程。因此，造血祖细胞体外培养技术的建立为我们探讨药物的作用提供了手段和方法。
SAM小鼠是由日本学者竹田俊男教授开发培殖的一种快速老化模型小白鼠，其特征是随月龄增加自然出现老化诸特征，这些特征包括外在表现和病理、生化、免疫诸方面。其中SAM P8亚系小鼠又是以学习记忆障碍并伴有免疫功能降低为主要特征的老化模型，其造血功能也随月龄增加出现低下状态，因此我们选用9月龄的SAM P8小鼠为实验模型并以同月龄的SAM R1为对照探讨了绿原酸对其造血功能的影响。研究结果显示SAM P8小鼠CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E的增殖分化能力和外周血WBC数明显低于同月龄的SAMR1小鼠。而绿原酸可使SAM P8小鼠降低的CFU-S数明显增加，说明绿原酸可刺激造血干细胞的增殖，同时绿原酸可明显促进SAM P8小鼠骨髓粒单系祖细胞，早期、晚期红系祖细胞的增殖分化，并可使其外周血WBC数升高，提示绿原酸可影响小鼠造血的整个过程。因此我们有理由推测绿原酸可能调节机体内造血调控系统。小鼠血清集落刺激活力的测定结果说明绿原酸可通过促进小鼠机体产生集落刺激因子来增强其祖细胞的增殖分化。组织学的研究结果则进一步证实了绿原酸确能增强SAM P8小鼠的造血功能。
由此，绿原酸可治疗各种原因引起的贫血，如但不仅仅限于失血性贫血、溶血性贫血，造血不良性贫血包括巨细胞性贫血、再生障碍性贫血和脾功能亢进，对各种原因引起的白细胞减少状态、粒细胞减少症、粒细胞缺乏症有治疗作用，对各种原因引起的巨核系统改变如但不仅仅限于特发性血小板减少性紫癜有治疗作用；对各种原因引起的骨髓纤维化，骨髓感染有一定治疗作用。
基于上述发现，绿原酸可以单独或与其他具有已知功效的药物一起采用各种制药技术制备成各种药用剂型如但不仅仅限于口服剂型、静脉给药剂型和外用剂型。
另外，本发明所述的“其他具有已知功效的药物”是指现有技术中已经报道的具有升高白细胞功效的药物和增加骨髓细胞功效的药物。
以下通过实验对绿原酸所具有的上述功效加以证实。应该理解的是，本发明的实验例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实验例1绿原酸对外周血象的影响用环磷酰胺将犬制成白细胞减少的犬模型。
将绿原酸对犬给药治疗7天，阳性药(甘露聚糖肽)组和绿原酸各剂量组的白细胞WBC均升高，其中给药第13天和14天大、中剂量组中白细胞WBC的增长率与模型组有显著性差异(P＜0.05)。见表1，绿原酸对犬白细胞的影响。表2，绿原酸对犬血小板的影响。
表1 绿原酸对犬白细胞的影响

与正常对照组比较**P＜0.001与模型对照组比较△P＜0.05△△P＜0.01表2 绿原酸对犬血小板的影响

与模型对照组比较△P＜0.05
实验例2对病理模型动物骨髓的影响结果见表3、4、5。
表3 实验前正常骨髓细胞检查(％，X±SD)

各组犬给药前正常骨髓象显微镜下观察，各犬骨髓细胞增生活跃，未见异常。
中性粒细胞杆状为主，占全片总数45～50％，其次为中幼、晚幼、分叶细胞。偶见嗜酸粒细胞，未见原始、早幼粒细胞。未见中幼和晚幼粒细胞。红细胞系统以晚幼红细胞为主，约占全片计数25～30％左右，其次为中幼红细胞，全片镜下未见原红、早幼红、早巨、中巨、晚巨红细胞。淋巴系统以成熟淋巴细胞为主(约占9～12％)，未见原始和幼稚淋巴细胞。单核系统各组各犬未见有原始、幼稚、单核细胞。巨核细胞以成熟有血小板形成为主，成熟无血小板形成次之，未见幼稚巨核细胞。其它细胞未见浆细胞，未见网状、内皮、吞噬、寄生虫、组织巨细胞、不明细胞以及特殊细胞。粒细胞系统与红细胞系统之比各组间比较均无统计学差异(P＞0.05)。
表4 造模6天骨髓细胞检查(％，X±SD)


造模第7天36只犬骨髓增生低下，非造血细胞淋巴细胞增多，粒系细胞，红系细胞，巨核细胞总数减少，未见成熟有血小板形成和成熟无血小板形成。
表5 治疗14天骨髓细胞检查(％，X±SD)


治疗第14天，除模型组2只犬，小剂量组2只犬骨髓增生低下，非造血细胞淋巴细胞增多，粒系细胞，红细胞系统减少，骨髓增生未能恢复，其余各犬骨髓细胞增生活跃，已恢复正常。
实验例3对正常骨髓细胞的影响结果见表6、7、8。
表6 给药90天骨髓细胞检查(％，X±SD)


给药90天8只犬，显微镜下观察，各犬骨髓细胞增生活跃和极度活跃。
表7 给药180天骨髓细胞检查(％，X±SD)



给药180天8只犬，显微镜下观察，各犬骨髓细胞增生活跃和极度活跃。
表8 给药270天骨髓细胞检查(％，X±SD)


给药270天16只犬，显微镜下观察，各犬骨髓细胞增生活跃和极度活跃。
实验例4绿原酸对60Co-γ射线致小鼠脾脏造血干细胞损伤的保护作用1.、实验方法取健康C57小鼠60只，依性别体重随机分成5组。按分组分别给药，阴性组各鼠腹腔注射生理盐水0.4ml/20g体重，阳性组(粒细胞集落刺激因子)各鼠腹腔注射给予0.4ml/20g体重(2ug/kg)，其余三组分别以0.1％、0.05％和0.025％的绿原酸药液给各组各鼠腹腔注射0.4ml/20g体重(剂量20、10和5mg/kg)。以上5组各鼠均每日给药一次，连续7日，第7日称存活动物体重，末次给药后1小时。各组小鼠全身一次照射后第9天颈椎脱臼处死，取出脾脏，除去粘连的脂肪，然后置于Bouins液中固定3min，用放大镜观察并进行内源性脾结节计数(CFU-S)，骨髓单个核细胞计数(BMNC)。组间比较显著差异。
2、实验结果表9 绿原酸对60Co-γ射线致小鼠脾脏造血干细胞损伤的保护作用

与模型对照组比较***P＜0.001 **P＜0.01 *P＜0.054、结论表9的结果表明，绿原酸20、10和5mg/kg给小鼠腹腔注射，每日一次，连续7日，对60Co-γ射线致小鼠脾脏造血干细胞损伤有较强的保护作用。
实验例5绿原酸小鼠造血功能的影响1实验方法快速老化模型小白鼠(简称SAM)。其中根据老化速度与病状特征又分为正常老化的R系和快速老化的P系。采用9月龄SAMR1和SAMP8两品系。
骨髓细胞(BMC)的制备 将动物断脊处死后，酒精消毒，无菌剥取一侧股骨，用RPMI-1640液通过6号针头反复冲洗骨髓腔数次，再将冲出的骨髓细胞液通过4号针头制备成单细胞悬液。
小鼠骨髓造血干细胞(CFU-S)的测定 活杀小鼠，无菌制备BMC悬液，计数有核细胞后配成每毫升5×104个细胞，给经8.0 Gy60Go照射后小鼠尾静脉输注0.2ml细胞悬液，第9天活杀受体鼠，取脾用Bouin液固定24h后计数表面结节数。
骨髓粒单系祖细胞(CFU-GM)的测定 将定量(1×105)的骨髓细胞悬液加马血清与RPMI-1640培养液在37℃水浴中保温10～20min，加入30g/L琼脂后混匀，转入含有0.2ml鼠肺条件刺激液的琼脂培养皿中，于37℃，0.05％CO2饱和湿度的培养箱中培养5～7天，置低倍镜下计数含50个细胞以上的集落(CFU-GM)数。
骨髓早期、晚期红系祖细胞(BFU-E、CFUE)的测定 将培养体系配成终浓度为10％骨髓细胞悬液(5×104ml)，200g/L马血清，100g/L小牛血清白蛋白，1×10-5mol/L二巯基乙醇、10％爆式集落促进活性(BPA)，0.8％甲基纤维素及每毫升1U EPO等充分混合后，加10μl至微孔塑料培养板中，置培养箱中培养3天，用联苯胺染色后在倒置显微镜下计数8个以上染色阳性细胞集落计为红系集落形成单位(CFU-E)，培养8天计数含50个以上联苯胺染色阳性细胞集落为爆式红系集落形成单位(BFU-E)。
小鼠外周血象的测定 小鼠尾静脉采血，Coulter血细胞计数仪计数。
小鼠骨髓组织学观察 断头活杀小鼠取完整左侧股骨，入Hellyps液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察组织学变化。
2实验结果绿原酸小鼠骨髓造血干细胞的影响将SAM P8小鼠随机分为3组1组为SAM P8对照组，2、3组为绿原酸10，20m g/kg/天×8天，静脉注射。另取同月龄SAMR1与SAMP8对照组，每天给予生理盐水。9天活杀各组小鼠制备BMC悬液，按前述方法输注给受体鼠。9天活杀取脾固定观察结果，结果显示SAM P8小鼠CFU-S数223±107明显低于同月龄的SAMR1小鼠CFU-S 550±189(n＝12，P＜0.01)。而给予绿原酸后SAM P8小鼠CFU-S数明显增多，其CFU-S数分别为483±125和527±183结果提示绿原酸对SAMP8小鼠骨髓造血干细胞的增殖分化有一定刺激作用。
绿原酸对小鼠骨髓造血祖细胞增殖的影响动物分组，给药与前相同，于给药第9天断脊处死小鼠无菌制备BMC悬液按前述方法进行实验。结果表明SAM P8小鼠骨髓造血祖细胞的增殖能力明显低于SAMR1小鼠，二者之间有明显差异。而绿原酸则可使SAM P8小鼠的粒单系造血祖细胞，早期及晚期红系祖细胞的增殖能力均明显增。
绿原酸对小鼠外周血象的影响结果表明SAM P8小鼠外周血象中，其WBC数明显低于同月龄SAMR1小鼠。绿原酸10，20mg/kg则可明显使其WBC数增加。
绿原酸对小鼠血清CSA的影响将各组小鼠分别心脏采血，静止离心制备血清，以血清取代肺条件刺激液(CSF-GM)，观察其对CFU-GM增殖的影响，以CFU-GM的产率代表CSA。结果证明SAMR1小鼠血清的CFU-GM的产率79.6±7.9明显高于SAM P8小鼠CFU-GM 57.3±7.4(n＝12，P＜0.01)。而给予绿原酸后10，20mg/kg SAM P8小鼠的CFU-GM明显增加(CFU-GM分别为74.2±7.2和81.5±8.2)与SAM P8组相比有显著差异，提示绿原酸可明显增强SAM P8小鼠体内的CSA，促进SAM P8小鼠骨髓造血祖细胞的增殖分化。
绿原酸对小鼠骨髓组织学的影响组织学研究结果显示SAM R1小鼠骨髓腔内造血祖细胞丰富，各系细胞均可见到，并且形态良好，增殖旺盛，血窦较多。而同月龄SAMP8小鼠骨髓腔内造血细胞明显减少，增生不活跃，以中晚幼粒细胞为主，甚至局部缺少造血细胞，纤维结缔组织增生，血窦较少。给予绿原酸后的SAM P8小鼠与未用药SAM P8小鼠相比其骨髓腔内造血细胞明显增多，增生活跃，血窦较多，但较SAM R1小鼠骨髓造血细胞及血窦为少。这一结果提示绿原酸可明显改善SAM P8小鼠骨髓造血功能。
权利要求
1.绿原酸单用或与其他药物一起在制备具有增加骨髓细胞功效药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的药物具有增加骨髓干细胞功效。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的药物可治疗各种原因引起的骨髓纤维化和骨髓感染。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的药物可治疗各种原因引起的血小板减少症。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述的药物对脾脏造血干细胞损伤有显著的保护作用。
6.根据权利要求1、5所述的用途，其中所述的药物能够增强造血功能。
7.根据权利要求1、5所述的用途，其中所述的药物可治疗各种原因引起的贫血和脾功能亢进。
8.根据权利要求1、5所述的用途，其中所述的药物可治疗失血性贫血、溶血性贫血、巨细胞性贫血和再生障碍性贫血。
9.绿原酸单用或与其他药物一起在制备升高白细胞功效药物的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中的该药物可治疗各种原因引起的白细胞减少，粒细胞减少症、粒细胞缺乏症。
全文摘要
本发明公开了绿原酸单用或与其他药物一起在制备增加骨髓细胞功效药物的用途。本发明还公开了绿原酸单用或与其他药物一起在制备升高白细胞功效药物的用途。
文档编号A61P7/06GK1899280SQ20051008802
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者张洁, 张舒, 张亮, 李鑫泉, 徐小平, 雍智全, 包旭 申请人:四川九章生物化工科技发展有限公司