专利名称：一种酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法及应用的制作方法
一种酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法及应用
技术领域：
本发明属于纳米超分子材料技术领域，特别是一种酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法及应用。
背景技术：
刺激响应囊泡因其在化学、生物和材料科学领域有着诸多重要的应用在近些年受到了广泛的关注(A. Mueller, D. F. O ' Brien. Chem. Rev. 2002，102，727-757 ； (2)
D.M. Vriezema, M. C. Aragones，J. A. A. W. Elemans，J. J. L. M. Cornelissen，A. E. Rowan, R. J. M. Nolte. Chem. Rev. 2005，105，1445-1489 ； (3) X. Guo, F. C. Szoka. Acc. Chem. Res. 2003， 36,335-341.)。刺激响应囊泡的药物/基因传递体系由于可以将负载物在特定位点靶向地进行释放而成为其中的一个研究热点，因为这不但可以提高负载物的药效，而且可以降低其毒副作用。目前报道的刺激响应囊泡大多是对外界光、电、热和PH等刺激进行响应的体系(M. Lee, S. -J. Lee, L. -H. Jiang. J. Am. Chem. Soc. 2004，126，12724-12725 ； (2)
C.Wang, Q. Chen, H. Xu, Z. Wang, X. Zhang. Adv. Mater. 2010, 22, 2553-2555 ; (3) A. Napoli， M.Valentini, N.Tirelli, M. Muller, J. A. HubbelI. Nat. Mater. 2004，3，183-189 ； (4)
E.Kim, D. Kim, H. Jung, J. Lee, S. Paul, N. Selvapalam, Y. Yang, N. Lim, C. G. Park, K. Kim. Angew. Chem.，Int. Ed. 2010，49，4405-4408.)，而对于酶信号进行响应的囊泡体系还并不多见(C. Wang, Q. Chen, Z. Wang, X. Zhang. Angew. Chem. Int. Ed. 2010，49，8612-8615.)。酶响应信号不但是生物相容的，而且具有高的选择性，此外许多疾病都与酶的非正常活性有关 (Z. Yang, G. Liang, B. Xu. Acc. Chem. Res. 2008，41，315-326.)，因而设计酶响应囊泡的药物传递体系将负载的药物在特定酶的靶向位点进行释放具有重大的意义和广阔的应用前景。然而，酶响应位点的引入通常需要复杂和耗时的共价键合成，这不但提高了制备成本，而且还会将有机溶剂和毒性试剂在合成过程中引入到囊泡体系从而降低了其生物兼容性。超分子手段是除共价键手段外的另一种构筑刺激响应囊泡的方法(Y.Wang，H. Xu, X. Zhang. Adv. Mater. 2009,21, 2849-2864 ； (2) X. Zhang, C. Wang. Chem. Soc. Rev. 2011,40, 94-101.)。刺激响应位点可以通过非共价键相互作用的方式引入到囊泡体系中来，从而避免了共价键的化学合成。

发明内容本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法及应用，该超分子囊泡系基于磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱二元超分子组装的酶调控囊泡，磺化杯[4]芳烃的存在可以诱导氯化肉豆蘧酰胆碱的临界聚集浓度下降大约100倍；该超分子囊泡是生物相容的且具有很好的稳定性，此外该超分子囊泡对胆碱酯酶具有良好的选择响应性；该超分子囊泡可以负载治疗老年痴呆症的亲水药物他克林 (tacrine)，负载后的他克林可以高选择性并且适量的释放于胆碱酯酶的靶向位点。本发明的技术方案
一种酶调控的纳米超分子囊泡，其构筑单元以磺化杯[4]芳烃(C4AS)为主体，以氯化肉豆蘧酰胆碱(MyCl)为客体，通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体，其构筑过程如图14所示。—种所述酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，将磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入胆碱酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡随时间逐渐解聚即可。所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱的浓度分别为 O. OImmoI /I,和 O. 10mmol /I,η所述胆碱酯酶为丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶在超分子囊泡溶液中的浓度为
O.5U/mL。一种所述酶调控的纳米超分子囊泡的应用，将治疗老年痴呆症的亲水药物他克林负载到超分子囊泡的空腔内。本发明的优点是基于磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱二元超分子组装构筑的纳米超分子囊泡，制备方法简便，主、客体原料用量少；该超分子囊泡生物相容且具有很好的稳定性；该超分子囊泡对胆碱酯酶具有良好的选择响应性；该超分子囊泡可以负载治疗老年痴呆症的亲水药物他克林，负载后的他克林可以高选择性并且适量的释放于胆碱酯酶的靶向位点，其在治疗老年痴呆症药物负载、运输和靶向释放领域具有广阔的应用前景。

图I为磺化杯[4]芳烃存在下氯化肉豆蘧酰胆碱的临界聚集浓度图。图2为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡的动态光散射图。图3为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡的低温透射电子显微镜图像。图4为构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系450nm 波长处透光率随时间变化的曲线图。图5为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡和L02细胞 (人体正常肝细胞)进行孵化后连续记录四天的和空白对照组对比的活细胞数量图。图6为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡和L02细胞 (人体正常肝细胞)进行孵化后连续记录四天的和空白对照组对比的活细胞形态图。图7为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。图8为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶三小时后体系光散射强度的变化图。图9为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶三小时后的高分辨透射电子显微镜图像。图10为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/mL碱性磷酸脂酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。图11为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/mL核酸外切酶I导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。图12为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/mL葡萄糖氧化酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。图13为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶，以及往构筑的负载他克林的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入等量的丁酰胆碱酯酶和去活的丁酰胆碱酯酶后导致体系450 nm 波长处透光率随时间变化的曲线图。图14为该纳米超分子囊泡构筑过程示意图。
具体实施方式实施例一种酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，将C4AS和MyCl溶解于水中并均匀混合即可制得超分子囊泡溶液，所述C4AS和MyCl的浓度分别为O. Olmmol/L和O. lOmmol/L。在没有C4AS存在下MyCl的临界聚集浓度为2. 5mM (M. Wang, X. Gu, G. Zhang,
D.Zhang, D. Zhu. Anal. Chem. 2009,81,4444-4449.);如图 I 所不，横化杯[4]芳经的存在可以诱导氯化肉豆蘧酰胆碱的临界聚集浓度下降约100倍。(I)该超分子囊泡的粒径和形貌分别通过动态光散射和低温透射电子显微镜所表征，图2为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡的动态光散射图；图3为磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡的低温透射电子显微镜图像。图4为构筑的磺化杯芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图，图中显示该超分子囊泡在450nm波长处的透光率随时间不发生变化，表明该超分子囊泡具有很好的稳定性。如图5所示，磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡和L02 细胞(人体正常肝细胞)进行孵化后连续记录四天的活细胞数量和空白对照组对比均无统计学差异。如图6所示，磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱超分子组装的酶响应囊泡和 L02细胞(人体正常肝细胞)进行孵化后连续记录四天的和空白对照组对比的活细胞形态也无明显变化。图5和图6表明该超分子囊泡是生物相容的。(2)该超分子囊泡的丁酰胆碱酯酶高选择响应性的实验验证I)图7为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图，图中表明在超分子囊泡溶液中加入丁酰胆碱酯酶，导致其在450nm波长处透光率随时间逐渐升高，最后可达到96%以上，证明了加入正常生理量的丁酰胆碱酯酶(0.5U/mL)即可使囊泡随时间逐渐完全解聚；图8为往构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶三小时后体系光散射强度的变化图，图中表明加入丁酰胆碱酯酶三小时后体系光散射强度剧烈下降，同样证实了囊泡的解聚。体系加入丁酰胆碱酯酶三小时后的高分辨透射电子显微镜图像，如图9所示，也证实了囊泡的完全解聚。2)对比试验在超分子囊泡溶液中加入碱性磷酸脂酶、核酸外切酶I以及葡萄糖氧化酶，体系在450nm波长处的透光率随时间不发生变化，如图10、图11、图12所示，表明加入其它类型的酶不能像加入胆碱酯酶一样可以使囊泡随时间逐渐解聚。一种上述酶调控的纳米超分子囊泡的应用，将亲水的治疗老年痴呆症的药物他克林负载到制备的超分子囊泡的空腔内，方法如下I)将他克林、C4AS和MyCl溶解于水中后混合均匀得到溶液,将该溶液离心和透析后即可制得他克林负载的超分子囊泡，所述他克林、C4AS和MyCl的浓度分别为50nmol/L，
O.01mmol/L 和 O. 10mmol /I,；2)向构筑的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入丁酰胆碱酯酶，另外向构筑的负载他克林的磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱组装的超分子囊泡体系中加入等量的丁酰胆碱酯酶和去活的丁酰胆碱酯酶后导致体系450nm波长处透光率随时间变化，如图13所示，表明负载后的他克林可以高选择性并且适量的释放于胆碱酯酶的靶向位点。负载他克林的囊泡在没有胆碱酯酶活性的位点不能解聚，说明负载的药物只可在活性胆碱酯酶靶向位点高选择性的进行释放；和未负载药物的囊泡相比，负载他克林的囊泡在胆碱酯酶活性位点解聚的程度大大下降，说明负载的药物可以根据需要适量的释放于活性胆碱酯酶靶向位点，避免了药物的过量使用。
权利要求
1.一种酶调控的纳米超分子囊泡，其特征在于构筑单元以磺化杯[4]芳烃(C4AS)为主体，以氯化肉豆蘧酰胆碱(MyCl)为客体，通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体，其构筑过程如图14所示。
2.一种如权利要求I所述酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于将磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入胆碱酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡随时间逐渐解聚即可。
3.根据权利要求2所述酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蘧酰胆碱的浓度分别为O. Olmmol/L和O. IOmmol/ L0
4.根据权利要求2所述酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于所述胆碱酯酶为丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶在超分子囊泡溶液中的浓度为O. 5U/mL。
5.一种如权利要求I所述酶调控的纳米超分子囊泡的应用，其特征在于将治疗老年痴呆症的亲水药物他克林负载到超分子囊泡的空腔内。
全文摘要
一种酶调控的纳米超分子囊泡，其构筑单元以磺化杯[4]芳烃(C4AS)为主体，以氯化肉豆蔻酰胆碱(MyCl)为客体，通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体；其制备方法将磺化杯[4]芳烃和氯化肉豆蔻酰胆碱溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入胆碱酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡随时间逐渐解聚即可。本发明的优点是该制备方法简便，主、客体原料用量少；该超分子囊泡生物相容且稳定性好，对胆碱酯酶具有良好的选择响应性，可负载治疗老年痴呆症的亲水药物他克林，负载后的他克林可高选择性并且适量的释放于胆碱酯酶的靶向位点，其在治疗老年痴呆症药物负载、运输和靶向释放领域具有广阔的应用前景。
文档编号A61K47/20GK102580100SQ20111043034
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者刘育, 王以轩, 王魁, 郭东升 申请人:南开大学