专利名称：microRNA-1的反义锁核苷酸序列在制备预防或治疗心肌梗死后心衰药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸类物质在制备预防或治疗疾病药物中的应用，特别涉及 microRNA-1的反义锁核苷酸序列在制备预防或治疗心肌梗死后心衰药物中的应用，本发明属于生物医药领域。
背景技术：
心衰是心肌梗死后发生猝死的重要原因。心脏疾病发病机制错综复杂，每一种发病机制可导致一种或多种疾病的表现形式，而多种疾病的表现形式可能由单一发病机制所导致，这给此类疾病的预防和治疗带来难度。因此目前为止针对单一靶点的药物治疗，尚不能达到让人满意的效果。随着近来microRNAs研究的兴起，这种内源性的非编码小RNAs已经作为一个基因表达调控的关键因子参与许多重要的生理过程。由于单一的microRNA可负向调控多个基因mRNA的表达，使得以关键microRNA为靶点的药物可通过调节多个参与心脏疾病发生的基因的表达，从而给心脏疾病的防治带来新的希望，因此发现不同病理生理情况下起关键调节作用的microRNA亚型变化，并阐明其功能，将会对该疾病的治疗带来新的靶标和产生新的干预策略。已有研究表明microRNA-Ι作为在肌肉中特异表达的微小 RNA，在心肌梗死患者和冠脉结扎的心肌组织中高表达。并证明其通过作用于钾通道蛋白和心肌Cx43参与了心梗后恶性心律失常的发生。也有研究表明microRNA-Ι在胚胎期可以影响心肌细胞的发育和分化。然而，microRNA-Ι是否参与了心梗后心衰的发生和发展过程， 仍未见报道。因此，本发明采用多种技术手段证明microRNA-Ι在心衰发生发展中的作用， 并采用最新的锁核苷技术研究microRNA-Ι对心衰发生和发展的防治作用，最终确定检测外周血液(全血，血浆，血清)microRNA-Ι是否可以作为一种新的生物标志物预测心梗后心衰的发生。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用多种技术手段证明了 microRNA-Ι在心衰发生和发展中的作用，并将其作为一种新型的药物作用靶点，以及生物标志物，应用于预防或治疗由心肌梗死导致的心衰的治疗。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段实现的本发明通过研究发现micr0RNA-l在心梗患者外周血液水平与心脏功能呈负相关，并且发现microRNA-1 (5，-UAUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU-3，)过表达小鼠出现心脏功能的下降。在此基础上，结合具体实验，发现了 microRNA-Ι的反义锁核苷酸LNA-I (LNA 5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，，SEQ ID NO. 1 所示)可以防止心衰的发生。LNA-1 可成为一种预防和治疗心肌梗死后心衰的治疗。因此，本发明提出了 microRNA-Ι的反义锁核苷酸在制备预防或治疗心肌梗死后心衰药物中的应用。
microRNA-1的反义锁核苷酸在制备诊断缺血性心脏病诱发的心衰的试剂中的应用。通过荧光定量PCR，银染增强的纳米微球技术检测病人外周血液(全血，血浆和血清)中microRNA-1的表达水平，用于对缺血性心脏病诱发心衰的诊断和预防。在本发明的具体实施例中，所述的microRNA-1的反义锁核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。利用本发明的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列制备得到的预防或治疗心肌梗死后心衰的药物，其特征在于有效成分为所述的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列。制备的药物可以只含microRNA-1，也可通过制成一种药物组合物的方式实现，其特征在于包含以上所述的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列及药学上可接受的载体；其中，所述的载体为病毒、胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等，合成HiiR-I并与上述的适当载体连接形成药物，可制成口服制剂或注射制剂等，通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗和预防心肌梗死后心衰的发生。例如将microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列与胆固醇连接制备相应的药物，其制备方法可采用首先化学合成microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列，在其尾端连接胆固醇的常规核酸制剂的方法；例如将microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列与纳米颗粒连接制备相应的药物，其制备方法可采用化学合成microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列，将其与适宜的纳米颗粒混合， 制成连有microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列的纳米颗粒，用于心肌梗死后心衰药物的制备中。为了增加核酸试剂的使用效果，还可辅以专用的稳定剂和特异性免疫增强剂精制而成。一种用于诊断缺血性心脏病诱发的心衰的试剂，其特征在于包含所述的 microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列。


图1为心肌梗死患者血浆miR-1水平与心功的相关性分析；MIH 有心梗病史；AMI 初发急性心肌梗死图2为microRNA-Ι转基因小鼠心脏microRNA-Ι表达水平变化；图3为TG小鼠心电和电镜检测；图4为TG小鼠心脏功能评价；
图5为TG小鼠心脏形态学改变；图6为心肌收缩相关蛋白在miR-lTG小鼠心脏上的表达；图7为LNA对TG小鼠心脏功能的影响及分子机制。
具体实施例方式下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例ImicroRNA-I在心衰中的作用以及microRNA-Ι心脏过表达TG小鼠模型的
4构建实验材料C57B/L6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司1. UmicroRNA-I在心梗患者外周血液水平与心脏功能呈负相关本实验选取49例心肌梗死患者的血样，发现在初发急性心肌梗死患者血中 microRNA-1水平与射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FQ和二尖瓣口舒张早期峰值速度 (E)与舒张晚期峰值速度(A)的比值呈负相关，实验结果如图IA-H所示。1. 2、microRNA_l心脏过表达TG小鼠模型的构建利用real time PCR检测TG小鼠各脏器中microRNA-1的表达量，结果显示与非转基因小鼠(WT)相比，TG小鼠左心室microRNA-1表达升高了 4倍< 0. 05vs. WT) (图2A所示)，而骨骼肌未发生改变(图2B所示。)，说明本发明所构建的转基因小鼠是心脏特异性的转基因小鼠。1. 2. UmicroRNA-ITG小鼠进行心脏功能的评价如图3A所示本发明应用心电监测仪记录了 12只阳性TG小鼠和12只WT小鼠的心电变化，结果显示从出生后4个月开始，所有12只阳性TG小鼠均出现P-R间期和QRS波群的增宽。表明TG小鼠出现传导阻滞。图;3B电镜观察表明心肌组织出现明显闰盘的溶解， Western检测进一步证明与同龄的WT小鼠相比较，影响闰盘组织结构的的关键蛋白Cx43在 TG小鼠心脏表达明显下降。随后本发明采用心脏超生和压力容积环的方法对TG小鼠的心功进行了评价。如图4A-I所示与同龄WT小鼠相比较TG小鼠的心脏功能随年龄的增加而下降。主要表现在 EF%，ESP，士dp/dt，PRSW 禾口 τ 的下降和 EDP、ESV 的下降。1. 2. 2、microRNA-1 TG小鼠心脏形态学评价通过对小鼠正常组、microRNA-lTG小鼠2，4，6个月组的心脏/体重进行比较，发现与同龄WT小鼠比较，6个月TG小鼠表现出心脏/体重的增大(图5A&B)。HE染色观察并未发现心肌细胞的肥大(图5C&D)。电子显微镜观察发现2，4，6个月TG小鼠均表现出明显的肌肉收缩不规则，进一步的定量分析发现TG小鼠肌节长度呈现长短不一的现象(图5E， F&G)。图5E亦显示6各月TG小鼠心肌组织出现明显的坏死样变化。1. 2. 3、microRNA-1 TG小鼠心肌相关蛋白MLC2v和CaM表达下降实验采用Wfestern blot的方法发现microRNA-lTG小鼠心肌收缩相关蛋白MLC2v、 cMyBP-C和CaMKII的磷酸化水平降低(图6A、B、E)。进一步研究发现是由于cMLCK和CaM 表达下降引起的(图6C、D、F和G)。实施例2microRNA-l反义锁核苷酸(LNA)的合成以及LNA对microRNA-lTG小鼠心脏功能和蛋白的影响2. UmicroRNA-I反义锁核苷酸(LNA)的合成采用基因全序列合成的方法合成microRNA-Ι反义锁核苷酸(LNA)序列，所合成的序列如下所示LNA :5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，(SEQ ID NO. 1 所示)。 2.2、LNA-对microRNA-1 TG小鼠心脏功能和蛋白的影响
将LNA用PBS配置成浓度为0. 4mg/ml的液体，采用在体microRNA-Ι反义锁核苷酸序列(LNA)尾静脉注射的方法将所合成的反义锁核苷酸序列注射入TG小鼠体内。尾静脉注射:3mg/kg/次，每隔一周注射一次，共注射3次。在末次注射一周后进行各项指标的检测。结果发现，MiR-I-LNA不仅可以逆转TG小鼠的心脏功能，还能阻止心肌重构的进一步发展(图7A-D所示)。这一结果是由于LNA解除了 miR-1对心肌收缩蛋白cMLCK和CaM的抑制作用(图7E-K所示)。 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.microRNA-1的反义锁核苷酸在制备治疗或预防心肌梗死后心衰药物中的应用。
2.microRNA-1的反义锁核苷酸在制备诊断缺血性心脏病诱发的心衰的试剂中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4.一种用于治疗或预防心肌梗死后心衰的药物组合物，其特征在于有效成分为权利要求1或3所述的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物中还进一步包括药学上接受的载体，所述的载体为病毒、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖或脂质体。
6.如权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物为口服制剂或注射制剂。
7.一种用于诊断缺血性心脏病诱发的心衰的试剂，其特征在于包含权利要求2或3所述的microRNA-Ι的反义锁核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了microRNA-1的反义锁核苷酸在制备预防和治疗心肌梗死后心衰药物中的应用。制备的药物可以只含microRNA-1的反义锁核苷酸序列，也可制成一种药物组合物，其特征在于包含有效剂量的microRNA-1的反义锁核苷酸序列及药学上可接受的载体；其中，所述的载体可为病毒、胆固醇，纳米颗粒，壳聚糖，脂质体等，合成microRNA-1的反义锁核苷酸序列并与上述的适当载体连接形成药物，可制成注射制剂，通过静脉或肌肉注射的方式，用于治疗心肌梗死后心衰的发生。
文档编号A61P9/04GK102416184SQ201110405299
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者吕延杰, 杨宝峰, 艾静 申请人:哈尔滨医科大学